人干扰素α-2b基因植物表达载体的构建及转化

目的:通过构建人干扰素α-2b(hIFNα-2b)基因的植物表达载体,为后期将其导入胡萝卜愈伤组织中作准备。方法:采用PCR技术从人基因组DNA扩增hIFNα-2b编码基因及全长基因,将其克隆于pMD19-T载体中,双酶切hIFNα-2b基因及植物表达载体pBI121,回收目的片段,T4DNA连接酶连接得到植物表达载体pBI121-hIFN。采用三亲交配法将后者导入根瘤农杆菌。结果:经PCR检测,双酶切及DNA序列测定表明hIFNα-2b编码基因及全长基因已分别插入植物表达载体pBI121中,重组表达载体pBI121-IFN已成功转化根瘤农杆菌LBA 4404。结论:成功构建了植物表达载体pBI121-hIFN并转入根瘤农杆菌。     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性.结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达.     

植物源内含子对GUS基因表达模式的影响

采用报告基因的瞬间表达来优化转化体系是提高农杆菌介导法转化效率的重要手段,GUS以稳定、易于定性定量分析等独特优点成为瞬间表达体系的首选。pCaMV 35S启动下的GUS基因可在农杆菌中表达,另外还首次报道该嵌合基因同时也可在大肠杆菌中高效表达。为避免GUS基因在农杆菌中的表达对瞬间表达体系的影响,一拟南芥蛋白基因的内含子被插入到GUS基因的编码区,进而构建了含内含子的GUS植物表达载体pBI121-GUSint。组织化学染色结果表明,GUSint在农杆菌中没有表达,而在接种3d的油菜中可高效瞬间表达,其中在子叶柄（带子叶）中瞬间表达率高达100%,这一方面证实载体构建成功,另一方面也为进一步优化油菜及其它芸薹属植物转化体系及在油菜中快速研究目的基因的功能和表达调控模式奠定了基础。     

辣椒ML基因植物表达载体的构建及其转化

为分析辣椒ML基因在抗辣椒疫病方面的作用,构建了ML基因的植物表达载体pBI121-ML,采用快速冻融法将表达载体导入农杆菌EHA105,并用农杆菌介导法转化辣椒感病品种B12,对得到的转化植株经PCR和RT-PCR分子检测,结果显示,获得了4个辣椒转基因株系.     

麦冬OjRCA基因植物表达载体的构建

Rubisco活化酶(RCA)对光合关键酶Rubisco具有重要的调节作用.以植物表达裁体pBI121为基础,设计分别带有酶切位点Sma Ⅰ和Sac Ⅰ的一对特异引物,以麦冬叶片总RNA反转录得到的第一条cDNA链为模板,扩增得到目的基因OjRCA.用Sma Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切目的基因及表达载体pBI121,回收后利用T4DNA连接酶连接,获得植物表达载体pBI121-OjRCA.通过冻融法将所获得的植物表达裁体导入根癌农杆茵EHA105菌株中,为该基因的功能鉴定及通过农杆菌介导法将OjRCA基因导入植物提高相关抗性提供参考.     

Prd29A及DREB1A的克隆和干旱诱导型植物表达载体的构建与鉴定

从拟南芥中克隆了RD29A基因的启动子(Prd29A)及DREB1M基因的DNA片段,构建Prd29A:DREB1A融合基因,采用合成的接头将该融合基因插入到植物表达载体pBI121中,经鉴定,确认正确.     

植物介导的RNA干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的转基因番茄的研究

本研究构建了植物干扰南方根结线虫Mi-eft2基因的载体pBI-RNAi;建立了番茄再生体系和番茄农杆菌侵染后的再生体系;并利用该体系转化了对照空载体pBI121和干扰载体pBi-RNAi,经过卡那霉素抗性筛选和基因组DNA中报告基因及RNAi片段的PCR检测筛选,一共获得5株pBI121转化的阳性植株,获得9株p BI-RNAi转化的阳性植株。该研究为今后进行转基因植株介导的干扰线虫目的基因的表达,降低线虫侵染能力的研究奠定了基础。     

玉米Lc基因植物表达载体构建及菊花转化

Lc基因是从玉米中分离得到的与花青素合成相关的调节基因,它在多种植物中的异源表达可以增加花青素的含量.本研究对pBI121载体Gus基因后的终止子进行2次PCR扩增,在原Sac Ⅰ酶切位点后添加了新的Sac Ⅰ酶切位点,利用组织化学染色法检测,结果表明改造后的载体上的Gus基因能正常表达,终止子功能正常,载体改造成功.用改造的pBI121N构建了含有Lc基因的植物表达载体pBl121N-Lc,利用农杆菌介导法转化菊花叶盘,获得了19株生根抗性苗.通过提取抗性苗基因组总DNA,PCR扩增Lc基因和CaMv35S启动子获得了11个阳性株系,PCR结果表明Lc基因已经转入菊花中.同时,在已获得的转基因植株中发现7个株系的根系有变红的现象.     

