橡胶树内生沙雷氏菌脂肪酶基因SmLipase1的克隆和表达分析

脂肪酶在洗涤剂、食品、纸浆以及生物柴油等多个工业领域被广泛应用。不同的应用领域对脂肪酶的酶学特性有不同的要求,因此挖掘脂肪酶基因资源具有重要意义。本研究报道从橡胶树内生菌Serratiamarcescens ITBB5-1中克隆得到一个脂肪酶基因,命名为Sm Lipase1,编码662个氨基酸,pI 4.82,能分泌脂肪酶到培养基中。构建重组表达载体pET22b-Sm Lipase-1,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。本研究表明该转基因菌株能高效表达脂肪酶,并在平板培养基上形成较大的透明圈,转基因菌株发酵培养所获得的培养液酶活性达到26 U/mL。此外,该酶还具有催化油脂与甲醇反应生产脂肪酸甲酯的活性,在生物柴油领域具有一定的开发价值。     

耐热α-半乳糖苷酶的高效表达及酶学性质初探

[目的]实现耐热α-半乳糖苷酶在毕赤酵母中的高效表达,并初步研究其酶学性质。[方法]克隆来源于埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)的α-半乳糖苷酶基因TEgal,构建p AO815-TEgal重组表达载体,采用DNS法测定其水解活性及酶学性质;通过薄层层析研究其水解底物谱;并构建TEgal基因多拷贝表达框,实现了该基因的高效表达。[结果]TEgal对棉籽糖水解活性最高9. 5 U/m L,最适温度75℃,最适pH值3. 5; Na~+、K~+对TEgal有促进作用,Mg~(2+)、Co~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)均能抑制酶活,多拷贝重组表达菌株活性最高为22. 4 U/m L。[结论]成功构建耐热α-半乳糖苷酶高效表达菌株,通过提升基因剂量将酶活和蛋白含量提高了135%和356%。     

几种离子液体的微波法合成及其对脂肪酶催化效果的影响

采用微波法合成9种目标离子液体,对中间体[Bmim]Br的合成条件及其离子液体对全细胞催化剂催化效果的影响进行考察.直接将产脂肪酶真菌粗状假丝酵母(Candida valida) T2细胞固定在聚氨酯颗粒中,制备固定化细胞催化剂,将其应用于合成离子液体介质中催化甲醇与大豆油酯交换反应制备生物柴油.结果表明:微波功率200 W下间隙照射100 s,中间体[Bmim]Br的收率达95.16%,有效地提高了离子液合成产率;在[Bmim]PF6离子液中固定化细胞酶催化转酯化反应30 h,大豆油的转化率达42%,反应效果较其他8种合成离子液体好;固定化细胞颗粒和[Bmim]PF6重复使用4次,其油脂转化率和酶活保持率分别达到29%和69%,表现出较好的催化反应稳定性.     

理性设计和基因剂量效应提高米根霉脂肪酶ROL的表达水平

[目的]实现米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶ROL在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的高效表达,为其产业化奠定基础。[方法]通过基因的理性设计提高其在毕赤酵母中的表达水平,再通过构建含串联的ROL基因的表达载体,获得含多拷贝ROL基因的重组菌株,拟通过提高ROL基因在宿主细胞中的基因剂量来进一步提高其表达量。[结果]基因的理性设计和基因剂量有效地提高了ROL基因在毕赤酵母中的表达量。原始ROL基因重组表达菌株活性最高的为260 U/mL。进行密码子优化后,发酵罐条件下,其活性最高的为26 500 U/mL,前后相比较,酶活力提高10倍。[结论]成功获得了脂肪酶ROL高效表达的菌株,完成了在小型发酵罐中的产酶能力评估,为该酶的工业化生产奠定了基础。     

复合脂肪酶协同催化制备生物柴油的研究

【目的】探讨复合酶协同催化体系在含水量较高的体系中催化油脂制备生物柴油的工艺条件。【方法】通过基因工程手段在毕赤酵母中分别高效分泌表达南极假丝酵母脂肪酶(CALB)和米根霉脂肪酶(ROL),构建CALB和ROL复合酶协同催化体系制备生物柴油,利用单因素实验优化工艺条件,以甲酯化得率作为复合酶协同催化体系效能的评价标准。【结果】优化工艺条件为:CALB?ROL最佳复合酶配比为7?3,每克大豆油中加入16 U的复合脂肪酶,甲醇与大豆油摩尔比为4?1,并按0 h时2?1醇油摩尔比,12 h和24 h时以1?1醇油摩尔比分批加入甲醇,含水量为30%-60%之间,40°C反应29-34 h,甲酯得率达到93%。【结论】该复合酶协同催化体系对环境友好,与常规酶法制备生物柴油工艺相比对酶的使用量和催化时间减少幅度都在50%以上,本复合酶协同催化体系能有效降低生物柴油制备成本,具有较好的工业化应用前景。     

