树鼩CD3ε全长编码序列的克隆及分子特征分析

树鼩可作为人类疾病的良好模型,但缺乏对其免疫功能研究的基本标志和单克隆抗体。该研究应用RT-PCR技术,分别从3只树鼩的肝脏、脾脏和血液中克隆了CD3ε全长编码序列并用Discovery Studio等软件对其分子特征进行了分析。结果显示,树鼩CD3εcDNA的开放阅读框全长582bp,编码193个氨基酸。树鼩与其他哺乳动物的CD3ε蛋白整体结构近似,与人和恒河猴CD3ε的亲缘关系较近,胞内域与跨膜域高度保守,但胞外域出现2个潜在的糖基化位点,表面电荷亦存在差异。该研究为今后制备树鼩CD3单克隆抗体及功能研究奠定初步的基础。     

树鼩CD4全长编码序列的克隆及分子特征分析

树鼩作为多种人类疾病研究模型的可能性已受到广泛关注,但尚缺乏研究其免疫功能的基本标志以及单克隆抗体。该实验首先以树鼩外周血总RNA为材料,通过RT-PCR扩增得到长度为1365bp的树鼩CD4全长编码序列,并确定了数据库中缺失的两个片段,进而通过ClustalW等软件对其序列和分子特征进行分析,发现树鼩CD4氨基酸序列胞外和胞内域保守性较好,且与人类和猴的亲缘关系较近。虽然树鼩和人CD4分子表面大部分区域均带正电荷,但与人CD4胞外域D1相比,树鼩CD4D1结构区域表面带负电荷较多,且多出两个N-糖基化位点。这些差异对抗体的结合可能存在影响。该研究为今后树鼩CD4单克隆抗体制备及功能研究奠定了基础。     

树鼩主动脉内皮细胞株的建立及其生物学特性的研究

将树鼩胸主动脉分层剥离,用组织块贴壁法,体外培养出主动脉内皮细胞,历经一年,传至23代,命名为TSaec-8910。倒置显微镜下细胞单层生长,呈铺路石样镶嵌排列,第Ⅷ因子相关抗原阳性,透射电镜观察,细胞质内未找到Weibel-Palade小体。细胞生长曲线及分裂指数示9～12d汇合成单层,按1:2或1:3传代,传代间隔为lO～14d,细胞冻存复苏后接种存活率为31.5％,细胞染色体检查为二倍体细胞,2n=62,雄性。内皮细胞生长因子、上皮细胞生长因子、条件培养基和附着底物对TSaec-8910细胞有明显影响,细胞在玻璃瓶壁上贴壁时间为24～18h,而在涂有鼠尾胶瓶壁则为4h左右,内皮细胞生长因子、上皮细胞生长因子能促进TSaec-8910细胞贴壁和增殖,20％TSaec-8910细胞条件培养基亦能良好地维持细胞形态。     

CD3ε和PMA对fas基因转录调控作用的研究

研究了ＣＤ３ε和ＰＭＡ对细胞凋亡基因ｆａｓ的转录调控作用．根据已知的人ｆａｓ基因５＇上游序列设计引物,用ＰＣＲ法从人胸腺细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ｆａｓ５＇上游长为４４６ｂｐ的启动子片段．将此片段定向克隆到以虫荧光素酶为报告基因的真核细胞表达载体ｐＸＰ２中．经限制性内切酶酶切鉴定及序列测定分析表明此重组表达质粒ＤＮＡ的结构和序列正确．用此质粒（ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ）瞬时转染人ＪｕｒｋａｔＴ淋巴细胞,分析报告基因的表达水平．结果表明ｆａｓ基因上游－５０６到－６０的区域有弱启动子活性,约是阴性对照的１．５倍．抗ＣＤ３ε抗体和ＰＭＡ处理均可增强ｆａｓ启动子的活性,促进报告基因的表达,其虫荧光素酶活性分别是未经处理的ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ转染细胞的１．７倍和３．３倍,但二者没有协同作用．ＰＫＣ的抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ和ＰＴＫ的抑制剂ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎＡ可抑制ＰＭＡ诱导的ｆａｓ基因转录,使虫荧光素酶基因的表达降至未用ＰＭＡ处理的水平．但ＰＴＫ的另一种抑制剂ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ可与ＰＭＡ发挥协同作用,上调ｆａｓ基因的转录,使虫荧光素酶活性增加到５倍．这些结果为阐明ＣＤ３ε及ＰＭＡ介导Ｔ淋巴细胞激活和凋亡的分子机制     

