甘蓝型油菜扩展蛋白家族的全基因组鉴定及其对缺硼胁迫响应的差异分析

以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)硼高效品种‘青油10号’和硼低效品种‘Westar 10’为研究对象,采用生物信息学分析、转录组测序和实时荧光定量PCR技术,鉴定其基因组中扩展蛋白的家族成员,并对该基因家族响应缺硼胁迫的表达差异进行分析。结果显示,甘蓝型油菜基因组中包含109个扩展蛋白,可分为4个亚家族,包括:79个扩展蛋白A(BnaEXPAs)、21个扩展蛋白B(BnaEXPBs)、5个类扩展蛋白A(BnaEXLAs)和4个类扩展蛋白B(BnaEXLBs)。同一亚家族中的扩展蛋白具有相对保守的基因结构和蛋白质基序组成。这些扩展蛋白基因分布在19条染色体上,其中10个位于硼高效QTL区间内。转录组测序分析结果表明,缺硼胁迫时‘青油10号’的根、幼叶和老叶中分别有40、18和30个扩展蛋白基因显著上调或下调表达;而‘Westar10’中分别有27、24和41个扩展蛋白基因显著上调或下调表达。其中‘青油10号’根中的BnaC04.EXPA6a,幼叶中的BnaA09.EXPA5以及老叶中的BnaA09.EXPA16、BnaC04.EXPA3、BnaCnn.EXPA5b和BnaA03.EXPA8基因的表达水平均显著高于‘Westar10’。研究结果说明甘蓝型油菜基因组中扩展蛋白基因家族数量庞大,其中高、低效品种间和不同硼水平中差异表达的扩展蛋白可能在甘蓝型油菜低硼适应性中发挥重要作用。     

甘蓝型油菜RPD3/HDA1基因家族鉴定及早熟相关基因挖掘

该研究运用生物信息学方法鉴定甘蓝型油菜RPD3/HDA1基因家族,检测了其在‘黔油早2号’和‘中双11’中的表达水平及2个品种在低温(4℃)和ABA胁迫下该家族基因的表达特征,以探讨RPD3/HDA1基因在甘蓝型油菜中的潜在功能,为早熟油菜抗逆性遗传改良提供理论基础和候选基因。结果表明:(1)在甘蓝型油菜全基因组中共鉴定到28个RPD3/HDA1基因,将其命名为BnHDA1~BnHDA28,聚类为4个亚家族,同一亚家族成员的基因结构较为相似;在该基因家族中共检测到16对复制基因,均为片段重复。(2)顺式作用元件预测统计中共发现675个元件与植物激素、环境胁迫和光响应有关。(3)qRT-PCR分析显示,RPD3/HDA1基因在‘黔油早2号’中的表达量均高于‘中双11’;低温胁迫下,‘黔油早2号’和‘中双11’中RPD3/HDA1基因呈差异表达,与‘中双11’相比,RPD3/HDA1基因在‘黔油早2号’中的下调幅度较大;ABA处理后,RPD3/HDA1基因在2个品种中表达模式不一致,‘黔油早2号’中大部分RPD3/HDA1基因表达量较‘中双11’下调幅度小。研究认为,RPD3/HDA1基因可能在油菜开花中发挥调节作用,而且可能通过激素信号通路和防御信号通路参与油菜的生长发育和防御反应的调节。     

甘蓝型油菜MADS-box基因家族的鉴定与系统进化分析

MADS-box基因家族参与调控开花时间、花器官分化、根系生长、分生组织分化、子房和配子发育、果实膨大及衰老等植物生长发育的重要过程。基于甘蓝型油菜(Brassica napus)基因组测序数据,利用生物信息学方法对甘蓝型油菜MADS-box基因家族进行鉴定和注释及基因结构与系统进化分析。结果显示,在甘蓝型油菜中鉴定出307个MADS-box基因家族成员,根据进化关系可将其分为两大类型,I型(M-type)包含α、β、γ三个亚家族,II型(MIKC-type)包括MIKCC和MIKC*两个亚家族,MIKCC可进一步分为13个小类;甘蓝型油菜A基因组染色体上分布的MADS-box基因多于C基因组。在基因结构上,MIKC-type亚家族基因序列普遍比M-type长且含有较多的外显子;M-type亚家族蛋白序列中的motif数量为2–5个,MIKC-type亚家族蛋白序列中平均含有7个motif。拟南芥(Arabidopsis thaliana)与甘蓝型油菜MADS-box基因共线性分析结果显示,全基因组复制事件对MADS-box基因家族尤其是MIKC亚家族的扩张起重要作用;MIKC亚家族基因在进化过程中受到的选择压力约为M-type的2倍,这表明MIKC-type亚家族在进化过程中被选择性保留。     