拟南芥CAS基因的生物信息学分析及超表达载体构建

对拟南芥氰丙氨酸合酶(Cyanoalanine synthase,CAS)基因进行了生物信息学分析,并构建了CAS合酶基因的超表达载体,以期为后续功能研究奠定基础。生物信息学分析结果表明,编码拟南芥CAS合酶的CYS-C1和CYS-D1基因含有10个外显子和9个内舍子,定位于3号染色体,而CYS-D2基因有9个外显子和8个内含子,定位于5号染色体。三个基因编码的蛋白氨基酸序列相似度较高,CYS-C1蛋白偏碱性且主要在线粒体中起作用,而CYS-D1和CYSD2蛋白偏酸性,主要在细胞质中起作用;通过RT-PCR扩增了拟南芥CYS-C1,CYS-D1和CYS D2基因片段,并构建了超表达载体pBI121-35S-CYS-C1,pBI121-35S-CYS-D1和pBI121-35SCYS-D2,经检测重组质粒已转化到农杆菌GV3101中。     

番茄转录调控因子基因Pti5植物表达载体的构建及其转化烟草的研究 Construction of a Plant Expression Vector with Tomato Transcription Factor Gene Pti5 and Studies on Transgenic Tobaccos

本实验构建了含有CaMV35S启动子控制下的Pti5-VP16基因的植物双元表达载体pBI121UCH1。通过根癌农杆菌叶盘转化法,将Pti5-VP16基因导入烟草SRI中,经卡那霉素筛选,获得了抗性植株。经PCR和Southern印迹分析,表明抗性植株中整合了Pti5-VP16基因,经抗病性鉴定转基因烟草植株的抗病性明显提高。 Abstract:The plasmid pBI121UCH1 carrying Pti5-VP16 gene under the control of the cauliflower mosaic virus 35s promoter was constructed.Leaf segments of tobacco SRI were infected by Agrobacterium tumefaciens EHA105 with plasmid pBI121UCH1,from which kanamycin resistant plants were obtained.PCR and Southern analysis proved that the Pti5-VP16 gene was integrated into the genomes of the tobacco plants.The disease resistance assay showed that the disease resistance was enhanced in the transgenic tobacco plants.     

抗冻蛋白(afp)基因表达载体的构建及对香蕉胚性细胞悬浮系的转化

通过PCR从‘京都七寸人参'胡萝卜基因组DNA中扩增抗冻蛋白基因,测序结果表明该基因的核苷酸序列与从宁夏‘吴忠'胡萝卜中克隆的完全一致。先后将获得的胡萝卜afp基因克隆和亚克隆至pMD18-T和pBI121,构建植物表达载体pBI121-afp。通过冻融法将pBI121-afp导入根癌农杆菌EHA105中。以香蕉栽培品种‘北大矮蕉'的胚性细胞悬浮系为受体,采用农杆菌介导法将胡萝卜afp基因导入其中,然后在Kanamycin的选择压力下通过体细胞胚发生途径进行植株再生。共获得抗性再生植株9株,其中两株经PCR检测呈阳性,可初步确定目的基因已经整合到这两株转基因香蕉植株的基因组中。     

Insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana: increase of germinating seeds transformation efficiency after sonication

An efficient procedure of transforming Arabidopsis thaliana germinating seeds was elaborated on the basis of the method of Feldmann and Marks. The procedure involves microdamaging T1 seeds by sonication before culturing with a vector Agrobacterium strain and yields more than 1% T2 transformants. Germinating seeds were transformed with Agrobacterium timefaciens hypervirulent strain A281 carrying plasmid pLD3 derived from pBI121. A collection of 54 A. thaliana T2 transformants was obtained; some of them showed marked morphological alterations. The transgenic nature of plants that acquired resistance to a marker antibiotic was confirmed histochemically and by PCR amplification of a T-DNA region.     

