水稻RAPD反应体系的正交优化

以焦旱1号总DNA为材料,首先对影响RAPD-PCR反应的模板DNA、Mg~(2+)、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶浓度等因素进行了初步优化,分析了各因素对RAPD-PCR扩增结果的影响.在此基础上对影响RAPD-PCR反应的Mg~(2+)、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶浓度等4个主要因素进行正交优化,研究结果表明:在25 μl RAPD-PCR反应体系中,模板DNA 20 ng;Mg~(2+)浓度1.5mmol/L;dNTP的浓度0.2mmol/L;引物量15 pmol;Taq DNA聚合酶1.0 U.在此最佳条件下,利用引物B8对18个北方粳稻品种进行了成功的扩增.     

罗汉果SRAP反应体系的建立与优化

建立适合罗汉果的SRAP-PCR扩增体系,为罗汉果的遗传图谱构建及基因定位奠定基础。实验对罗汉果SRAP-PCR反应体系的影响因素(引物,dNTP,Taq酶,Mg~(2+),模板DNA)在多个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了罗汉果SRAP-PCR反应的最佳体系(10μL):引物0.6μmol/L、dNTP0.25 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、Mg~(2+)2.0 mmol/L和模板DNA 30 ng。该体系的建立能很好的满足罗汉果基因组DNA的扩增要求,SRAP标记应用于罗汉果遗传研究是可行的。     

观赏桃ISSR-PCR反应体系的优化

采用改良CTAB法从观赏桃满天红叶片中提取基因组DNA,通过单因素实验探讨了模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs和Taq DNA酶等条件对观赏桃ISSR-PCR扩增结果的影响,建立了ISSR-PCR扩增的最佳体系:2.5μl反应体系中包含10×Buffer 2.5μl,模板DNA 40ng,Mg~(2+)浓度2.5mmol/L,引物浓度04 μmol/L,dNTPs浓度0.4mmol/L,Taq DNA酶0.5U.利用所建立的体系对红叶桃、菊花桃和春艳等13份材料进行检验,其结果表明优化后的体系适合观赏桃的ISSR-PCR反应.     

塔里木盆地荒漠区柽柳属植物总DNA提取及RAPD体系优化

本研究以干旱荒漠盐生植物柽柳的幼嫩叶片为实验材料,探究摸索其总DNA的提取方法与RAPD-PCR的反应体系及扩增条件。结果表明,改良CTAB-高盐沉淀法较好地提取出了柽柳植物的总DNA,其产量、质量均有明显提高,比较适合于多数柽柳属植物的DNA提取;同时,通过单因素试验比较优化筛选出了适合于柽柳植物RAPD分析的最佳的PCR反应体系与扩增条件,其25μL的反应体系中包含有Mg2+=2.5 mmol/L、d NTPs=0.25 mmol/L、引物=0.30μmol/L、Taq DNA聚合酶=1.5 U、模板DNA=200 ng;其最适扩增条件为95℃预变性4 min,94℃变性30 s、36℃退火40 s、72℃延伸1 min、40个循环;最终在72℃下延伸10 min,4℃下保存;另外,通过6条多态性引物的扩增效果证实该优化体系比较稳定,扩增条件比较合适,能够满足多数柽柳植物分子多态性的检测要求。     

珍珠黄杨ITS-PCR体系的建立与优化

本研究利用改良CTAB法从珍珠黄杨叶片中提取基因组DNA作为模板,在TaqDNA聚合酶量不变的基础上,利用正交设计L_9(3~4)对4个因素(模板DNA、Mg~(2+)、dNTP和引物)在3个水平上对珍珠黄杨ITS-PCR反应体系进行优化.实验结果表明,在总体积50μL的反应体系中,建立了最佳ITS-PCR扩增条件:Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L、引物浓度0.3 μmol/L、dNTP浓度0.3 mmol/L、DNA模板浓度240 ng/50μL、ToqDNA聚合酶的用量1.75 U/50μL和退火温度56℃,该优化体系保证了珍珠黄杨ITS-PCR产物的纯度和质量要求.珍珠黄杨ITS片段克隆测序后获得的序列长度为642 bp,其系统学信息将为珍珠黄杨的起源进化提供有力的分子水平证据.     