油菜种子发育早期的油体发生与调控

以甘蓝型油菜( Brassica napus L.)品种‘Westar’和‘Topas’为材料,通过超微结构观察和荧光定量PCR技术对油菜胚胎发育早期油体的发生、油体蛋白及脂肪酸合成转录因子基因的表达情况进行分析。结果显示:油体出现在油菜胚胎发育早期,在授粉9 ~ 11 d后(球形胚时期)的胚体和胚柄中均存在直径小于0. 5 μm的油体;荧光定量实验结果表明,除 BnCLO3 的表达量在整个胚胎发育阶段无明显变化外,其他油体蛋白基因 Oleosins 、 Steroleosins 和 BnCLO1 的表达量在心形胚时期就明显增多并持续增长;脂肪酸合成转录因子 BnLEC1 、 BnL1L 、 BnWRI1 和 BnFUS3 在胚胎发育阶段,基因表达规律均呈先上升再下降的趋势,但达到最高值的时间存在差异,其中 BnLEC1 最早, BnL1L 其次, BnWRI1 和 BnFUS3 较晚。研究结果表明甘蓝型油菜在球形胚时期出现油体,其结构蛋白和转录调控因子基因的表达自心形胚开始明显增多。     

应用基因芯片分析甘蓝型油菜柱头特异表达基因

以甘蓝型油菜(Brassica napus)野生型(宁油10号)及其柱头授粉功能缺失突变体FS-M1为材料,使用油菜基因表达谱芯片筛选甘蓝型油菜柱头特异表达基因。在含有16 540个基因的油菜基因表达谱芯片中(43 803探针),获得了4 410条差异表达探针,选择部分差异表达基因进行实时定量PCR,所得结果与芯片检测结果相吻合。其中,野生型较FS-M1显著上调且获得209个功能注释的探针,对应198个基因,这些特异表达的基因主要富集在水解酶、转移酶、氧化还原酶和转录因子中;涉及较大的基因家族包括:细胞色素P450基因、GDSL脂肪酶/水解酶基因、ABC转运蛋白基因、myb转录因子基因、bHLH转录因子基因、过氧化物酶家族和受体激酶基因等。推测这些基因与甘蓝型油菜柱头发育及授粉功能有关。     

不同硼效率甘蓝型油菜品种细胞壁中硼的分配

应用不同硼效率甘蓝型油菜品种 ,研究硼在细胞壁中的分配。硼主要结合在细胞壁中 ,缺硼显著提高硼在细胞壁中的分配比例。根系细胞壁硼含量显著低于叶片 ,但根系细胞壁硼占根系总硼量之比例显著高于叶片。同一品种根系及其细胞壁、老叶细胞壁硼含量受生育期影响较小 ,新叶及其细胞壁、老叶硼含量受生育期影响较大。在正常供硼条件下 ,硼高效品种根系细胞壁和叶片细胞壁硼含量均低于低效品种 ;正常和缺硼条件下 ,硼高效品种细胞壁硼占器官总硼量之比例均低于低效品种。说明硼低效品种需较多的硼构建细胞壁。     

玉米扩展蛋白Expansin基因家族定位及基因表达模式分析

扩展蛋白（Expansin）是一类能够使植物细胞壁松弛的活性蛋白,在植物生长发育过程中起着重要作用。利用PLAZA、NCBI、MaizeGDB、Uniprot、PLEXdb等基因组数据库,获得玉米Expansin家族的基因序列、染色体基因座位、蛋白质序列以及长度,构建玉米Expansin基因家族系统进化树,进行基因组织表达谱的分析。结果表明,玉米基因组中含有93个Expansin基因,分布于玉米的9条染色体上;多数Expansin具有250~300个氨基酸;玉米Expansin基因家族有40个Expansin A（EXPA）、47个Expansin B（EXPB）、6个Expansin-like A（EXLA）,未发现Expansin-like B（EXLB）;44个玉米Expansin基因在不同玉米组织中特异表达。该研究结果不仅为玉米扩展蛋白的深入研究奠定了基础,而且为其他研究人员对基因信息的获取提供了参考。     

