重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定

纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用,能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用RACE方法从海蚯蚓消化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列,构建该基因原核表达载体,并进一步构建工程菌表达融合蛋白,经Ni2+树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并成功构建重组表达载体p ET-21a-AFE,表达纯化出融合蛋白,该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶原而溶解纤维蛋白。总之,本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性,为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。     

重组海蚯蚓纤溶酶的克隆、表达及活性鉴定北大核心CSCD

纤溶酶在溶栓治疗中起重要作用,能够溶解血凝块的主要成分纤维蛋白。采用RACE方法从海蚯蚓消化道组织中扩增出海蚯蚓纤溶酶编码序列,构建该基因原核表达载体,并进一步构建工程菌表达融合蛋白,经Ni2+树脂柱纯化后通过平板法检测该融合蛋白纤维蛋白酶原激活活性。结果获得海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并成功构建重组表达载体p ET-21a-AFE,表达纯化出融合蛋白,该融合蛋白能够激活纤维蛋白酶原而溶解纤维蛋白。总之,本研究获得了海蚯蚓纤溶酶的c DNA序列和氨基酸序列,并初步证明其具有纤维蛋白酶原激活活性,为临床新型溶栓药物的开发提供实验基础。     

金钗石斛过氧化物酶基因的克隆及原核表达

为了获得金钗石斛(Dendrobium nobile)过氧化物酶基因(命名为DnPOD)编码序列,分析该基因的分子特征,掌握该基因原核表达数据,本研究采用同源克隆的方法,以金钗石斛cDNA为模板,设计基因特异性引物克隆DnPOD基因,分析了DnPOD基因结构,将重组质粒pET28α-DnPOD在BL21 (DE3)菌株...     

核盘菌角质酶的克隆、表达及活性分析

角质酶可降解脂肪族或芳香族聚酯,对聚对苯二甲酸乙二醇酯也具有较好的降解作用,但目前市面上角质酶产品非常稀缺,因此寻求一种高效表达的角质酶用于工程酶的开发非常有必要.本研究从核盘菌中克隆得到8个角质酶基因,利用PCR结合RT-PCR技术筛选出主效基因SsCut-52,利用大肠杆菌Escherichia coli BL21...     

重组蛋氨酸裂解酶的表达、复性及活性研究

探索以包涵体形式表达的重组蛋氨酸裂解酶的纯化、复性方法,并对其活性进行检测。将阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶重组表达载体PET-15b-mgl1转化大肠杆菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,并对表达条件进行优化,获得大量表达。通过对包涵体的纯化及复性研究,检测重组蛋氨酸裂解酶的免疫活性及酶活性。Western blotting结果表明,重组蛋氨酸裂解酶免疫小鼠制备的多抗可以和从阴道毛滴虫中提取的天然蛋氨酸裂解酶发生特异性反应。活性检测结果显示复性蛋氨酸裂解酶有活性,复性效率达到25%左右。以包涵体形式表达的蛋氨酸裂解酶经变性、纯化及复性后,获得大量有活性的酶,为深入了解其结构、功能及酶学性质,开展其在临床检测中的应用研究奠定基础。     

香菇转录本Unigene 10627过氧化物酶结构域的克隆表达及抗氧化活性研究

目的分析香菇C91-3转录本Unigene 10627基因的结构域,并对其进行诱导表达,初步探讨所得目的蛋白的抗氧化活性。方法将香菇C91-3菌丝体中总RNA提取出来,通过反转录获得cDNA文库,根据反转录结果,通过3′-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends),5′-RACE技术扩增获取基因全长。通过生物信息学方法预测基因的结构域,利用PCR技术扩增该目的片段,将扩增产物连接到原核表达载体pET32a(+)上,采用热转化法转至E.coli Rosetta-gami(DE3)中进行诱导表达,对目的蛋白进行分离、纯化及鉴定。采用二苯代苦味酰自由基(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)法检测蛋白的抗氧化活性。结果成功获得基因全长,预测结果表明该基因具有染料脱色过氧化物酶结构域(DyP_Perox),双酶切结果证实目的片段成功插入,并通过诱导表达获得目的蛋白。结论目的蛋白成功表达,且具有抗氧化活性,为进一步研究其生物学活性提供基础。     

