人PSP94的分泌表达及其表达产物抗前列腺癌作用

将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 .     

PSP94融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗前列腺癌活性分析

在从成年人正常前列腺组织中获得人９４个氨基酸的前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）ｃＤＮＡ基础上,利用ＰＬ表达系统,实现了人ＰＳＰ９４成熟肽Ｎ－末端带有１９个列源氨基酸的融合蛋白在大肠杆菌中的表达。目的蛋白在细胞中主要以包涵体形式存在。表达量约占菌体总蛋白的３０％,分子量约为１６．５ｋＤ。表达产物在人前列腺癌细胞ＰＣ－３上活性分析表明,该融合蛋白能明显抑制前列腺癌细胞的生长。     

PSP94-TNFαD11a融合基因在NIH3T3细胞中的表达及其产物活性分析

 为了分析 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的表达和表达产物的生物学活性 ,将含该融合基因的质粒 pc DNA- PSP94- TNFα D1 1 a转染 NIH3T3细胞 ,72 h后收集细胞培养上清 ,并提取细胞总RNA,经 RT- PCR,得到与目的基因长度相符合的 c DNA片段 ;以 PSP94c DNA为探针 ,对 RT-PCR产物进行 Southern印迹分析 .结果表明 :转染 PSP94- TNFαD1 1 a融合基因的 NIH3T3细胞 ,其 RT- PCR产物杂交信号为阳性 .细胞培养上清用 TNF抗体行 Western印迹和 ELISA分析 ,检测结果为阳性 .生物学活性分析表明 ,细胞培养上清不仅具有 PSP94抑制人前列腺癌细胞 PC- 3生长的活性 ,而且显示出 TNFα对 L92 9细胞的细胞毒作用 .以上结果表明 ,pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a质粒能够正确表达目的基因 PSP94- TNFα D1 1 a,且表达的 PSP94- TNFαD1 1 a融合蛋白具有预期的双重生物学活性 .     

PSP94融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗前列腺癌活性分析

在从成年人正常前列腺组织中获得人９４个氨基酸的前列腺分泌蛋白（ＰＳＰ９４）ｃＤＮＡ基础上,利用ＰＬ表达系统,实现了人ＰＳＰ９４成熟肽Ｎ 末端带有１９个外源氨基酸的融合蛋白在大肠杆菌中的表达。目的蛋白在细胞中主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的３０％,分子量约为１６－５ｋＤ。表达产物在人前列腺癌细胞ＰＣ ３上活性分析表明,该融合蛋白能明显抑制前列腺癌细胞的生长。     

人PSP94与TNFα衍生物联合治疗人前列腺癌的实验研究

构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行了 PSP94与 TNFαD1 1 a联合治疗人前列腺癌的实验研究 .当动物肿瘤直径长至约 1 0 mm时 ,将以上 3种真核表达质粒分别以 50 μg/只的量给相应组动物的左右四头肌内注射一次 ,同时设 pc DNA3.0空载体对照组 ;rh PSP9450μg/kg、rh TNFαD1 1 a 1 0 0万单位 /kg、rh PSP94和 rh TNFαD1 1 a以同样剂量联合给药 ,肌肉注射 ,每 d一次 ,连续 1 0 d,同时设环磷酰胺阳性对照组和生理盐水阴性对照组 .基因治疗动物给药后第 1 5d处死 ,蛋白治疗组停药后第 2 d处死 ,观察疗效 ,计算抑瘤率 .结果显示 ,以上述方式给药 ,无论是基因治疗组还是重组蛋白组 ,给 PSP94的动物肿瘤虽然未见明显缩小 ,但肿瘤组织均出现不同程度的坏死和液化现象 ;给 TNFαD1 1 a的未见明显的抑瘤效果 ;PSP94-TNFαD1 1 a融合基因或 rh PSP94+ rh TNFαD1 1 a联合给药 ,不仅肿瘤有所缩小 ,而且也有不同程度的坏死和液化现象出现 .初步认为 :( 1 ) PSP94有一定的抗前列腺     