毛竹扩展蛋白基因的鉴定及其表达分析

为全面了解毛竹中扩展蛋白的分子特征和表达模式,本研究利用生物信息学方法在毛竹基因组中共鉴定出43个扩展蛋白基因家族成员,属于4个亚家族（EXPA、EXPB、EXLA和EXLB）,分别包含18、17、7和1个成员,分布在37个Scaffold上。除PeEXPA1没有内含子和PeEXLB1含有11个内含子外,其它毛竹扩展蛋白基因的内含子为1~5个。毛竹扩展蛋白基因编码蛋白长度为91~508个氨基酸,所有的氨基酸都具有高频密码子,大部分蛋白为碱性亲水性蛋白。大部分毛竹扩展蛋白二级结构中β转角占比例最少,而β折叠占比例最大,各亚家族多数成员具有类似的三级结构。qRT-PCR结果表明,18个EXPA亚家族成员在不同组织表达存在明显差异,除PeEXPA2、PeEXPA6外其它基因表达的最高值均出现在叶片中,表明它们可能在叶片生长过程中发挥着重要作用。     

甘蓝型油菜MAP70基因家族全基因组鉴定与表达分析

采用生物信息学方法,从甘蓝型油菜（Brassica napus L.）基因组数据库中筛选鉴定MAP70s基因家族成员,对鉴定得到的BnaMAP70s基因家族成员的序列特征进行生物信息学分析,同时利用qRT-PCR方法分析该基因家族成员在不耐渍和强耐渍甘蓝型油菜品种幼苗中的基因表达水平。结果显示,本研究共鉴定得到19个BnaMAP70基因家族成员,分布在11条染色体上,可分为5个亚家族。BnaMAP70s启动子的上游存在厌氧胁迫、响应植物激素等相关元件,表明BnaMAP70s可能参与植株生长发育和渍水胁迫调控;转录水平存在品种特异性、植株部位特异性、时间特异性。q RT-PCR分析结果表明,BnaMAP70-1和BnaMAP70-4在渍水胁迫下出现表达差异,说明这两个基因受渍水胁迫的调控。     

甘蓝型油菜‘沪油15'中两个CBF类转录因子的克隆与分析

以拟南芥CBF家族转录因子AP24保守域的氨基酸序列为信息探针,搜索油莱uniGerle数据库,得到2个uniGene：Bna．2193和Bna．2260,序列拼接得到2个cDNA序列（BnaCBF-1和BnaCBF-2）。通过PCR和RT—PCR方法分别从甘蓝型油莱‘沪油15’的DNA和cDNA中克隆了上述基因。序列分析显示,克隆的BnaCBF-1-Hy15与BnaCBF—1基因序列完全一样．而BnaCBF-2-Hy15与BnacBF-2的基因序列差异很小,只有4个氨基酸位点不同,且郝没有内含子。从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性／亲水性、序列比对、进化树、功能域、二级结构、三级结构进行了预测。结果显示,‘沪油15’来源的BnaCBF-1-Hy15和BnaCBF-2-Hyl5转录因子属于AP2／ERF家族中的DREB—A1亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与atCBF1相似。     

小立碗藓扩展蛋白基因家族的鉴定与生物信息学分析

扩展蛋白(Expansins,EXP)是一类基因家族,几乎参与了植物发育的全过程,从种子萌发到果实成熟都有扩展蛋白的参与。该研究利用生物信息学的方法对小立碗藓(Physcomitrella patens) Expansin基因家族成员进行鉴定,分析了其基因结构、染色体定位以及系统发生关系。结果表明:小立碗藓基因组中含有Expansin A(EXPA) 32个、Expansin-like A(EXLA) 6个,并未发现Expansin-like B(EXLB)及Expansin B(EXPB)。扩展蛋白氨基酸序列长度在228～290 aa之间,编码蛋白质具有两个保守的结构域Pollen_allerg_1和DPBB_1。蛋白质亚细胞定位预测结果表明:运用CELLO在线工具预测发现小立碗藓中约4/5的EXP家族基因定位于细胞外;而Euk-mPLoc预测结果则显示小立碗藓EXP基因家族成员全定位于细胞外。基因结构分析表明,小立碗藓中约68%Expansin基因有含有1～3个内含子。以上结果可为深入研究小立碗藓扩展蛋白基因的分子进化与生物学功能奠定基础。     

