大鲵细菌性败血症病原分离及生物学特性研究

利用湖南润孚生物工程公司大鲵人工养殖场10尾具有典型症状的患病大鲵,从体表病灶和体内器官肠、胃、肝、脾、肾等共分离得到9株细菌。通过人工感染试验、细菌形态观察和生理生化实验对其进行鉴定,结果显示引起该养殖场大鲵发病的病原为嗜水气单胞菌。通过回归感染试验发现,其中一菌株对大鲵的致病力很强,死亡率达到100%。药物敏感性试验结果显示,菌株对环丙沙星、头孢曲松、头孢他啶、头孢孟多、头孢哌酮、庆大霉素、头孢西丁药物相对比较敏感,而对克林霉素、头孢唑林、甲硝唑和复方新诺明具有耐药性。     

丰产鲫细菌性败血病的研究Ⅰ——病原分离与鉴定

从患败血病的丰产鲫 (Carassiusauratusofpenze (♀ )×Cyprinusacutidorsalis (♂ ) )脾脏中分离到的一株细菌CSS 4 2 ,经人工感染证实为病原菌。其主要特征为短杆状 ,革兰氏阴性 ,有运动性 ,极端生单鞭毛 ,不产生芽孢 ,无荚膜 ;对 0 1 2 9弧菌抑制剂不敏感 ,能利用葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇等 ,不利用丙二酸盐、乳糖、木糖、棉子糖、山梨糖、福寿草醇等 ;氧化酶、精氨酸双水解酶阳性 ,尿素、苯丙氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阴性。经细菌自动化鉴定系统VITEK AMS 60鉴定 ,CSS 4 2菌株为豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)。药物敏感试验表明 ,CSS 4 2对链霉素、妥布霉素、氯霉素、利福平、诺氟沙星、呋喃妥因等药物敏感 ,对青霉素G等不敏感     

斑点叉尾源杀鲑气单胞菌无色亚种分离鉴定及药敏特性

研究从患溃疡症斑点叉尾鲙中分离到一株致病性菌株ry01,生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析表明ry01株为鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状,且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾鲙的半数致死量为4.17×10~6 CFU/m L。菌株ry01对强力霉素及左氧氟沙星等高度敏感,为斑点叉尾鲙该病防控提供了理论依据。     

斑点叉尾鮰源普通变形杆菌的分离、鉴定及药敏特性

【目的】对患病斑点叉尾鮰进行病原菌分离、鉴定及药敏实验,为斑点叉尾鮰肠道坏死病的防控提供参考。【方法】从患病斑点叉尾鮰病灶、肝、脾和肾分离纯化病原菌,经理化特性测定及16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定,开展人工感染试验,并利用纸片扩散法进行药敏特性分析。【结果】分离菌株k1为本次引发斑点叉尾鮰病害的致病菌,其对斑点叉尾鮰的LD50为2.82×10~5 CFU/g。菌株k1理化特性与普通变形杆菌Proteus vulgaris基本一致,16S rRNA基因序列与普通变形杆菌相似性最高,综合判定分离菌株为普通变形杆菌。分离菌株k1对环丙沙星、头孢唑林及头孢拉定等12种抗生素高度敏感,对苯唑西林、阿莫西林及痢特灵等7种抗生素耐药。【结论】分离菌株k1是斑点叉尾鮰病原菌,养殖时可选用庆大霉素及氟苯尼考等药物进行防控。     