94个氨基酸的前列腺分泌蛋白与TNFα衍生物的协同抗肿瘤作用

体外研究显示,重组PSP94与重组TNFα（rhTNFαDll）有协同抗前列腺癌的作用。将编码这两种蛋白的基因与真核表达载体pcDNA3．0重组,构建成pcDNA－PSP94－TNFαDlla真核表达质粒,两基因中间通过一个编码6个氨基酸的人工接头连接。在体外,对pcDNA－PSP94－TNFαDlla质粒表达PSP94－TNFαDlla蛋白的生物学活性鉴定表明,该蛋白即具有PSPO94抑制前列腺癌细胞生长的活性,又具有TNFαDlla对L929细胞的细胞毒作用。肌肉注射该质粒DNA,注射后第0天血液中可检测到目的的蛋白的表达,目的蛋白浓度的高峰期约在注射后第14天,第25天仍可检测到目的的蛋白的表达。该质粒DNA以50μg/只的量给人前列腺癌裸鼠模型骨四头肌内注射,同时设pcDNA－PSP94、pcDNA－TNFαDlla、pcDNA3．0空载体和生理盐水对照组。注射后第20天处死动物,抑瘤率分别为：pcDNA－PSP94－TNFαDlla组24％,pcDNA－PSP94组19％,pcDNA－TNFαDlla组瘤体大小与生理盐水组无明显差异。以同样方法给药,pcDNA－PSP94－TNFαDlla质粒DNA对小鼠Lweis肺癌的抑制率31％,是pcDNA－PSP94组抑瘤率的2．2倍,是pcDNS－TNFαDlla组抑瘤率的2．1倍。提示,PSP94与TNF具有协同抗肿瘤的作用。     

抗菌肽Cecropin B-人溶菌酶融合蛋白表达载体的构建

目的是构建抗菌肽B(Cecropin B)和人溶菌酶(hLyso)的融合蛋白表达载体。从pUC118～hLyso上卸下人溶菌酶基因后,通过重叠区扩增法人工合成抗菌肽B基因,并将其融合到人溶菌酶基因的5’端。将抗菌肽B基因和人溶菌酶基因按正确的阅读框架定向克隆至大肠杆菌高效表达载体pET32a,终止子位于人溶菌酶基因的3’端。PCR鉴定及序列分析表明,所转化的BL21(DE3)菌落中含有插入Cecropin B-hLyso基因的重组质粒pET32a-CB-hLyso。     

重组人GM-CSF/MCAF融合蛋白的构建及其体内外抗肿瘤研究

以单核细胞趋化激活因子(MCAF)作为导向效应细胞(单核细胞)到靶部位的因子,与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CFS)融合构建成细胞因子融合蛋白rhGM-CSF/MCAF.它分别保留各自较高的生物学活性及具有协同与增强功能.体外抗肿瘤试验表明,它激活单核细胞后能抑制多种肿瘤细胞的生长.裸鼠抗肿瘤试验同样显示明显的抑瘤效应,且优于rhGM-CSF.病理组织学检查提示这种抗肿瘤作用是通过将大量的单核细胞募集到肿瘤部位来实现的.     

人神经生长因子融合蛋白的纯化及其生物活性的研究

用一株基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ２４２６／ｐＭＮ表达了麦芽糖结合蛋白－人神经生长因子融合蛋白,菌体超声破碎后,上清液经直链淀粉亲和柱一步即可获ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯融合蛋白,为麦芽糖结合蛋白与人神经生长因子的络合物,产率约１０％。产物用鸡胚背根神经节检测生物活性,１ＢＵ不大于１０ｎｇ,与小鼠颌下腺β神经生长因子具有类似生物活性。     

烟草花叶病毒运动蛋白cDNA的克隆及融合蛋白的表达

从烟草花叶病毒(TMV)中提取总RNA,通过反转录PCR (RTPCR) 扩增得到其运动蛋白(MP)的基因,将扩增产物克隆到pMD18T载体上。DNA序列分析表明,所得到的运动蛋白的基因全长为807bp (GenBank接受号AY300161), 与已发表TMV序列（GenBank登陆号为NC-001367）和同属的番茄花叶病毒（ToMV, GenBank登陆号为NC-002692相比核苷酸的同源性分别为98.0％和80.9％,氨基酸的同源性分别为99.1％和80.0％。 将目的片段亚克隆到表达载体pET30a上,并在大肠杆菌JM109中诱导表达,诱导9h 后,融合蛋白表达量最大。诱导后的工程菌超声后经SDSPAGE检测,融合蛋白以可溶形式存在。     