酶法合成生物柴油工业化研究进展

介绍了北京化工大学近年来酶法合成生物柴油工业化研究的结果。主要内容包括以下几个方面:高产脂肪酶菌株的选育、脂肪酶发酵工艺优化及放大、脂肪酶固定化方法、酶反应器放大、生物柴油分离精制及副产物甘油综合利用。该脂肪酶假丝酵母Candida sp.99-125在5 m3罐发酵活力不低于8 000 IU/mL,然后将该脂肪酶吸附固定在织物膜上并进行表面改性,用于搅拌罐式反应器生产每吨甲酯的需酶量仅为4.2 kg,产品经分离精制调质后,其各项指标完全符合德国生物柴油生产标准。副产物甘油可用于1,3-丙二醇发酵,30 L发酵罐中1,3-丙二醇的产量可达到76.1 g/L。     

重组大肠杆菌产疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶分批补料发酵工艺

为了获得低成本的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL),在5L发酵罐发酵中对工程菌E.coliBL21(DE3)/pET28b-TLL的分批补料发酵工艺进行研究。结果表明:以葡萄糖为碳源的补料培养基,采用溶氧(DO)反馈补料策略进行补料,当OD600=60时降温至28℃,分2次加入终质量浓度为30g/L乳糖进行诱导表达。优化后TLL的表达量提高到798.5U/L,是优化前的2.4倍。本研究为规模化发酵重组菌生产TLL奠定了基础。     

基于半理性设计提高疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化特异性

甘油二酯(diacylglycerol,DAG)是油脂代谢的中间产物,在人体中具有重要的生理功能,主要通过脂肪酶水解油脂制备。但对1,2-甘油二酯(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)、1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)的检测分离方法及脂肪酶的催化特异性的研究较少,限制了其广泛应用。基于以上问题,本研究首先通过超临界流体色谱与蒸发光散射检测器联用,优化检测分析参数,建立了1,2-DAG(0.025–0.200 g/L)和1,3-DAG(0.025–0.150 g/L)的高效定量检测方法。进一步基于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)与三油酸甘油酯的分子对接,挑选了5个潜在底物结合位点并通过定点饱和突变构建了突变体库,利用超临界流体色谱方法对突变体催化特异性进行筛选。突变文库中I202V表现出最高的1,3-位置选择特异性,较野生型TLL提高了11.7%。本文基于半理性设计方法实现了对TLL位置催化特异性的改造,并建立了一种能够高效分离检测DAG位置异构体的方法,为脂肪酶催化特异性研究提供了参考。     

枯草杆菌脂肪酶基因在大肠杆菌中的诱导分泌表达

借助生物信息学对已克隆的枯草杆菌脂肪酶LipB2全长基因序列进行比对分析。结果显示该脂肪酶基因全长635bp,编码包括31个氨基酸分泌型信号肽在内的211个氨基酸,与NCBIGenBank中已报道的枯草杆菌属脂肪酶核苷酸序列有94.0%的一致性。将该基因克隆到pET-28a(+)表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),利用枯草杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达。SDS-PAGE电泳显示分泌表达的脂肪酶分子质量约为21kD。对表达条件优化后,在30℃、大肠杆菌菌液OD600值为1.8、乳糖诱导浓度为1.5mM、摇瓶发酵10h后大肠杆菌分泌表达26.0U/mL重组脂肪酶,相比较IPTG的诱导,既实现了脂肪酶的高效表达,又节省了成本。     

毕赤酵母组成型表达脂肪酶及其高通量筛选方法

【目的】获得组成型表达脂肪酶毕赤酵母,建立利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因的有效方法。【方法】运用PCR技术从pGAPZαA表达载体上扩增得到GAP启动子片段,插入到表达载体pPIC9K-proRCL中,构建组成型表达载体pGAPK-proRCL。在保留含有同源双交换重组序列的诱导型启动子AOX1序列的基础上,电转化后华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶基因proRCL表达盒在毕赤酵母基因组上发生双交换整合事件,从而组成型表达单拷贝的华根霉脂肪酶基因。【结果】重组菌发酵144 h后,脂肪酶最高酶活为130 U/mL。利用橄榄油罗丹明B平板高通量筛选组成型表达华根霉脂肪酶基因。【结论】该方法将初筛时间从12 d缩短为3 d,排除了多拷贝突变株的干扰,为后续脂肪酶的定向进化及筛选奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的分泌表达