尼罗罗非鱼致病性类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)的分离鉴定及其病理学观察

【目的】2013年5月广东番禺某养殖场罗非鱼出现大量死亡现象,临床症状表现为鱼体体色发黑、体表出血、鳞片脱落、鳍条溃烂等,解剖发现腹腔有大量腹水、胆囊肿大、肝呈黄色、脾脏呈暗红色。为确定病原,【方法】从具以上临床症状的病鱼组织中分离获得可疑菌株1株,编号PYS1。采用形态特征、生长特性、理化特征、16S rRNA基因序列分析等理化及分子生物学技术鉴定该菌株种类。通过人工回归感染及组织病理学研究确定该菌株的致病性,并开展药物敏感性试验筛选其敏感药物。【结果】结果表明PYS1菌株为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides),在16S rRNA基因序列构建的分子进化树中与其他鱼源类志贺邻单胞菌聚为一支。药敏试验结果表明该菌株已呈现多重耐药性,仅对少数检测抗生素(头孢曲松、头孢洛克和头孢唑啉等)敏感。人工回归感染结果显示PYS1菌株可使尼罗罗非鱼出现与自然发病鱼相似症状,其对尼罗罗非鱼半致死量为1.425×108CFU/尾,石蜡切片显示其对感染鱼的肠、肝、脾、肾和心脏等组织均可造成损伤。【结论】证明类志贺邻单胞菌为上述养殖场尼罗罗非鱼发病的病原,且为首次报道该菌对尼罗罗非鱼的致病性。     

PCR结合酶切-序列比对法鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株

目的用PCR结合酶切-序列比对法对B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行鉴定。方法用玻片凝集法对不同来源的15株B群脑膜炎奈瑟菌菌株进行初步检定,再用PCR结合酶切-序列比对法对上述15株菌株进行进一步鉴定,即用PCR结合酶切法扩增菌株的唾液酸转移酶sia D基因并对PCR产物进行酶切后,用BLAST软件将PCR产物测序结果与Gene Bank中原始sia D序列比对。结果 15株菌株玻片凝集结果均为阳性;15株菌株的PCR产物片段大小均为460 bp;TaqⅠ酶切后,13株菌株的酶切产物片段大小仍为460 bp,其PCR产物测序比对结果与B群脑膜炎奈瑟菌原始sia D序列同源性均达到99%;其余2株酶切产物片段大小约200 bp,与C群脑膜炎奈瑟菌sia D原始基因序列同源性分别为98%和99%。结论 15株菌株经PCR结合酶切-序列比对法鉴定,13株为B群脑膜炎奈瑟菌菌株,2株为C群脑膜炎奈瑟菌菌株;该方法可准确鉴定B群脑膜炎奈瑟菌菌株。     

鳗鲡弧菌病病原菌的分离与鉴定

从患弧菌病的鳗鲡的肝脏分离到编号为E-3-11、E-10-1和E-11-1的三株菌。用此菌人工感染鳗鲡能出现相似的病症,并从肝、肾又重新分离到这种菌,证实为该病的病原菌。这些菌株的特性基本一致,经鉴定为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。     

斑点叉尾鲖源杀鲑气单胞菌无色亚种分离鉴定及药敏特性

研究从患溃疡症斑点叉尾鲙中分离到一株致病性菌株ry01, 生理生化鉴定和16S rDNA基因序列分析表明ry01株为鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp. achromogenes)。人工感染该菌后发病鱼表现为与自然发病类似症状, 且从组织中再分离的细菌特性与原感染菌相同。腹腔注射后该菌株对斑点叉尾鲙的半数致死量为4.17×106 CFU/mL。菌株ry01对强力霉素及左氧氟沙星等高度敏感, 为斑点叉尾鲙该病防控提供了理论依据。     

丰产鲫细菌性败血症病原CSS-4-2的生长特性

对患败血症的丰产鲫 (Carassiusauratusofpenze (♀ )×Cyprinusacutidorsalis(♂ ) )脾脏中分离到的病原菌—豚鼠气单胞菌 (Aeromonascaviae)CSS 4 2菌株的生长特性进行了研究。CSS 4 2在胰蛋白胨液体培养基中振荡培养时 ,0～ 3h为延迟期 ,3～ 30h为对数生长期 ,30～ 36h为稳定期 ,36h后为裒亡期 ;其最适生长温度为 2 5℃～ 30℃ ,最适pH值为 5～ 1 0 ,最适培养液NaCl浓度为 0～ 1 %。     