Pfu DNA聚合酶的表达条件优化及纯化研究

Pfu DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的高保真DNA聚合酶之一。本研究对重组菌株的Pfu酶基因表达条件进行优化,以提高Pfu DNA聚合酶的表达效率。通过在菌液深度OD600=0.87时加入1.5 mmol/L的IPTG进行诱导培养,诱导培养时间为11.03 h,用酶溶法对重组菌株进行破胞提取粗酶液,经热变性法与盐析沉淀法对杂酶进行纯化,最后经过透析后得到纯酶。采用考马斯亮蓝G-250法对酶进行含量测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,最后使用PCR反应检测提纯后的Pfu酶的活性。结果表明优化处理后制备的Pfu DNA聚合酶,其纯度、酶活性和酶特异性均达到市售的Pfu DNA聚合酶水平。本研究为Pfu DNA聚合酶的开发和利用奠定了基础。     

正交设计优化狗牙根SSR-PCR反应体系

为了对狗牙根进行SSR-PCR分子标记分析,本研究对狗牙根的SSR-PCR反应体系进行了优化,利用L16(45)正交设计对狗牙根SSR-PCR反应体系中的Taq酶、Mg~(2+)、dNTPs和引物4个因素的多个水平进行了筛选,PCR结果用SAS进行方差分析,并利用筛选出的最优体系对退火温度进行了筛选。结果表明:(1)Taq酶、Mg~(2+)和引物3个因素对狗牙根SSR-PCR扩增结果有极显著影响,影响程度为Taq酶Mg~(2+)引物,而d NTPs对扩增结果影响不显著;(2)筛选出了20μL的狗牙根SSR-PCR最优反应体系为0.5 U Taq酶、2 mmol/L Mg~(2+)、0.4μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs、30~60 ng模板DNA;(3)退火温度50~62℃对本试验所选引物的SSR-PCR扩增结果影响不大,本研究选用55℃作为退火温度。     

酥瓜(Cucumis melo var. conomon Group)基因组DNA提取及RAPD分子标记反应体系的建立

本研究以改良的CTAB法提取酥瓜基因组DNA,利用正交设计L_(16)(4~5),对酥瓜RAPD-PCR反应体系的5个影响因素(引物,dNTPs,Taq DNA聚合酶,Mg~(2+)和模板DNA)在4个水平上进行优化试验,并在30~50℃范围内摸索退火温度,建立适合酥瓜RAPD-PCR反应体系。研究表明,在25μL反应体系中,含有引物0.8μmol/L、dNTPs 0.3μmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、Mg~(2+)0.5 mmol/L、DNA模板30 ng为最佳反应体系,RAPD-PCR扩增程序中最佳退火温度为37.6℃。该体系有助于酥瓜种质资源的遗传多样性分析评价。     

油梨基因组DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

旨在建立稳定可靠的油梨(Persea americana Mill)叶片DNA的提取方法和SSR-PCR反应体系及筛选出稳定的油梨SSR多态性引物,为开展油梨种质SSR分子标记提供遗传研究的基础。以油梨叶片为试材,比较3种油梨叶片DNA提取方法 ;利用L16(45)正交实验设计对油梨SSR-PCR反应体系进行优化;利用优化的反应体系筛选引物;同时,选取5对多态性引物对45份油梨种质进行PCR扩增,进一步检测该优化体系的稳定性。结果表明,常规2×CTAB法、改良2×CTAB法和植物DNA提取试剂盒法等3种DNA提取方法中,改良2×CTAB法对油梨基因组DNA的提取效果最佳;获得最优反应体系为:20μL总反应体系中,含约40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg~(2+)、0.15 mmol/L d NTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5μmol/L引物;以此体系为基础进行引物筛选,从73对油梨SSR引物中筛选出了30对扩增条带清晰的多态性引物,说明该反应体系可用于油梨SSR标记的进一步研究;稳定性检测获得的谱带清晰,表明该优化反应体系是稳定可靠的。由此可见,改良的2×CTAB法可用于油梨叶片DNA的大量样本提取,优化后的SSR-PCR反应体系及筛选出的30对多态性引物可用于油梨SSR标记的进一步研究。     