巨桉扩展蛋白EgrEXPA8和EgrEXPA10基因的克隆和表达特性分析

为探讨扩展蛋白在桉树生长发育中的作用,以在桉树初生生长到次生生长转换转录组测序中筛选出的差异表达基因EgrEXPA8和EgrEXPA10为基础,从巨桉(Eucalyptusgrandis)中克隆了2个扩展蛋白基因EgrEXPA8和EgrEXPA10,分别编码249和244个氨基酸,属于亲水蛋白,但Egr EXPA8稳定性高于Egr EXPA10。q RT-PCR分析表明,Egr EXPA8和Egr EXPA10基因均在幼叶和茎尖组织中表达量较高,在木质部和韧皮部表达量较低;且在茎顶端初生生长阶段表达量较高,而在下部次生生长节间表达量较低,可能其主要参与巨桉的初生生长或者负调控次生生长;另外在盐胁迫、茉莉酸甲酯处理下其均被抑制表达;而在水杨酸、缺硼、缺磷处理下均上调表达。这说明EgrEXPA8和EgrEXPA10在巨桉响应逆境胁迫时起到重要作用,且呈现出相似的调控方式。     

甘蓝型油菜水苏糖合成酶基因克隆及表达分析

以甘蓝型油菜品种‘德油5号’为试材,采用RT-PCR和RACE方法首次从油菜中获得水苏糖合成酶基因cDNA全长序列,命名为BnSTS,GenBank登录号为HQ285880.1。该cDNA全长3 210bp,包含一个长为2 619bp的开放阅读框,编码873个氨基酸。通过构建原核表达载体,成功表达出预期蛋白。同源性比对结果显示,该基因编码蛋白与拟南芥STS相似性最高为82.08%。荧光定量PCR结果显示,基因表达水平与油菜种子发育过程中水苏糖含量变化具有相关性,与种子脱水耐性的获得具有时间一致性。该基因可能在种子脱水耐性形成机制中具有一定的作用。     

甘蓝型油菜A基因组候选BAC克隆的筛选及其插入片段大小分析

选择甘蓝型油菜A基因组10个连锁群上特有的85个SSR分子标记,合成其引物序列,采用四维PCR法筛选甘蓝型油菜-新疆野生油菜二体异附加系BAC文库,成功筛选到甘蓝型油菜A基因组39个BAC克隆,其插入片段介于50～300 kb之间,平均为120 kb。甘蓝型油菜A基因组10个连锁群BAC克隆的获得,对后续开展甘蓝型油菜A基因组染色体识别、基因染色体定位、遗传距离与物理距离间关系分析等均具有重要价值。     

芸薹属植物脂肪酸延长酶基因FAE1的克隆与A/C基因组的分子鉴别

通过同源序列法, 从我国大面积栽培的高芥酸甘蓝型油菜品种“中油821”和低芥酸品种“中双9号”的基因组中克隆得到脂肪酸延长酶基因, 并对它们进行了测序分析. 发现中油821 FAE1基因全长1521 bp, 没有内含子; 中双9号FAE1基因全长1517 bp. 分析白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的FAE1基因, 在DNA水平上共发现31个核苷酸变异位点(占2.03%), 在蛋白质水平上有7个氨基酸位点出现变异. 进一步分析表明, 有18个核苷酸变异是A/C基因组特异性变异, 而且95%(17/18)A/C基因组特异性核苷酸变异都是同义突变. 第1217位的核苷酸变异导致A基因组的FAE1基因不能被AvrII识别, 而C基因组的FAE1基因可以被AvrII识别. 用核酸内切酶AvrII酶切供试材料白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的FAE1基因序列, 证实甘蓝来源的FAE1基因序列可以被AvrII识别并酶切, 白菜来源的不能被AvrII酶切. 实验结果表明, 采用AvrII酶切FAE1基因序列的方法, 不仅可以识别白菜和甘蓝, 而且可鉴别甘蓝型油菜的A/C基因组. 此外, FAE1基因还可用作转基因油菜花粉漂移检测时的标记基因, 为基因漂移风险分析提供了新方法.     