人分泌粒蛋白Ⅲ的克隆和表达

研究了一个新的人分泌蛋白基因－分泌粒蛋白Ⅲ（secretograninⅢ,SgⅢ),SgⅢ蛋白序列共有468个氨基酸残基,N端有一段疏水信号肽,序列中含有DSTK重复序列和7对二元碱性氨基酸（dibasic sites),这些结构特点同其他分泌蛋白家族成员相类似,人源SgⅢ蛋白在小鼠,大鼠和爪蟾中各有一个同源蛋白,基因组分析表明,SgⅢ基因位于15号染色体上,含有12个外显子, 分布在39kb长的基因组DNA上,Western印迹和免疫细胞化学实验证实,SgⅢ蛋白同其他分泌粒蛋白家族成员一样,通过分泌途径被分泌到胞外,SgⅢ在多种组织中都表达,Northern印迹显示SgⅢ的mRNA主要有2．2kb和1．9kb两种形式,但在脑中还有4．5kb和3．3kb大小的两种特异转录本。     

eEF1A1基因克隆、原核分泌表达及融合蛋白纯化

eEF1A1作为蛋白合成中的重要翻译延伸因子,可与多种功能性蛋白如F-actin、BPOZ-2结合,并在细胞凋亡、蛋白降解方面起重要作用.以往原核基因工程蛋白表达系统大多为包涵体表达的变性分子,需要复性.为了获得eEF1A1原核分泌性可溶性蛋白分子,克隆了人eEF1A1蛋白编码序列(约1 300 bp),并成功构建pET22b-A原核分泌表达重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株,0.4 mmol/L终浓度IPTG诱导,经不同温度下包涵体与胞浆蛋白组分分析,快速明确蛋白表达情况,即诱导4 h后,37℃表达于包涵体组分,在30℃分泌表达至胞浆组分.通过His-Trap亲和层析纯化柱进行线性洗脱,Bradford法测定蛋白浓度高达620 mg/mL,SDS-PAGE分析纯度约为95%,蛋白大小符合50 kD,Western blotting显示目的蛋白能被eEF1A1抗体识别;质谱分析证实重组蛋白为人eEF1A1蛋白分子.为进一步研究其与重要功能性蛋白的相互作用及在细胞凋亡和蛋白降解中的作用奠定基础.     

人白细胞介素11 cDNA的克隆、融合表达及活性测定

取人胎肺做原代培养细胞,PMA诱导后,利用RT-PCR技术,扩增出了去掉N端信号肽序列的IL-11cDNA;经序列分析表明,该序列与文献报道序列高度同源,仅3个核苷酸有变化,氨基酸序列完全一致。将此IL\|11cDNA克隆入硫氧还蛋白基因融合表达载体pTRXFUS的trxA基因3′末端,利用其3′端的蛋白肠激酶切点,构建符合读码框的融合基因。该融合蛋白在大肠杆菌中表达量达20%以上。用IL-6依赖细胞株7TD1及MTT法测定生物学活性,达2.56×105 u/mL菌液,对融合蛋白进行了Western blot测定,并对表达条件作了初步研究。     

人IL-6和TNF突变体重组融合蛋白表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达

本文利用PCR技术,对人肿瘤坏死因子α(hTNFα)基因进行了改造,并将其与人白细胞介素-6(hIL-6)成熟肽编码区cDNA进行融合,构建了5′IL-6-TNF△融合蛋白的表达质粒pBVIL6-TNFA△。DNA序列分析证明,PCR扩增片段核苷酸序列与引物设计序列及相应的cDNA序列完全一致;重组子用限制性内切酶酶切鉴定,含有正确的IL6-TNF△融合cDNA片段;表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,分子量约为37kD,与预计的相符合;生物学活性分析初步表明,该融合蛋白具有抗肿瘤活性。     

人甲状旁腺激素-血清白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接PTH和HSA基因,并将构建好的融合基因插入到载体pUC19测序后插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOXⅠ和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白PTH-HSA。重组质粒pPIC9K/PTH-HSA经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母KM71,经G418筛选得到的转化子。PCR鉴定后,用甲醇诱导表达,蛋白电泳分析表明融合基因得到表达; Western blot分析表明发酵液上清中表达的融合蛋白PTH-HSA具有HSA的抗原性:用酶标法测定发酵上清中融合蛋白的甲状旁腺激素活性为318IU/ml     