重组人GIP衍生物的克隆、表达、纯化及活性研究

葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)具有促胰岛素分泌的作用,但因体内半衰期短而限制了其应用。对二肽酶4(dipeptidase IV,DPP IV)识别位点等氨基酸进行改造可有效延长其半衰期。通过人工合成基因或PCR定点突变的方法合成GIP不同突变体基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET32a(+)中进行诱导表达,通过亲和层析,纯化获得各对应的多肽。经肠激酶酶切后,分别在昆明鼠及糖尿病模型鼠体内研究其生物活性。结果显示突变体mGIP243在昆明鼠体内具有显著的降血糖活性,当给药剂量为48nmol/kg时,其体内降血糖活性可延长至90分钟,相对于将第二位上的丙氨酸突变成丝氨酸的mGIP2和天然GIP半衰期显著延长。GIP类似物mGIP243在2型糖尿病模型鼠中也有降血糖活性,使其可能成为治疗糖尿病的候选药物。     

人髓过氧化物酶基因cDNA克隆及急性白血病髓过氧化物酶基因的表达

应用PCR技术和DNA重组技术从HL－60细胞中克隆人髓过氧化物酶(MPO)轻链和部分重链基因cDNA片段,经核酸序列分析确证克隆片段全长769bpc将克隆的MP0 cDNA片段作为探钎,对一组白血病细胞系和急性白血病病例样本细胞的mRNA进行N0rthern印迹和点印迹分析,结果显示,MPO基因表达产物与急性白血病的粒细胞源性相关,因而它可作为白血病分型中确定细胞源性的重要标志。     

霍乱弧菌CTB基因的克隆、表达及重组蛋白活性分析

霍乱弧菌CTB蛋白具有免疫佐剂活性。本研究根据已发表CTB基因的序列设计一对引物,从一株霍乱弧菌中扩增出CTB基因,测序后发现该基因全长375 bp,与国内分离的六株CTB基因的同源性达96.0%～99.2%。将该基因与pTWIN1连接构建了原核表达载体pTWIN1-CTB,重组表达载体转化BL21（DE3）表达菌株,0.8 mmol/L IPTG诱导4 h后,收获的细菌总蛋白SDS-PAGE电泳显示CTB在原核表达系统中得到表达,融合蛋白大小与理论值符合,蛋白产量占细菌总蛋白的20%左右,主要以包涵体形式存在,western杂交和GM1-ELISA结果表明重组蛋白具有免疫原性和粘膜佐剂活性。     

鲢鱼、鳙鱼、草鱼谷胱甘肽过氧化物酶cDNA的克隆及肝组织表达

利用RT-PCR技术分别从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)、鳙鱼(Aristichthys nobilis)及草食性鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝组织扩增出谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)cDNA核心序列。序列分析表明鲢鱼、鳙鱼、草鱼GPX的cDNA序列均为263bp,编码87个氨基酸。鲢鱼、鳙鱼、草鱼与斑马鱼(Danio rerio)(同属鲤科)、条石鲷(Oplegnathus fasciatus)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(鲈形目)等鱼类GPX氨基酸序列同源性很高,为75%～93%;与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、猪(Sus scrofa)、牛(Bos taurus)等哺乳动物GPX氨基酸序列的同源性也较高,为76%～79%。以β-肌动蛋白为内参照,比较鲢鱼、鳙鱼、草鱼肝组织GPX cDNA的表达水平,鲢鱼、鳙鱼肝组织GPX的表达量远高于草鱼肝的GPX表达量,这与鲢鱼、鳙鱼大量摄入微囊藻毒素在鱼体内引发产生过量的脂过氧化物相适应。     

谷子幼苗对土壤铅、铬的生长响应及吸收积累的差异性

采用盆栽土培试验,研究了谷子幼苗对土壤中不同含量铅（Pb）、铬（Cr）的生长响应和吸收积累的差异性。结果表明,在所试浓度（50～800 mg·kg^-1）范围内,Pb、Cr在谷子幼苗地上部和地下部的积累量存在较大差异,幼苗重金属的吸收富集和转运系数均为Pb大于Cr、Pb、Cr胁迫对幼苗生物量的影响表现为低浓度的促进和高浓度的抑制作用,但Cr对生物量的影响比Pb更强。相同处理条件下,幼苗茎叶中可溶性蛋白质、DNA含量和增色效应对Pb、Cr的响应也有明显差别,Cr对幼苗的生理毒性和DNA损伤效应的作用强度大于Pb。     