树鼩在医学生物学中的应用

目的树鼩是一种新型实验动物,由于它的许多分子与细胞结构近似于人类,已成功建立了多种人类病毒感染的动物模型,并在神经生物学、生殖生物学、免疫学和社会心理学等方面有相当广泛和深入的应用和研究。     

抗CD3/CD28单克隆抗体联合PHA对T淋巴细胞活化和增殖的影响

目的探讨抗人CD3/CD28单克隆抗体联合植物血凝素(PHA)对人外周血T淋巴细胞活化增殖的影响。方法通过Ficoll密度梯度离心法分离健康成人外周血单核细胞后,用CD3免疫磁珠分选T淋巴细胞,抗CD3/CD28单抗、PHA及重组人白介素-2(recombinant human IL-2, rhIL-2)刺激T淋巴细胞。用CCK-8试剂盒(CCK-8 cell counting kit)检测细胞增殖情况, ELISA测定细胞上清液干扰素γ(interferon-γ, IFN-γ)的含量。结果 CCK-8结果显示在增殖3 d时,CD3/CD28+PHA组A_(450 nm)值与PHA组、IL-2组与空白组比较,差异有统计学意义(P<0.05);比较各组在6、9、12 d的增殖情况,CD3/CD28+PHA组的A_(450 nm)值与其他各组差异均有统计学意义(P<0.05)。刺激3 d各组分泌的IFN-γ质量浓度是最高的。刺激9 d时,CD3/CD28+PHA组、CD3/CD28组、PHA组上清液中IFN-γ浓度分别为(235.27±27.80)、(189.23±24.79)和(124.66±3.39)pg/mL,CD3/CD28+PHA组上清液中IFN-γ的质量浓度高于其余2组(P<0.05)。结论抗CD3/CD28单抗联合PHA比单用抗CD3/CD28单抗、PHA或rhIL-2能更好地激活T细胞及持久地促使T细胞增殖。     

抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

建立能稳定分泌特异性抗重组人表皮生长因子(rhEGF)单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,制备出高效价的 ,具有生物学活性的抗重组人表皮生长因子单克隆抗体 ,为EGF及其单克隆抗体在肿瘤生长调节中的作用研究 ,为肿瘤的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。此外 ,为EGF的亲和层析纯化提供材料。以BALB/c小鼠脾细胞为饲养细胞 ,运用细胞杂交瘤技术制备 ,间接ELISA法筛选出能稳定分泌针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株 ;对杂交瘤细胞进行染色体核型分析并以体内诱生法产生腹水以获得大量单克隆抗体 ,并采用HiTrapProteinAHP柱对其纯化…     

金黄色葡萄球菌肠毒素C3单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备稳定分泌抗金黄色葡萄球菌肠毒素C3（SEC3）单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的性质进行鉴定。方法以SEC3重组蛋白免疫Balb／c小鼠,应用细胞融合技术将小鼠的脾细胞与sR／0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA法检测筛选及2次有限稀释法克隆化培养,获得目的杂交瘤细胞株,并对其所产生的单克隆抗体进行效价、亲和常数及抗原识别表位等相关性质的鉴定。结果最终获得了两株能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞1C12和2A2,两者细胞培养上清的效价分别为1：3200和1：1600。经分析可知1C12细胞株的亲和力高于2A2细胞株,同时相加实验表明两个单克隆抗体识别抗原表位相同。结论单克隆抗体制备成功,为进一步完善肠毒素SEC3的临床检测奠定了基础。     

树鼩脐带间充质干细胞与抗小鼠、人CD抗体的交叉反应性

目的观察树鼩的细胞是否与抗鼠或抗人的CD抗体反应。方法采树鼩外周血与小鼠的CD3、CD4、CD8抗体反应。再分离培养树鼩的脐带间充质干细胞,分别与抗小鼠的CD29-FITC、Sca-1-PE、CD90-PE反应,与抗人的CD44-FITC、CD29-FITC、CD13-FITC、CD34-FITC反应。结果树鼩外周血与小鼠的CD3、CD4、CD8抗体不发生反应,但树鼩的脐带间充质干细胞与抗小鼠的CD29-FITC抗体发生反应,阳性率为99.8﹪。树鼩的脐带间充质干细胞与抗人的CD44-FITC抗体发生反应,阳性率为99.7﹪。结论树鼩的外周血与小鼠的CD抗体不反应,但树鼩的脐带间充质干细胞与小鼠的CD29-FITC抗体和人的CD44-FITC抗体反应效果较好。     