Pfu DNA聚合酶的制备过程及其条件优化

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可以方便、快捷、准确地大量复制目的基因片段,是分子生物学研究中不可或缺的技术手段。在PCR反应中,DNA聚合酶起着关键作用。Pfu酶(Pfu DNA polymerase)是DNA聚合酶的一种,具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性,可在聚合酶链式反应中纠正错误掺入的碱基,可以快速、高保真地扩增DNA片段,在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。本研究建立了一套Pfu聚合酶表达与纯化的详尽方案,该方案利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)作为诱导剂,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达Pfu酶,然后利用Ni-NTA柱层析纯化制备。研究中对IPTG诱导时间、细胞破碎条件、缓冲液类型及其p H、粗酶液热处理温度与时间、洗脱液中最佳咪唑浓度等重要条件和参数分别进行了优化确定。实验结果表明,使用该方案可以成功制备高产量高纯度的Pfu聚合酶,完全满足常规PCR反应的要求。本研究建立的实验方法和技术参数,十分适用于研究者小规模自主制备Pfu酶,对于有大量分子克隆要求的课题组,利用该方案自主制备Pfu酶能够显著节省科研成本。     

龙眼SCoT-PCR反应体系的优化

目标起始密码子多态(start condon tardeted polymorphism,SCoT)分子标记结合了ISSR标记和RAPD标记的优点,具有操作简单、成本低廉、多态性丰富、重复性好、引物设计简单且通用性良好等诸多优点.本实验以石硖龙眼的新鲜叶片为试材,采用单因素试验的方法分别研究模版、引物、rTaqDNA聚合酶、dNTPs、缓冲液(Mg~(2+))及退火温度共6因素各8个水平对龙眼SCoT-PCR扩增结果的影响.结果表明:龙眼SCoT标记的20μL优化反应体系为:10×Buffer Ⅱ(含Mg~(2+))2.0μL、DNA模板30 ng、引物浓度为30 μmol/L、rTaqDNA聚合酶用量为0.45 U、dNTP浓度为4.0 mmol/L.适宜的扩增程序为:94℃预变性4 min;95℃变性50 s,49.5℃退火40 s,72℃复性2 min,36个循环;最后72℃延伸10 min.利用24个龙眼品种验证该反应体系,1.5%琼脂糖电泳检测结果显示,扩增产物在400～2 200 bp之间,不同品种间DNA谱带具有多态性,反应体系具有良好的稳定性和可重复性.     

3-甾酮-Δ1-脱氢酶突变体文库高通量筛选方法的建立

[目的]建立一种快速、高通量筛选3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体库的方法。[方法]基于已发表KstD蛋白晶体结构,设计饱和突变引物,构建突变体文库,优化蛋白表达条件,利用冻融法结合溶菌酶法获得粗酶液;基于分光光度法原理,优化检测反应体系,利用酶标仪检测吸光度的变化来反映酶活力。[结果]利用饱和突变引物成功构建突变体文库,表达KstD最佳条件为：IPTG终浓度0.3 mmol/L,20℃诱导20 h;缓冲液中溶菌酶浓度为0.5 mg/mL时上清目的蛋白含量最高。优化后的酶活检测条件为：Tris-HCl缓冲液50 mmol/L、pH 8.0、0.4 mmol/L DCPIP、1.5 mmol/L PMS、0.7 mmol/L雄烯二酮(4AD)和适量的酶液组成,温度30℃、酶反应时间5 min,于600 nm波长下测定。[结论]成功建立了一种5 min检测96个3-甾酮-Δ¹-脱氢酶(KstD)突变体的高通量筛选方法,重复性变异系数在3%以下。     