谷子CPP基因家族鉴定及外源硒响应分析

【目的】探究谷子CPP家族成员基本特征及其在外源硒处理下的响应模式,为谷子富硒高叶酸新品种选育提供新的遗传材料。【方法】借助生物信息学工具鉴定谷子CPP家族成员,采用qRT-PCR技术对CPP基因在不同组织及外源硒处理下的表达水平进行检测,为揭示谷子CPP家族生物学功能及外源硒响应机制奠定基础。【结果】(1)谷子基因组中包含9个CPP基因,定位于6条染色体上,依照基因在染色体的排布命名为SiCPP1～SiCPP9,氨基酸数目在220～899之间,相对分子量为23624.32～97253.16Da,等电点介于6.64～9.17之间,内含子数目为3～11个不等,亚细胞预测显示该家族所有成员均能在细胞核定位到,蛋白质二级结构预测表明该家族中占比最大的是α-螺旋其次是无规则卷曲。(2)系统进化分析表明,谷子CPP蛋白可分为4个亚家族,相同亚家族之间保守基序和结构域的数目及分布相似。(3)启动子分析发现谷子CPP家族中存在大量光、生长发育、激素以及胁迫响应元件。(4)荧光定量结果显示,谷子CPP家族成员在根、茎、叶和穗中差异表达。谷子CPP家族9个成员均对外源硒存在响应,其中SiCPP5、SiCPP6、SiCPP7和SiCPP8响应程度最强。【结论】谷子CPP家族成员具有组织表达特异性且对外源硒存在不同程度响应。     

中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子, 参与机体多种免疫反应, 在溶菌过程中形成一个水解体系, 破坏和消除侵入体内的病原, 从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因), 该基因全长709 bp, 其完整的阅读框为477 bp, 编码158个氨基酸, 前18个氨基酸(-1~-18)为信号肽, 成熟肽由140个氨基酸组成(1-140aa), 其分子量为16.2 kD。经SMART分析,该基因具有1个溶菌酶1(LYZ1)结构域(19-130aa)。半定量RT-PCR分析结果表明溶菌酶虽在多种组织中有较低水平的组成性表达, 但在细菌诱导的血细胞、心脏、肝胰腺和鳃等多种组织中表达上调。将中国明对虾溶菌酶基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-30a (+)中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 再进行诱导表达和亲和纯化, 得到了纯化的重组溶菌酶, 并进行了抑菌活性检测。结果表明, 重组对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强, 最小抑菌浓度达到3.43 mmol/L, 但对革兰氏阴性菌抑制作用较小。上述结果表明, 该溶菌酶作为一种重要的免疫效应分子, 参与了对虾的免疫防御反应。     

中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子, 参与机体多种免疫反应, 在溶菌过程中形成一个水解体系, 破坏和消除侵入体内的病原, 从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因), 该基因全长709 bp, 其完整的阅读框为477 bp, 编码158个氨基酸, 前18个氨基酸(-1~-18)为信号肽, 成熟肽由140个氨基酸组成(1-140aa), 其分子量为16.2 kD。经SMART分析,该基因具有1个溶菌酶1(LYZ1)结构域(19-130aa)。半定量RT-PCR分析结果表明溶菌酶虽在多种组织中有较低水平的组成性表达, 但在细菌诱导的血细胞、心脏、肝胰腺和鳃等多种组织中表达上调。将中国明对虾溶菌酶基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-30a (+)中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 再进行诱导表达和亲和纯化, 得到了纯化的重组溶菌酶, 并进行了抑菌活性检测。结果表明, 重组对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强, 最小抑菌浓度达到3.43 mmol/L, 但对革兰氏阴性菌抑制作用较小。上述结果表明, 该溶菌酶作为一种重要的免疫效应分子, 参与了对虾的免疫防御反应。     

人MGMT基因Cdna的克隆表达及表达蛋白修复功能的鉴定

克隆了Hela细胞O6 甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶 (MGMT)基因的cDNA序列 ,该序列与国外发表的cDNA完全一致。将此cDNA插入原核表达载体pET 2 1a后转化大肠杆菌BL2 1(DE3)获得表达的重组菌株pET 2 1a MGMT E .coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导后产生分子量为 2 4kD的蛋白质。烷化类诱变剂致死突变实验表明 ,MGMT蛋白的表达能修复受体菌DNA分子因烷化类诱变剂导致的突变。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体基因的克隆、表达与生物活性鉴定

目的：研究重组人组织型纤溶酶原激剂突变体(reteplase,r-PA)基因的克隆和表达,并对表达产物进行活性鉴定。方法：通过PCR的方法从t-PA基因上扩增得到r-PA基因的编码序列,并克隆到pUC19载体中,经DNA测序正确后,将该基因克隆到含有,T7启动子的高效表达质粒pJZ-100中,转化E．coli BL21(DE3),得到含有r-PA基因的工程菌。工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况。提取包涵体,经过体外稀释法复性,亲和色谱层析纯化,测定产物的活性。结果：表达的重组蛋白约占可溶性总蛋白的20％,复性并纯化后测定活性为58000IU/mg。结论：成功构建了重组r-PA的表达质粒,表达产物具有良好的生物活性。     