树鼩呼肠孤病毒的分离鉴定

致病性病毒严重危害树鼩(treeshrew,Tupaia)生命健康,但却鲜见有关树鼩自然感染病毒的报道。该研究采集6份因腹泻死亡的野生树鼩粪便,用Vero细胞进行病毒分离,72h后细胞发生病变,特征为颗粒增多、破碎、变圆固缩、拉网及脱落等;电镜观察显示该病毒为球形,双层衣壳,完整直径~75nm。纯化病毒经核酸PAGE电泳后呈现10个核酸节段,并为典型的3:3:4排列。哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian orthoreovirus,MRV)L1基因保守区RT-PCR检测、序列分析及进化树构建结果表明,该病毒株属于MRV,且与来源于蝙蝠的呼肠孤病毒分离株(T3/Bat/Germany/342/08)同源性最高。MRV是人兽共患病病毒,该实验首次从树鼩体内成功分离到MRV,对今后研究制定实验树鼩病毒学控制标准具有指导意义,同时为有效预防该病毒在树鼩与人类之间传播提供了实验依据。     

树鼩实验室繁殖及育幼的探讨

探讨实验室内树鼩的人工繁殖和育幼情况。结果显示在16个月的观察期内,35只雌性、2 0只雄性成年树共产仔14 7窝4 0 4只,平均每只母树年产仔3 2窝、8 7只,平均每次妊娠的合笼天数为6 8±32天。在非繁殖高峰期给雄、雌性树鼩用激素可使合笼时间缩短至6 1±14天,用药有效率为6 1. 5 %。仔树出生后经被动母乳联合人工配方乳喂养的成活率达92. 2 %。表明在实验室条件下,非繁殖期使用激素类药物能提高成年树鼩的受孕率;被动母乳联合人工配方乳喂养仔树的方法简单易行。     

树鼩的生物化学参考值

树鼩科分类地位的争论和我国树鼩的分类至今尚无定论(Lyon,1913;Osgood,1932;Allen,1938;Ellerman等,1951;Hill,1953;Napier等,1967;Walker,1968;Corbet等,1980;Luckett,1980;Honacki等,1982;Ronald等,1983)。自Sim-pson(1945)和Le Gros Clark(1959)将树鼩归入灵长目,特别是本世纪六十年代以来,对树鼩的血液学、血清学和免疫学研究报道较多。     

自发性树鼩乳腺肿瘤的特性(英文)

乳腺癌是严重危害女性健康的常见恶性肿瘤,建立合适的乳腺癌动物模型对于研究人类乳腺癌的生物学机制及发展新的防治方法至关重要。相对于常用的啮齿类动物,树鼩(Tupaia belangeri chinensis,tree shrew)因在进化层次上更接近于人类而可用于建立更适合的乳腺癌模型。该文详细了介绍一例树鼩自发性乳头状良性乳腺肿瘤。免疫组化结果显示该例肿瘤孕激素受体阳性且Ki-67阳性细胞比例显著增加;而活化的Caspase3阳性细胞比例较低;且肿瘤的形态和病理与人导管内乳头状肿瘤非常接近。提示利用树鼩建立乳腺肿瘤模型的可行性。     

树鼩IgG纯化鉴定及其多克隆抗体制备和检测

目的:比较两种抗体纯化方法在分离纯化树鼩IgG抗体的应用,制备抗IgG的多克隆抗体及检测。方法:采用两种商品化IgG抗体纯化试剂盒分离树鼩血清IgG抗体,采用SDS-PAGE和蛋白定量测定提纯IgG。以树鼩IgG作为抗原,与等量弗氏完全佐剂(第一次)、弗氏不完全佐剂(第二次)混合皮下注射免疫兔,对分离血清进行多克隆抗体纯化及Western Blot检测及定量分析。结果:两种方法均能有效分离纯化树鼩IgG,在经过Montage PROSEP-A试剂纯化后的IgG在纯度和含量方面均优于Protein A/G Matrix试剂。通过纯化后的树鼩IgG免疫兔制备的抗IgG抗体能有效识别树鼩IgG。结论:纯化的树鼩IgG具有良好免疫原性,由此制备的抗体具有高度特异性。研究结果为利用树鼩作为实验动物提供了必要的实验基础。     