目的:研制高效分泌表达枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的毕赤酵母基因工程菌株。方法与结果:将优化设计的枯草芽孢杆菌MA139β-甘露聚糖酶基因用EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切,克隆到诱导型表达载体pPICzαA中α因子信号肽编码序列的下游,转化大肠杆菌筛选重组质粒,转化毕赤酵母X-33感受态细胞,经Zeocin筛选,获得重组表达菌株X-33/mann。将重组菌株在10L全自动发酵罐中进行高密度发酵培养,甲醇诱导72h发酵活力达到2100U/mL。重组甘露聚糖酶的最适催化温度为40℃,最适催化pH值为6.0。结论:枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中获得了高效分泌表达,具有开发作为饲料添加剂的潜能。     

果胶酶基因剂量效应与水解果胶的工艺研究

[目的]实现烟曲霉果胶酶AFPG基因在毕赤酵母表达并获得高产菌株;阐述果胶酶AFPG的基因剂量效应;探究果胶的水解工艺。[方法]采用PCR技术从烟曲霉扩增AFPG基因并克隆到p AO815载体;用同尾酶构建多拷贝串联表达盒,经线性化的质粒电转到毕赤酵母构建重组工程菌;采用实时荧光定量PCR检测AFPG基因拷贝数;用薄层层析(TLC)技术对果胶的酶解产物进行分析。[结果]SDS PAGE分析表明AFPG基因表达了一个约40 kDa的蛋白;拷贝数为2、3、5的重组子摇瓶发酵,蛋白含量分别为0.24 mg/mL、0.28 mg/mL、0.35 mg/mL;14 L高密度发酵比活为8783 U/mg;该酶最适温度和pH为70℃和5.0;在底物浓度0.7%(W/V),酶量20 U,水解果胶30 min,转化率达到12%。[结论]果胶酶AFPG的表达存在基因剂量效应,5拷贝是2拷贝表达量的1.5倍,可通过构建多拷贝获得高产菌株。果胶酶解效果明显,水解工艺研究为果胶酶的应用奠定基础。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的表面展示及酶学性质

【目的】构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在毕赤酵母GS115中的细胞表面展示体系,筛选展示成功且酶活力及展示率较高的重组子作为全细胞催化剂,并研究其酶学性质。【方法】克隆TLL基因tll,以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白,构建表面展示载体pPICZαA-TLS。重组载体经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母GS115中,经三丁酸甘油酯平板检测及摇甁发酵筛选获得高酶活力的毕赤酵母重组子,采用抗FLAG标签一抗和R-PE荧光素标记的二抗处理细胞后,进行荧光显微镜检测和流式细胞仪分析,并考察全细胞催化剂的最适反应温度和pH、金属离子耐受性等酶学性质。【结果】成功构建TLL毕赤酵母细胞表面展示体系,筛选到1株具有三丁酸甘油酯和橄榄油水解活力的克隆子,经1%的甲醇诱导发酵120 h后,水解橄榄油酶活力达257.8 U/g干细胞。经抗体处理后的重组菌发酵细胞在荧光显微镜下呈现强烈的红色荧光,流式细胞仪分析结果也证实脂肪酶被成功展示在酵母细胞表面,展示率达98.36%。展示的TLL作为全细胞催化剂水解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的最适温度为30℃,最适pH为8.0,且具备良好的热稳定性和有机溶剂耐受性;K+、Ca2+、Mg2+对其有微弱的激活作用,Mn2+、Ni2+则有微弱的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,而EDTA、SDS、Tween 20对酶活力影响不明显。【结论】首次将TLL脂肪酶成功展示在毕赤酵母细胞表面,获得具有较高水解活力和良好酶学特性的全细胞催化剂,为表面展示TLL脂肪酶的规模化应用奠定了技术基础。     

最新专利文摘

CN101402926 产氢细菌补料培养及生物制氢系统的生物强化方法;CN101368193 微藻培养耦合生物柴油炼制的生产方法;CN101392277 一种生物催化氧化丙烯制备环氧丙烷的方法;CN101376818 一种空化效应协同离子液体催化制备生物柴油的方法     

生物法生成可可碱技术

目的:利用含有基因串联表达质粒的大肠杆菌工程菌催化咖啡因制备可可碱。方法:通过分子生物学手段将高活性C1咖啡因脱甲基化酶与葡萄糖脱氢酶串联表达质粒转化大肠杆菌,该脱甲基酶在菌体生长过程中与菌体自身电子传递链相关蛋白偶合,从而赋予菌体脱甲基化功能,结合葡萄糖脱氢酶对辅酶NADH的循环作用,可以高效催化咖啡因1位脱甲基得到可可碱。结果:发酵在线转化,投入咖啡因5 g/L,25 h可可碱产量可达3.01 g/L,转化率大于95%。该催化反应体系无毒性化学试剂污染,转化效率较高。结论:为生物法催化咖啡因生产可可碱路线奠定了前期基础,也为未来生物法制备可可碱技术的工业化研究指明方向。     