斑马鱼嗜水气单胞菌的鉴定和人工感染组织病理学研究

从患病斑马鱼体内分离致病菌株并进行鉴定,观察人工感染分离菌株后组织病理学变化。通过对分离菌株ZF4形态特征、生理生化特性、保守基因和系统发育树建立等综合分析进行鉴定。结果显示,ZF4为β溶血的革兰氏阴性短杆菌,吲哚试验为阳性,发酵葡萄糖、蔗糖等糖类,AHA_0438、ASP、gyr B和16S r RNA等基因均为阳性,基于gyr B、16S r RNA基因系统发育分析结果显示ZF4为嗜水气单胞菌。人工感染后斑马鱼临床症状明显,发生肝脏组织变性、肠道内膜脱落、脾脏充血、胰腺间质纤维组织增生等组织病理学变化。斑马鱼体内分离的ZF4鉴定为致病性嗜水气单胞菌,且斑马鱼对该菌敏感,因此斑马鱼可作为研究嗜水气单胞菌的动物模型。     

江苏盐城地区异育银鲫大红鳃疾病病原学研究及病理学观察

为鉴定近期江苏盐城地区养殖异育银鲫大红鳃疾病病原,研究从患病濒死鱼中分离到两株致病菌并对其理化特性、分子生物学、感染病理学进行了研究,同时开展了鉴别诊断和回归试验以及药敏检测。结果显示,两分离株理化特性与温和气单胞菌（A.sobria）特征相符,与GenBank中A.sobria的gyrB基因同源性达99%以上,在系统发育树上均与A.sobria聚为一族。同时与鲤科疱疹病毒2型（CyHV-2）鉴别诊断结果表明,患病鱼组织中CyHV-2检测为阴性。组织学上,鳃和肾组织具有典型病理变化。人工感染两株A.sobria后,鱼体出现与自然发病相似的大红鳃症状,并能从发病鱼组织中再分离到相同病原菌;而人工感染CyHV-2组织匀浆后的鲫虽然出现死亡,但无大红鳃症状出现。综上,确认此次大红鳃疾病的病原为A.sobria。药敏实验表明,分离菌株对诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素三种药物敏感。研究为临床上更好的预防异育银鲫大红鳃疾病奠定了基础。     

聚合酶链反应检测实验动物弓形虫核酸的研究

建立弓形虫动物模型,常规方法提取肝、脾、肾、肺等组织DNA,应用聚合酶链反应（PCR）扩增,产物经电泳检测显示199bp的弓形虫特异带谱。并以γ－32p标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针,对扩增产物行Southern印迹分析,结果上述4种标本均出现阳性杂交带,进一步证实扩增条带是弓形虫特异DNA顺序。同时用酶标法检测显示鼠血清弓形虫抗体IgG;阳性。组织病理学检查结果,肝组织损伤较严重,肝细胞肿大,肝窦消失,脾、肾、肺组织可见轻微的病理改变。另外本文介绍一种简单PCR方法[1],取鼠尾静脉血2μl直接进行扩增,结果与酚-氯仿法提取的DNA扩增结果一致。     

应用原位PCR对鸡传染性法氏囊病病毒早期侵染过程的研究

人工接种 35日龄SPF鸡传染性法氏囊病病毒 ,间隔不同时间采集法氏囊、胸腺、脾、盲肠扁桃体、肾、肝和腿肌进行了原位PCR检测 ,同时观察各组织病理变化。结果无论是H毒株还是Ts毒株 ,接种后 4h肝、肾、脾等组织中即出现明显的阳性信号 ,Ts毒株 4hPI从胸腺、盲肠扁桃体、腿肌等组织中也检出了病毒基因序列。接种H毒株和Ts毒株后 2 8h和 40h ,法氏囊淋巴细胞开始出现变性、坏死。在阳性信号检出的时间上 ,法氏囊较肝、肾、脾等组织是滞后的。H毒株较Ts毒株在早期对法氏囊具有更强的侵染能力。     

