β-1,3-葡甘露聚糖酶辅助提取圆红冬孢酵母油脂

为考察β-1,3-葡甘露聚糖酶辅助提取圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides油脂工艺的应用潜力,以R. toruloides Y4发酵醪液为原料,乙酸乙酯为溶剂,在10 L规模下研究了酶解和萃取条件对油脂提取率的影响,并进行了初步物料平衡分析。结果表明：酶处理0.5 h,油脂提取率可达71.1%,酶解效率与10 mL小体系所取得的结果相当。通过多次萃取,有效缓解了乳化现象对油脂提取的影响。经过3次萃取,油脂提取率、溶剂回收率和总物料回收率分别达92.9%、87.0%和94.2%。酶辅助提取油脂工艺可直接利用油脂发酵醪液,提取率高,对设备要求低,具有很好的工业化应用潜力。     

圆红冬孢酵母菌发酵产油脂培养基及发酵条件的优化研究

采用均匀设计和单因子试验法,系统考察了圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)在不同碳氮比条件下产油发酵情况以及添加无机盐对产油发酵的影响,通过均匀设计软件对二次多项回归方程求解及单因素分析得知在培养基组成分别为葡萄糖70g/L,硫酸铵0.1g/L,酵母粉0.75g/L,磷酸二氢钾0.4g/L,七水硫酸镁1.5g/L,初始pH6.0,在灭菌(121℃15min)后添加ZnSO41.91×10-6mmol/L、CaCl21.50mmol/L、MnCl21.22×10-4mmol/L、CuSO41.00×10-4mmol/L。发酵摇瓶装液量为250mL三角瓶装培养基50mL,接种量为10%(种龄28h)。在上述条件下,30℃振荡(200r/min)培养120h,所得菌体油脂含量高达76.1%,脂肪得率系数可达22.7。     

恒化培养稀释率和碳氮比对圆红冬孢酵母油脂积累的影响

采用恒化培养的方法,考察了稀释率(D)和碳氮比(mol/mol)对圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides AS 2.138 9积累油脂的影响。结果表明:稀释率增大,油脂含量和油脂得率降低。在D=0.02 h 1时油脂得率最大,为0.18 g油/g糖;D=0.14 h 1时油脂生成速率最大,为0.09 g/(L.h)。碳氮比增大,油脂含量略有增加。在C/N=92时油脂得率最大,为0.12 g油/g糖;C/N=32时油脂生成速率最大,为0.13 g/(L.h)。碳氮比对油脂的脂肪酸组成影响不明显,油脂的棕榈酸、硬脂酸和油酸总含量超过85%。     

不同营养元素限制对圆红冬胞酵母油脂生产的影响

以产油酵母圆红冬胞酵母（Rhodosporidium toruloides）作为研究对象,系统地研究了氮、磷、硫限制对其油脂积累的影响,并在3L生物反应器上考察了R.toruloides在C/P摩尔比为1 133.3时初始葡萄糖浓度对油脂生产的影响。结果表明：氮、磷、硫中任意一种营养元素受限,均能促使R.toruloides在胞内积累高于自身干重60%的油脂;通过改变培养基的组成,可以调节油脂中脂肪酸的构成,使油脂中饱和脂肪酸比例高于70%或不饱和脂肪酸比例高于60%。就油脂生产强度及转化效率而言,磷限制优于氮限制或硫限制。当C/P摩尔比相同时,初始葡萄糖浓度越低越有利于油脂生产。对采用不同原料生产微生物油脂的技术有一定指导意义。     

圆红冬孢酵母两阶段培养法生产微生物油脂

为缩短发酵时间,减少原料消耗,采用细胞增殖和油脂积累分离的两阶段模式,培养圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389生产微生物油脂。结果表明,细胞增殖阶段获得的R.toruloides AS 2.1389细胞,重悬接种在葡萄糖溶液中,可快速积累油脂,菌体油脂含量超过自身干重的55%。增殖阶段细胞的菌龄越高,产油能力越强。油脂积累阶段使用高浓度葡萄糖溶液或未灭菌的葡萄糖溶液,油脂合成可以有效进行。油脂中脂肪酸成分以含16和18个碳原子的长链脂肪酸为主,可作为制备生物柴油的新型原料。     

发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)发酵产油脂的研究

通过摇瓶发酵,考察了碳源浓度、氮源种类和浓度对发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans)发酵产油脂的影响,对发酵产油脂条件的初步优化结果为:在葡萄糖100 g/L、蛋白胨1.8 g/L、初始pH 7.0的培养基中,以10%的接种量,于33℃、190 r/min的摇床上发酵120 h,可得菌体生物量为18.2 g/L,干细胞的油脂含量为68.5%。     