脂肪酶催化合成生物柴油的研究

生物柴油是用动植物油脂或长链脂肪酸与甲醇等低碳醇合成的脂肪酸甲酯,是一种替代能源。这里探讨了生物法制备生物柴油的过程,采用脂肪酶酯化和酯交换两条工艺路线进行催化合成。深入研究制备过程中,不同脂肪酶、酶的用量和纯度、有机溶剂、低碳醇的抑制作用、吸水剂的作用、反应时间和进程、底物的特异性和底物摩尔比等参数对酯化过程的影响。试验结果表明,采用最佳酯化反应参数和分批加入甲醇并用硅胶作脱水剂的工艺过程,酯化率可以达到92％,经分离纯化后的产品GC分析的纯度可达98％以上,固定化酶的使用半衰期可达到360h。同时对酯交换制备生物柴油过程中,甲醇的用量和甲醇的加入方式对脂肪酶催化过程的影响作了初步研究,优化后的酯交换率可达到83％。     

共表达伴侣蛋白对重组毕赤酵母产米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶发酵过程的影响

[目的]通过共表达伴侣蛋白Erolp和PDI获得米根霉(Rhizopus oryzae)脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达.[方法]利用毕赤酵母基因重组菌高密度发酵的方法,在7L发酵罐水平上分析共表达伴侣蛋白菌株(BH128)与非共表达伴侣蛋白菌株(H238)对脂肪酶表达的差异.[结果]在相同条件下,BH128发酵产酶能力高于H238,最高酶活可达到2 338.7U/mL,最大比生长速率达到0.02 h-1,最大产物比形成速率达到944.5 U/(gDCW·h),最大底物比消耗速率也能达到0.15 gmethanol/(gDCW·h),分别是H238的1.7、0.5、4.1和1.3倍,且发酵周期缩短了20h.[结论]毕赤酵母基因重组菌BH128通过共表达伴侣蛋白Ero1p和PDI,提高了米根霉脂肪酶的产量,而且缩短了发酵周期,为工业化生产奠定了基础.     

解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆与表达

[目的]实现解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,建立有效的透析复性方法,获得有活性的重组淀粉酶。[方法]以解淀粉芽孢杆菌DSM 7基因组DNA为模板,PCR扩增获得无信号肽的α-淀粉酶结构基因,克隆至p ET-22b(+),转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况,采用透析法进行包涵体复性并检测酶活。[结果]成功表达重组蛋白,相对分子量约为54.8k Da,成功复性包涵体,复性效率为22.78%,重组α-淀粉酶酶活力为102.4 U/m L。[结论]实现了解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的高效表达,包涵体经透析法成功复性,获得具有催化活性的重组淀粉酶。     

优化Bacillus subtilis对异源β-1,4-内切木聚糖酶分泌表达的研究

[目的] 基于信号肽和信号肽酶在分泌系统中的重要作用,探索短小芽孢杆菌来源中性β-1,4-内切木聚糖酶在Bacillus subtilis中的重组分泌表达与优化。[方法] 首先,从短小芽孢杆菌基因组DNA中扩增β-1,4-内切木聚糖酶全长基因,连接到pWB980载体P₄₃启动子下游,转化B.subtilis WB800构建重组菌NZ-X。之后,构建信号肽筛选载体,对23个从B.subtilis 168基因组DNA中扩增得到的信号肽进行筛选。最后,以B.subtilis WB800的xynA基因为整合位点,分别整合过表达SipS和SipT两个主要信号肽酶,考察其对融合不同信号肽异源蛋白分泌的影响。[结果] 重组菌NZ-X成功实现β-1,4-内切木聚糖酶的分泌表达,摇瓶发酵上清液酶活为5.33 U/mL,信号肽筛选结果发现YlaE、YfhK、EglS、YqxI、YpjP信号肽与β-1,4-内切木聚糖酶契合度较高,对应酶活依次为7.15、6.69、6.36、6.32、6.18 U/mL,其中SipS信号肽酶对融合YfhK信号肽的β-1,4-内切木聚糖酶的分泌促进作用最大,摇瓶发酵上清液酶活提高到10.64 U/mL,为NZ-X的1.99倍。[结论] 信号肽优化与信号肽酶过表达联用可有效提高B.subtilis中异源蛋白的分泌表达量。     

脂解麻疯树油脂肪酶产生菌的筛选鉴定及其催化特性

[目的]分离筛选具有脂解麻疯树油能力的脂肪酶产生菌株,为以麻疯树油为原料酶法生产生物柴油奠定基础.[方法]以麻疯树油为唯一碳源,从麻疯树种子粉末处理过的土壤中分离筛选出1株具有脂解疯树油能力的脂肪酶产生菌,考察该菌株及其脂肪酶对有机溶剂耐受性以及脂肪酶催化酯化和转酯反应的能力,并通过生理生化特征和16S rDNA序列分...