一株牙鲆源黏质沙雷氏菌YP1的分离鉴定及致病性分析

黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是引起人类、动物及植物感染的重要条件致病菌,但其作为鱼类致病菌却鲜有报道。【目的】本研究以从患病牙鲆(Paralichthys olivaceus)病灶处分离的一株黏质沙雷氏菌YP1为研究对象,分析黏质沙雷氏菌对鱼类的致病性及对疾控的影响。【方法】利用形态学、分子生物学及生理生化实验综合鉴定菌株YP1;利用菌株YP1进行人工感染实验、组织病理实验及药敏试验,研究其感染症状、组织病理学、毒力和药物敏感性。【结果】分离自患病牙鲆体表溃疡病灶处的菌株YP1鉴定为黏质沙雷氏菌。感染实验结果显示,牙鲆和斑马鱼的半数致死量(LD₅₀)分别为3.44×10⁷CFU/g和6.28×10⁵CFU/g,除牙鲆外菌株YP1对其他鱼类也具有高致病性;菌株YP1主要导致牙鲆腹水,同时伴有呼吸急促、摄食减弱、脱肛、白便、鳃缺血及多脏器膨大出血等症状,并随着感染时间的延长对脏器损伤呈加重趋势。病理组织切片结果显示,菌株YP1对牙鲆鳃、肠、肝、脾、肾、心均造成损伤。药敏试验结果表明,YP1对左氧氟沙星、诺氟沙星等14种药物敏感;但对氨苄西林、头孢拉定等19种药物具有耐药性。【结论】本研究结果证实了黏质沙雷氏菌是能导致牙鲆腹水病的一种病原菌,同时对其他鱼类也具高致病性,为该菌感染鱼类导致疾病的检测、鉴别和防治提供科学依据。     

美洲黑石斑迟缓爱德华氏菌分离、鉴定及致病性研究

养殖美洲黑石斑(Centropristis striata)发生以“内脏白点”为主要临床症状的暴发性死亡, 为明确美洲黑石斑患病原因, 对患病鱼进行了病原分离、鉴定及致病性研究, 以期为防治美洲黑石斑迟缓爱德华氏菌病提供参考依据。患病的美洲黑石斑的症状主要表现为鳃和内脏组织如脾脏及肾脏上布满白点。从患病鱼的病灶处分离纯化到一株优势致病菌株(ZS201807), 通过对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rDNA基因测序等综合分析, 鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)。人工感染实验证实此菌株可引起健康美洲黑石斑发病并表现出与自然发病相似的症状。利用组织切片和电镜超薄切片技术对患病美洲黑石斑鱼的肝脏、脾脏、鳃丝等6种组织进行组织病理学分析。组织病理结果显示, 脾和肾是感染较严重的主要靶器官, 脾脏组织内大量红细胞浸润, 出现严重瘀血; 鳃丝毛细血管扩张; 肾小管管腔狭窄, 肾小球肿大, 上皮细胞肿胀, 细胞空泡化。超微病理显示, 病鱼脾脏和头肾组织有大量杆状细菌积聚。药敏试验发现该菌对环丙沙星(5 μg/片)、四环素(30 μg/片)、恩诺沙星(5 μg/片)等14种药物敏感; 对青霉素(10 U/片)、阿奇霉素(15 μg/片)、丁胺卡那(30 μg/片)等13种药物耐受。证实此次养殖美洲黑石斑发病死亡的病原菌为迟缓爱德华氏菌。     

乳杆菌阴道分离株16S rDNA鉴定及优势菌株产H_2O_2和自凝集能力分析

目的从阴道分泌物标本分离鉴定乳杆菌,分析与健康相关优势菌种产过氧化氢(H2O2)和自凝集能力,揭示菌株特异性的潜在益生特性。方法利用MRS固体培养基从41例阴道分泌物标本中分离单菌落,纯培养后提取细菌基因组DNA,PCR扩增16S rDNA序列,依据序列一致性确定细菌种属。利用TMB-HRP-MRS培养基测定优势乳杆菌菌株产H2O2能力,并测定其自凝集能力。结果获得155个细菌分离株,分属乳杆菌属104株(67.1%)、肠球菌属21株(13.5%)、链球菌属28株(18.1%)、葡萄球菌属1株(0.6%)和双歧杆菌属1株(0.6%)。各菌属在无或有妇科临床症状患者标本中的构成比例差异有统计学意义(χ2=7.4918,P=0.0236),乳杆菌在前者检出率为83.3%,显著高于其在后者47.1%的检出率(χ2=4.4879,P=0.0341)。乳杆菌中卷曲乳杆菌分离株所占比例最高(67.3%,70/104)。来自不同标本的22株卷曲乳杆菌中77.3%菌株产H2O2,且这些菌株具有强弱不同的自凝集能力(27.5%~97.3%)。结论乳杆菌属特别是卷曲乳杆菌种是健康阴道环境中优势菌属,其产H2O2和自凝集能力存在明显菌株特异性,有2株卷曲乳杆菌此两特性均很强可供进一步研发。     