金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因克隆、表达及活性试验

利用PCR从金黄色葡萄球菌标准株（Staphylococcus aureus, ATCC13565）中克隆了金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)的基因,序列测定结果与报道完全一致。构建了表达载体pETSEA并获得高效表达,重组蛋白（rSEA）在37℃诱导时以包涵体形式存在,降低温度则出现可溶表达,可溶性rSEA占总rSEA的55%。可溶性rSEA经Ni²⁺亲和层析纯化,达电泳纯。通过同源模建对rSEA对SEA进行结构比较,结果表明尽管rSEA比野生型SEA多了9个氨基酸但其结构并没有明显的变化。单核细胞增殖试验进一步证明了该结论：将rSEA与SEA同外周血单个核细胞共同培养,两者均能有效地促进其增殖。将rSEA与体内激活的脾细胞共培养,则能增强脾细胞的体外抑瘤活性。     

木质素过氧化物酶基因（LipH8）的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以黄孢原毛平革菌 (Phanerochaetechrysosporium)RNA为模板 ,克隆LipH8基因片段 ,研究LipH8基因在甲醇毕赤酵母中的表达。构建了甲醇酵母表达质粒pMETA_LipH8载体 ,并将其线性化后用电穿孔法导入PichiamethabolicaPMAD16 ,部分阳性克隆的PCR结果表明LipH8基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上 ,经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母工程菌株。胞外木质素过氧化物酶活力达 932U L。     

非洲菊4个POD基因的克隆及表达分析

以‘玲珑’非洲菊为材料,利用RT PCR技术克隆获得4个POD基因,分别命名为GjPOD4、GjPOD5、GjPOD7和GjPOD42（GenBank登录号分别为MH708528、MH708531、MH708529和MH708530）。对这4个基因进行生物信息学分析,并分析在SA、干旱、低温胁迫和非洲菊根腐病病原菌胁迫下4个POD基因的表达模式以及POD活性的变化特征,为揭示非洲菊POD基因的功能以及抗性育种奠定基础。结果显示：（1）所克隆的4个POD基因的cDNA长度为966~1 005 bp,编码321~334个氨基酸;生物信息学分析发现,它们编码的蛋白均属于植物亚铁红素依赖Ⅲ型POD,含有保守结构域及Motif,含有信号肽、跨膜螺旋结构和磷酸化位点。（2）进化树分析结果表明,GjPOD4和GjPOD7与拟南芥AtPRX52、GjPOD5与AtPRX47、GjPOD42与AtPRX42亲缘关系较近。（3）SA、干旱、低温胁迫和非洲菊根腐病病原菌处理均可显著或极显著影响4个基因的表达以及POD活性,但GjPOD4与其他3个GjPOD基因的表达趋势存在一定的差异。（4）相关性分析显示,在不同器官中,GjPOD42的表达与POD活性均呈显著正相关关系（P<0.05）;在隐地疫霉处理下, 4个POD基因表达均极显著上调且与POD活性呈正相关关系。研究表明,所克隆的 4个POD基因在非洲菊抗逆防御过程中,尤其是在响应隐地疫霉侵染过程中发挥着重要作用,但GjPOD4与其他3个GjPOD存在一定的功能差异。     

毛白杨细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因的克隆及表达分析

利用同源克隆技术得到1个毛白杨细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因,命名为PcAPX。该基因编码249个氨基酸残基,预测分子量为33.01kD。采用原核表达技术在大肠杆菌中表达并纯化该蛋白并进行酶活性分析,结果表明:重组PcAPX蛋白对抗坏血酸(AsA)和过氧化氢(H2O2)有很高的活性,其对抗坏血酸的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)分别为(0.71±0.03)mmol·L-1和(0.41±0.02)mmol·L-1·min-1·mg-1;对过氧化氢的Km和Vmax分别为(0.60±0.21)mmol·L-1和(0.35±0.12)mmol·L-1·min-1·mg-1,表明PcAPX对AsA和H2O2拥有较高的催化底物的能力和催化效率。利用实时定量RT-PCR分析毛白杨PcAPX基因的表达模式,结果表明其在老叶中表达量高于新叶、韧皮部、形成层和根部。该研究结果将进一步促进毛白杨APX基因家族成员参与植物生长调控的研究。