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素B亚单位（CT－B）基因及内质网引导序列（SEKDEL）克隆到质粒pRTL2和pBI121中,分别构建植物双元表达载体pBI-CTB和pBI-CTBK,CT-B基因由Ca35S启动子控制表达。采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄（金丰1号,Jinfeng1)各表达载体得到一批转基因植株。经PCR和Southern blot分析表明CT－B基因整合到了番茄基因组中;ELISA和Western blot分析表明pBI-CTB和pBI-CTBK的转基因植株能够有效表达CT－B多肽,分别占番茄叶片可溶性蛋白的0.055%和0.084%。     

胰蛋白酶抑制剂基因siRNA表达体系的构建

以大豆基因组DNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因KSTI3的全长DNA片段,并将其构建到pMD18-T vector上。核苷酸序列测定结果表明:该基因片段全长654bp,与已发表的KSTI3基因序列同源性达99%。将反义 正义基因片段插入到pBI121 35S启动子下,构建重组质粒pBIKSTI3。通过冻融法将该重组质粒转入农杆菌EHA105中,获得了siRNA表达体系。利用农杆菌介导法将带有pBIKSTI3的菌株转化大豆,从2棵再生植株中得到2 100bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生。     

甘蓝型油菜TT1基因反义植物表达载体的构建

拟南芥TT1(transparenttesta1)基因编码一个WIP类型锌指蛋白转录因子,调控内种皮发育和原花青素在内种皮的积累。本研究通过PCR扩增了甘蓝型油菜(Brassicanapus)TT1基因家族(BnTT1)的一段特异保守片段TT1A,并将其亚克隆到中间载体pCambia2301G中,构建了TT1反义植物表达载体pCambia2301G-TT1A,通过PCR鉴定、酶切鉴定和DNA测序证实载体构建成功,并转化到根癌农杆菌LBA4404菌株中形成工程菌株。此表达载体的构建为进一步研究TT1基因在甘蓝型油菜种皮色素合成途径中的分子生物学机理和利用反义TT1基因遗传转化获得转基因新型黄籽油菜奠定了基础。     

甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因植物表达载体的构建 与遗传转化柑桔的研究

基因工程领域的研究进展使得植物体成为具有重要经济价值的药用蛋白的生产体系。以含甲型肝炎病毒结构基因cDNA的克隆载体pCDNAⅡA16为模板,用甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因特异引物进行PCR扩增,得到全长2.2kb衣壳蛋白融合基因序列。经测序鉴定后正向克隆于植物表达载体pBI121中,衣壳蛋白融合基因位于pBI121质粒T-DNA左右边界区间内,处于CaMV35S启动子控制之下。经限制性内切酶分析和PCR鉴定后利用冻融法将重组质粒pBI121-A导入根癌农杆菌LBA4404。以锦橙 (Citrus. Sinensis Osbeck) 上胚轴为转化材料,通过根癌农杆菌介导法将衣壳蛋白融合基因转 化到植物基因组中。120株转化外植体经卡那霉素50 mg/L筛选,其中13株生长状况良好未出现白化现象的拟转化芽微嫁接到实生砧木继续培养。PCR分析证明,13株拟转化植株中有5株植物基因组中已导入甲型肝炎病毒衣壳蛋白融合基因,转化率为4.1%。此研究是对遗传转化柑桔表达外源蛋白的初步探讨,为进一步研究食用疫苗开辟了新途径。Abstract: The use of edible plants for the production and delivery of vaccine proteins could provide an economical alternative to fermentation systems. The construction of the plant expression vector pBI121-A was reported, which contained a fusion gene encoding hepatitis A capsid proteins. The gene was located between the left and right Ti border sequences under the control of CaMV35S promoter. The vector was identified via PCR and restriction enzyme analysis and was introduced into Agrobacterium tumerifacience LBA4404. The transgenic Citrus plants were produced by Agrobacterium-mediated transformation of epicotyl segments. 13 putatively transformed plants through the kanamycin selection were micrografted onto the seedlings. The presence and integration of the transgene had been verified by PCR analysis. The result showed that five transformants were integrated and the transformation efficiency was 4.1%.     

Isolation and identification of canine parvovirus serotype 2a and its VP2 protein expression in transgenic tobacco

A strain of canine parvovirus (CPV) was isolated from feces of an ill puppy in an animal hospital in Wuhan, China. It was designated as CPV/WH02/06. This isolate was identified as serotype CPV-2a by the hemagglutination test, CPV Ag detection strip, electron microscopy, and PCR. The vp2 gene was cloned and sequenced and assigned GenBank accession number EU377537. A 1242 bp segment of the 5' region of the vp2 gene was cloned and inserted into the binary vector pBI121 and used for Agrobacterium-mediated tobacco transformation. Transgenic tobacco plants were selected on MS medium supplemented with 100 μg/mL kanamycin and 100 μg/mL timentin. Integration of the vp2 gene into the tobacco genome was confirmed by PCR using T1 progeny plants, and the expression of the VP2 protein was confirmed by Western blotting.