圆红冬孢酵母基因编辑及天然产物合成的研究进展

圆红冬孢酵母(Rhodotorula toruloides)是一种能够天然合成多种类胡萝卜素和油脂的非模式酵母。该菌能够利用各种廉价原料,耐受甚至同化利用多种有毒木质纤维素水解副产物。目前,该酵母被广泛用于微生物油脂、萜烯类化合物、各种高价值酶、糖醇和聚酮化合物的生产研究。鉴于其广阔的工业应用前景,研究人员对其开展了多维度的理论和技术的探索,包括基因组、转录组、蛋白组、遗传操作平台等。本文着重阐述近年来圆红冬孢酵母的代谢工程和天然产物合成的研究进展,并展望其细胞工厂构建中面临的挑战和可能的应对决策。     

皮状丝孢酵母B3利用木薯淀粉发酵生产微生物油脂

对皮状丝孢酵母B3以木薯淀粉水解液为碳源发酵生产微生物油脂培养条件进行了优化,并在2 L发酵罐中对菌体生长和油脂积累进行了考察。摇瓶实验表明,木薯淀粉水解液的浓度高于90 g/L时不利于菌体的生长和油脂积累,皮状丝孢酵母B3发酵生产微生物油脂的最适氮源及其浓度、最适C/N比和pH分别为酵母提取物3.0 g/L、116、6.0,在此条件下培养144 h菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别达到15.2 g/L、6.22 g/L和40.9％;在2 L发酵罐中分批发酵44 h后菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别达28.7 g/L、12.27 g/L和42.8％。以皮状丝孢酵母B3所产油脂制备生物柴油,其主要组成包括棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯等,且理化特性符合相关国家标准,可作为一种有潜力的化石燃料替代品。     

圆红冬孢酵母磷酸盐饥饿诱导表达载体的构建

摘要:【目的】建立一种适用于圆红冬孢酵母代谢工程的磷酸盐饥饿诱导表达系统。【方法】对圆红冬孢酵母pho89基因5'侧翼序列进行生物信息学分析,设计相应引物,PCR扩增pho89基因启动子(pPHO89)和hsp70基因终止子(tHSP),利用RF克隆方法置换出发载体上的pPGK组成型启动子和tNOS终止子,以潮霉素磷酸转移酶基因hyg为报告基因,得到响应磷酸盐饥饿诱导的单表达盒载体pZPK-pPHO89-hyg-tHSP,利用ATMT方法转化圆红冬孢酵母,通过转化子潮霉素抗性表型鉴定pPHO89和tHSP的启动子和终止子活 性。在此基础上,构建了适合外源基因表达的双表达盒诱导表达载体pZPK-HYG-pPHO89-MCS-tHSP,并利用该载体构建了苹果酸酶重组表达菌株。【结果】成功构建了响应磷酸盐饥饿的圆红冬孢酵母诱导性表达载体,该载体在圆红冬孢酵母中可表现出启动子和终止子活性。【结论】该启动子受磷酸盐浓度的严谨调节,响应度高,操作简单,无需额外诱导剂,经济便捷,为后续圆红冬孢酵母代谢工程研究提供了基本材料。     

圆红冬孢酵母自主复制序列分离和利用游离型质粒进行基因敲除

【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。     

Corecovery of lipids and fermentable sugars from Rhodosporidium toruloides using ionic liquid cosolvents: Application of recycle to batch fermentation

This work evaluates the ability of an ionic liquid‐methanol cosolvent system to extract lipids and recycle fermentable sugars recovered from oil‐bearing Rhodosporidium toruloides grown in batch culture on defined media using glucose and xylose as carbon sources. Growth on the recycled mixed carbon substrate was successful with glucose consumed before xylose and overall cell mass to lipid yields (Y_P/X) between 57% and 61% (w/w relative to whole dried cell mass) achieved. Enzymatic hydrolysis of the delipified carbohydrate fraction recovered approximately 9%–11% (w/w) of the whole dried cell mass as fermentable sugars, which were successfully recycled as carbon sources without further purification. In total, up to 70% (w/w) of the whole dried cell mass was recovered as lipids and fermentable sugars and the substrate to lipid yields (Y_P/S) was increased from 0.12 to 0.16 g lipid/g carbohydrate consumed, highlighting the promise of this approach to process lipid bearing cell biomass. © 2014 American Institute of Chemical Engineers Biotechnol. Prog., 30:1239–1242, 2014     