人神经生长因子融合蛋白的纯化及其生物活性的研究

用一株基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉ２４２６／ｐＭＮ表达了麦芽糖结合蛋白－人神经生长因子融合蛋白．菌体超声破碎后,上清液经直链淀粉亲和柱一步即可获ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯融合蛋白（５５ｋＤ）,为麦芽糖结合蛋白（４２ｋＤ）与人神经生长因子（１３ｋＤ）的络合物,产率约１０％．产物用鸡胚背根神经节检测生物活性,１ＢＵ不大于１０ｎｇ,与小鼠颌下腺β神经生长因子具有类似生物活性     

中华大蟾蜍精巢组织全长cDNA文库的构建及泛素延伸蛋白基因Bg-ubi52的获得

运用SMART技术构建了中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)精巢全长cDNA文库。提取中华大蟾蜍精巢总RNA,用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA,LD-PCR扩增获得全长cDNA双链;经SfiⅠ酶切、层析柱分离后,500bp以上的片段与λTriplEx2载体连接并包装,建成原始文库。经鉴定,原始文库滴度为2.21×106pfu/ml,重组率为91%;文库扩增后的滴度为2.94×109pfu/ml,重组率为93.7%。插入片段大小分布于0.4~2.0kb之间,平均长度约为1.0kb,说明已构建文库质量较高,为进一步筛选、克隆精巢特异表达基因奠定了基础。从该文库中克隆到了泛素延伸蛋白基因,全长561bp,包含完整的5′和3′非编码区,编码128个氨基酸,即泛素的76个氨基酸后融合了52个氨基酸的核糖体L40蛋白。     

基因工程抗体融合蛋白的构建

抗体融合蛋白可以具有抗体的特性和所融合的功能蛋白的活性,可广泛用于免疫治疗、免疫诊断、抗体纯化及抗体和抗原的分析定量等,特别可用于免疫导向药物的制备。基因工程抗体融合蛋白比传统的化学交联的抗体融合蛋白具有更多的优越性。本文就基因工程抗体融合蛋白的构建和性质做一综述。     

人蛋白C cDNA基因的克隆及序列分析

为实现人蛋白C cDNA在哺乳动物细胞中的表达以及研究其生物学特性,针对人蛋白C cDNA序列设计引物,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从人胎肝总RNA中钓取人蛋白C cDNA,将其克隆入pIRES neo载体中,通过酶切和PCR鉴定出重组体并进行测序分析。结果表明,获得大小为1386bp的人蛋白C cDNA基因,成功构建人蛋白C cDNA载体pIRES/hPC,为进一步进行人蛋白C cDNA的表达和活性鉴定奠定了基础。     

人偏肺病毒融合蛋白F的原核表达及初步应用

为了探讨人偏肺病毒(hMPV)融合蛋白(F)在原核表达系统中的表达效果及其应用价值,用大肠杆菌表达系统表达hMPV F1亚单位蛋白并用镍柱(Ni-NTA)进行亲和层析纯化,并以其为抗原,用Western Blot方法进行人血清抗体检测的探索。根据F蛋白的疏水性、抗原位点和表面可及性的预测结果选择F1亚单位为目标区域,在大肠杆菌BL21中分别得到了带有6个组氨酸(His)标记的不同基因型hMPV的F1亚单位蛋白的高效表达,目的蛋白大小约37.0 kD,主要以包涵体形式存在。Western Blot检测显示表达的目的蛋白可以特异性地结合抗hMPV的豚鼠多克隆抗体以及确定为hMPV急性感染患者的血清,而且与副粘病毒科肺病毒属的呼吸道合胞病毒(RSV)和副流感病毒(PIV)(2和3型)之间没有交叉反应,显示表达的F1蛋白的特异性和抗原性良好。应用该表达蛋白进行部分人群血清抗体检测的探索,结果显示人群血清抗hMPV-F蛋白的IgG抗体总阳性率约为66%~67%,0~2岁组的血清抗体阳性率随年龄增长呈现逐渐下降趋势,新生儿的抗体阳性率最高,达85%左右,>1岁~2岁组幼儿阳性率最低,提示母传抗体的存在。随后各年龄组人群随年龄的增长血清抗体阳性率逐渐增高,>60岁年龄组人群抗体水平最高,上述结果提示<2岁儿童为hMPV的易感人群。