治疗用武汉抗CD3单克隆抗体(WuT_3)的致突变性研究

观察了武汉抗ＣＤ３单克隆抗体（简称ＷｕＴ３）对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００及ＴＡ１０２菌株的回复突变作用。结果显示在５～５０００μｇ／皿的剂量范围内,ＷｕＴ３所致的诱发回复突变菌落数与自发回复突变菌落数之比ＭＲ（Ｒｔ／Ｒｃ）,无论加大鼠肝匀浆,辅酶Ⅱ及葡萄糖６－磷酸（Ｓ－９混合液）或不加Ｓ－９混合液,均不超过２。同时观察了ＷｕＴ３对小鼠骨髓细胞微核率及对人外周血淋巴细胞染色体畸变率的影响,结果显示小白鼠ｉｖＷｕＴ３,每日一次,连续２日,在２５～１００ｍｇ·ｋｇ－１范围内,ＷｕＴ３各剂量组的微核细胞率与溶剂对照组相比均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。而环磷酰胺（ＣＰ）阳性组与溶剂对照组相比有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。ＷｕＴ３在２５～２５０μｇ／瓶的剂量范围内,各剂量组的染色体畸变细胞率与溶剂对照组相比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）,而ＣＰ组与溶剂对照组相比有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。三项试验结果均未发现ＷｕＴ３有致突变性作用     

邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定

采用碳化二亚胺法,将邻氯青霉素（cloxacillin）与牛血清白蛋白偶联制备免疫原,免疫BALB/c小鼠,经杂交瘤技术获得了一株能稳定分泌抗邻氯青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H8-B1-F4。间接ELISA方法测定,抗体亚类为IgG1,其细胞上清抗体效价为1：1000,腹水效价为1：4×105。与其结构类似物苯唑青霉素、双氯青霉素的交叉反应率为21.3％和19.6％,和氨苄青霉素、羟氨苄青霉素和苄青霉素无交叉反应。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测邻氯青霉素的 ELISA试剂盒奠定基础。     

阿尔茨海默病树鼩模型建立的探索

目的探索建立树鼩阿尔茨海默病(AD)动物模型的可行性。方法将30只成年雄性树鼩Tupaia belangeri随机分成3组,模型组腹腔注射D-半乳糖(D-gal)造成急性衰老后,对树鼩双侧海马内一次性注射β淀粉样蛋白1~42片段(Aβ1~42)和鹅膏蕈氨酸(IBO)的混合液,对照(生理盐水)组将所有药物替换为等剂量生理盐水,空白组不做处理。用Morris水迷宫对3组树鼩进行行为学测试,用苏木精-伊红染色法和镀银染色法进行病理检测分析。结果 Morris水迷宫测试结果提示,模型树鼩出现了明显的学习记忆功能障碍。病理检测结果显示,模型组脑海马区出现明显胶质细胞增生和神经纤维缠结。对照组和空白组无明显病理改变。结论腹腔注射D-gal,双侧海马注射Aβ1~42和IBO混合液的方法可以造成树鼩学习记忆能力下降,并出现神经胶质细胞增生和神经纤维缠结,是一种可行的树鼩AD模型造模方法。     

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的 建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株,为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法 利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞,利用差速消化法纯化内皮细胞,然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果 采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞,纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致,到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示：细胞生长旺盛,第2～4天时处于对数生长期,第4天进入平台期。细胞核型结果显示：染色体数与树鼩染色体相同,即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论 成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能,为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。     

抗登革病毒2型E蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

为了制备可用于胶体金快速检测试纸条的抗登革病毒2型（DEN2）E蛋白单克隆抗体（mAb）,通过基因克隆获得E基因与质粒pET32a（＋）的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPGT诱导表达重组蛋白。以DEN2重组E蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DEN2E蛋白的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类。结果表明获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞（7C7）,其抗体亚类为IgG1。Western blot显示该株mAb能特异识别重组pET32a-DEN2E蛋白。因此,成功制备出抗DEN2E的1株mAb,为建立快速特异橙测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。