镉诱导的菊芋幼苗膜脂过氧化和抗氧化酶活性及过氧化物酶同工酶的改变

用含有不同浓度(0~400μmol/L)Cd(NO3)2的Hoagland营养液处理砂培的菊芋。处理50d后,测定植物体内镉积累量以及过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性,并对POD同工酶进行电泳分析。发现在Cd50~100μmol/L浓度内,随着镉浓度的升高,菊芋根和叶中镉的积累量显著增加,而随后积累量的增加有所减少。根和叶中MDA含量显著上升,说明镉引起了膜脂过氧化。0~100μmol/LCd处理,根和叶中POD活性随Cd浓度增加而增强,而在200~400μmol/LCd处理下有所减弱。根和叶SOD活性在50~200μmol/LCd处理下随Cd浓度增加而增强,而在400μmol/LCd处理下SOD活性明显受到抑制。根和叶CAT活性随Cd浓度升高而增强。电泳结果显示,POD同工酶变化明显,镉诱导出一条新酶带LP10。菊芋POD同工酶可以作为镉污染的土壤的生物指示剂。     

圆红冬孢酵母利用生物乙醇废水-木薯粉水解液发酵产油

【目的】获得能够高效降解生物乙醇废水化学需氧量(COD)的圆红冬孢酵母菌株,评估废水初始COD浓度对驯化菌株生长的影响,将木薯粉生产微生物油脂和高浓度有机废水降解过程整合,以生物乙醇废水为水源制备生物乙醇废水-木薯粉水解液培养基,明确产油效率高、生物乙醇废水COD降解率高的初始还原糖浓度。【方法】采用在高浓度的生物乙醇废水中进行多次驯化的方法,获得能够适应废水环境的圆红冬孢酵母菌株;采用双酶水解法对加入乙醇废水中的木薯粉进行水解;采用重量法监测生物量浓度变化,采用酸热法提取油脂,重铬酸钾法监测COD,DNS法测定废水还原糖浓度,凯氏定氮法测定总氮,钼酸铵比色法测定总磷。【结果】通过驯化筛选得到一株能耐受高浓度生物乙醇废水的优势菌株Rhodosporidium toruloides D5。以未稀释的废水为培养基,驯化菌株的最终生物量浓度和COD降解率分别为3.8 g/L和75.0%。采用生物乙醇废水-木薯粉水解液发酵时,控制初始还原糖浓度低于30 g/L时,生物量浓度和油脂浓度随初始还原糖浓度的升高而升高,均在120 h时达到最高COD降解率,初始还原糖浓度对达到的最大COD降解率无明显影响,废水N、P去除率分别达到99%和92%以上。【结论】在未经稀释的高浓度生物乙醇废水中可获得较高的生物量浓度;采用高浓度生物乙醇废水-木薯粉水解液培养基发酵产油,初始还原糖浓度为30 g/L,可在保证高油脂产量的同时,实现废水COD的高效降解,有效回收利用废水中残余的N、P源,从而降低微生物油脂生产和废水处理成本,研究结果可为开发廉价微生物油脂生产技术提供有用的参考。     

Recycling biodiesel-derived glycerol by the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 through the two-stage lipid production process

Direct utilization of crude glycerol, a major byproduct in biodiesel industry, becomes imperative, because its production has outpaced the demand recently. We demonstrated that the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 had a great capacity to convert glycerol into lipids with high yield using the two-stage production process. Significantly higher cell mass and lipid yield were observed when the media were made with synthetic crude glycerol than pure glycerol. The process achieved a lipid yield of 0.22 g g⁻¹ glycerol, which was comparable with the lipid yield using glucose as the substrate. Lipid samples showed similar fatty acid compositional profiles to those of vegetable oils, suggesting that such microbial lipids were potential feedstock for biodiesel production. Our data provided an attractive route to integrate biodiesel production with microbial lipid technology for better resource efficiency and economical viability.     

Solubilization of Jerusalem artichoke tuber chromatin by 2,4-dichlorophenoxyacetic acid

Chromatin from the tuber of the Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus) was solubilized in 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) solution (100 mM) at pH 7.0. This solubilization was much affected by the pH; below 6.0 less chromatin was solubilized. The elution pattern of the products on gel filtration with Sepharose 4B showed that the solubilization was caused by the dissociation of the DNA and associated proteins. The pattern of polyacrylamide gel electrophoresis of histones extracted from the chromatin solubilized by 2,4-D was quite different from those of histones extracted from the original chromatin or from NaCl (2.0M) solubilized chromatin. The F1 and F3 fractions seemed to be little affected by 2,4-D, but the F2a1, F2a2 and F2b fractions were greatly decreased. In addition, the ratios of histones and non-histone proteins to DNA changed considerably in 2,4-D solubilized chromatin in an inverse manner. None of these changes were observed with NaCl. which suggests that the behaviour of 2,4-D for the solubilization of chromatin differs substantially from that of NaCl.