铜绿假单胞菌ESBLs和AmpC酶的检测及耐药性分析

目的了解铜绿假单胞菌临床分离株ESBLs和AmpC酶的产生及对常用抗菌药物敏感性,指导临床合理选用抗生素。方法常规培养分离细菌,采用VITEK-60型全自动细菌鉴定仪鉴定细菌;按NCCLS推荐的双纸片确证法和K-B纸片扩散法检测ESBLs和药敏试验;采用头孢西丁纸片扩散法筛选疑产AmpC酶阳性菌株,确诊采用三维试验。结果铜绿假单胞菌产ESBLs和AmpC酶总检出率分别为40.8%和38.2%,其中,单产AmpC酶、单产ESBLs和同产AmpC酶+ESBLs检出率分别为19.7%、26.3%和14.5%。药敏试验显示:产酶株的耐药性明显高于非产酶株,耐药现象在同产AmpC酶和ESBLs菌株中更为严重。结论台州地区临床分离的铜绿假单胞菌产ESBLs和AmpC酶菌株检出率较高。产AmpC酶和ESBLs的菌株呈高度耐药,临床上对产酶菌株引起感染的治疗应根据细菌药敏试验结果,合理选择有效的抗菌药物联合治疗,减少产酶菌株的产生和流行。     

铜绿假单胞菌耐消毒剂基因检测

目的了解深圳市人民医院临床分离的铜绿假单胞菌耐季胺盐类消毒剂基因(qac)的检出率及基因型。方法收集深圳市人民医院近几年铜绿假单胞菌临床分离菌株63株,应用PCR法检测菌株的qacA/B、qacC、qacG、qacJ和qacE△1基因。结果63株铜绿假单胞菌中,qacE△1基因阳性51株(80.9%),qacA/B基因阳性5株(7.9%),其余的基因型未检出。结论我院临床分离的铜绿假单胞菌中耐季铵盐类消毒剂基因检出率较高,主要为qacE△1型。     

美国青蛙肝炎病病原的研究

从患病的美国青蛙 (Ranagrylio)肝脏组织中分离到 3个菌株 ,经人工感染证实肝 1 1为致病菌。经VITEK AMS 6 0自动鉴定系统鉴定为豚鼠气单胞菌 (Aeromonascaviae)。该菌对丁胺卡那、庆大霉素、菌必治、多粘菌素等 4种药物敏感 ,而对红霉素、螺旋霉素等 2 0种药物有耐药性。     

一株牛蛙源金黄杆菌的分离鉴定及其致病特性

【背景】美国牛蛙养殖过程中病害问题非常突出,尤其是细菌性病害,其病原种类多、病原菌复杂多样、蔓延速度快、发病死亡率高,一直是牛蛙养殖过程中防控的难点。【目的】确定从患病牛蛙体内分离到的一株细菌NW1203的分类地位和致病性。【方法】无菌操作从牛蛙体内取样划线分离细菌,通过形态观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列比对进行种属鉴定,通过人工感染、溶血性试验和病理切片观察分析其致病特性。【结果】经形态和生理生化鉴定及16S rRNA基因序列比对,菌株NW1203为金黄杆菌属细菌,与Chryseobacterium sp. F30的相似性达100%,进化树也显示该菌与金黄杆菌属细菌聚类;溶血性试验表明,菌株NW1203对绵羊、小鼠和牛蛙的血细胞都呈完全溶血;人工感染试验及感染病蛙的组织切片观察显示,菌株NW1203对牛蛙具有较强致病性,可引起牛蛙肝、肾、脾等主要组织严重病变,LD50为4.753×103 CFU/g。【结论】明确了菌株NW1203为牛蛙新病原,为牛蛙疾病的防控提供了理论依据。