银杏ISSR-PCR扩增反应体系的建立与优化

目的:为了对银杏进行分子鉴定和遗传关系的分析,建立银杏ISSR-PCR的最佳扩增反应体系。方法:采用正交设计和单因素梯度实验,对影响ISSR-PCR反应体系的5个主要因素(Mg2+、dNTP、引物、模板DNA及Taq DNA聚合酶)进行筛选及优化。结果:银杏25μL ISSR最佳扩增反应体系包含10×Taq反应缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2、0.45 mmol/L dNTP、1.2μmol/L引物(UBC861)、10 ng模板DNA及0.9 U Taq DNA聚合酶,使用此ISSR扩增反应体系,获得了10株不同性别银杏DNA的清晰条带,验证了该体系的稳定性。结论:优化的反应体系为采用ISSR分子标记技术对银杏进行遗传多样性分析、遗传育种和转基因等研究奠定了一定的理论基础。     

正交设计优化绿竹ISSR-PCR体系和引物筛选

旨在建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并筛选适于绿竹ISSR-PCR分析的高多态性引物。以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用正交试验方法,对d NTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA用量设计5因素4水平试验,采用极差分析法和方差分析法对试验结果进行分析。并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序。并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,d NTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为1.5 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA浓度为60 ng,10×PCR Buffer体积为2μL、剩下用灭菌ddH_2O补全。各因素影响大小依次是:Mg~(2+)d NTPs模板DNATaq DNA聚合酶引物。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次,72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

药用植物草珊瑚RAPD扩增条件优化

采用CTAB-DNA提取方法,从草珊瑚植物的嫩叶中提取总DNA。以此DNA为模板,优化了草珊瑚RAPD-PCR的反应条件。结果表明,PCR扩增体系最适宜的条件为:反应体积25μL,内含2.5mmol/L Mg2+、1.0UDNA聚合酶、0.4μmol/L引物、60ng模板DNA和0.16mmol/L dNTP。扩增程序为:94℃预变性2min;94℃变性30s,37℃复性30s,72℃延伸80s,40个循环;72℃延伸10min;4℃保存10min。     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

濒危植物七子花RAPD条件的优化

以改进SDS法抽提濒危植物七子花嫩叶总DNA,进行随机扩增多态DNA（RAPD）分析,分别测试了镁离子, dNTP,模板DNA含量,引物和DNA聚合酶量对反应结果的影响,通过各因子的组合研究,可知七子花RAPD分析较适宜的扩增条件是：15 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液（10 mmol/L Tris·HCl pH 9.0, 50 mmol/L KCl, 0.1% Triton X_100）,2.5 mmol/L MgCl2,2U Taq酶（上海华美公司）,10 ng模板DNA,20 pmol引物（上海Sangon公司）;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.1 mmol/L。     

猪轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为了建立一种适用于猪轮状病毒(PoRV)的逆转录-环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)的快速、灵敏检测方法。依据GenBank上登录的PoRV VP7基因保守序列,设计了6条特异性引物,通过对外引物与内引物浓度比、Bst DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度和反应条件等进行优化。结果显示,当外引物与内引物浓度比为200nmol/L∶2 400nmol/L(1∶12)、Bst DNA聚合酶浓度为0.64 U/μL、Mg2+浓度为2.5 mmol/L、dNTP浓度为1.0mmol/L,在恒温(60℃)条件下作用60min,扩增效果出现明显"梯状"条带,同时对建立的RT-LAMP检测方法进行特异性和敏感性验证,其只有PoRV获得特异性扩增条带,与其他猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒等无交叉反应,具有良好的特异性,最低检测分子拷贝数为1.0×102拷贝/μL,具有极高的敏感性。反应结束后肉眼可见阳性扩增产物出现白色沉淀,加入SYBR GreenⅠ观察颜色变化可以判定结果。该方法适用于野外、基层部门和海关快速检测PoRV的新方法,在临床上有良好的推广意义。     

散斑壳属真菌RAPD-PCR反应条件的优化

以分离自四川省二郎山林场云南松上的松针散斑壳菌(Lophodermium pinastri)为材料,提取其总基因组DNA做为RAPD-PCR体系优化的模板。研究了dNTPs、Mg~(2+)、DNA模板、Taq酶、引物等组分对RAPD反应结果的影响,并建立了最佳反应体系:25μL PCR反应体积,10×Taq酶缓冲液2．5μL,1．5 U Taq酶,20 ng DNA模板,0．4 mmol/L dNTPs,4．0 mmol/L Mg~(2+),0．48μmol/L引物,10．2μL ddH_2O。