甘蓝型油菜的BR响应及BnBZL2基因的功能分析

对甘蓝型油菜(Brassica napus L.)与拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)中保守的油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)信号相关基因进行对比分析,并以甘蓝型油菜品种‘沪油15’为材料,对BR信号通路相关同源基因进行了组织表达分析。结果显示,BR合成基因与信号组分在花和幼嫩种子中表达量更高;低浓度BR处理可以促进幼苗根的生长,高浓度BR处理则起抑制作用; BR合成抑制剂(Brassinozole,BRZ)处理可抑制黑暗条件下幼苗下胚轴的伸长; BR处理可以降低BR合成基因的表达水平,而BRZ处理则相反,表明甘蓝型油菜中BR信号增加能反馈抑制BR的合成。烟草(Nicotiana tabacum L.)瞬时表达实验结果发现,与拟南芥BZR1基因同源的甘蓝型油菜BnBZL2编码蛋白定位在细胞质和细胞核中,BR处理可增加BnBZL2的核定位。蛋白质免疫印迹检测结果显示,BR处理可增加去磷酸化BnBZL2的比例。本研究进一步模拟了拟南芥bzr1-1D功能获得性突变体对BnBZL2蛋白进行点突变(BnBZL2*),并构建载体转化拟南芥,黑暗条件下转基因植株幼苗对BRZ处理不敏感,提示BnBZL2*可提高转基因植株的BR信号水平。本研究结果表明甘蓝型油菜中存在与拟南芥相似且保守的BR信号通路和调控机制。     

中华猕猴桃GRAS基因家族鉴定及低温胁迫表达分析

GRAS基因家族广泛参与植物生长和逆境响应，而低温是制约猕猴桃生产和分布的重要因素之一，鉴定猕猴桃GRAS基因家族，分析其在低温胁迫中的表达情况，为猕猴桃的抗寒研究和品种选育提供理论依据。以中华猕猴桃‘红阳’基因组为参考进行GRAS家族保守结构域比对，通过对鉴定到的家族成员进行系统进化树、蛋白理化性质、基因结构、蛋白三级结构、蛋白质motif、顺式作用元件、共线性、密码子偏好性和基因表达模式等进行分析。结果表明，猕猴桃基因组共存在79个GRAS家族成员，分属于8个亚家族，且各亚家族基因、蛋白结构有所差异。顺式作用原件分析显示该家族基因参与多种植物激素、生长发育以及胁迫响应。密码子偏好性分析发现，该家族密码子第3位碱基更偏好使用嘧啶类碱基（G/T）。鉴定到6个基因可能参与猕猴桃低温胁迫过程，并进行荧光定量PCR验证了该猜测。该研究补充了猕猴桃GRAS基因家族鉴定分析的空白，为猕猴桃抗寒研究奠定分子基础。     

油菜(Brassica napus)Bna-miR1140基因启动子miR1140Pro的克隆与表达模式研究北大核心CSCD

旨在研究Bna-miR1140的表达模式及其调控机理,依据本实验室前期的油菜miRNA芯片实验结果,从油菜栽培种Westar中克隆了Bna-miR1140前体序列上游1.5 kb的片段,并进行了顺式作用元件分析,然后构建了GUS报告基因植物表达载体,通过农杆菌介导法将miR1140 pro∷GUS转化到甘蓝型油菜Westar品种中,经PCR法鉴定获得5株阳性株。对阳性株油菜T1代各组织的GUS化学染色分析表明,miR1140前体序列上游1.5 kb区域具有启动子的功能,能够驱动GUS在油菜中表达,并且GUS基因仅在叶柄及叶腋中特异性表达,说明油菜miR1140Pro为特异性启动子。     

甘蓝型油菜PGK基因的克隆与表达分析

为研究甘蓝型油菜磷酸甘油酸激酶(PGK)基因表达特性,在对拟南芥PGK基因家族生物信息学分析的基础上,通过电子克隆方法获得3个甘蓝型油菜PGK基因(BnPGK1、BnPGK2、BnPGK3)。分别设计特异引物,以甘蓝型油菜雄性不育系09A和保持系09B的cDNA为模板克隆BnPGK基因全长序列。根据获得的cDNA序列设计实时荧光定量特异引物,采用实时荧光定量PCR技术,研究油菜雄性不育系与保持系PGK基因表达差异。结果显示:BnPGK基因在甘蓝型油菜雄性不育系09A和保持系09B的根、茎、叶、花蕾中均有表达,属组成性表达。除茎中的BnPGK3外,BnPGK其它基因在根、茎、叶中的表达均表现为09A高于09B,而在花蕾中均为09B高于09A,BnPGK1和BnPGK3在09B中的表达量是09A中的2倍以上。     

芸薹属(Brassica napus,B.rapa,B.oleracea) CAMTA3基因家族的鉴定及生物信息学分析

芸薹属(Brassica)植物(甘蓝型油菜,白菜,甘蓝)是重要的经济作物,它们之间的关系可用禹氏三角表示.CAMTA是在进化过程中高度保守的一类转录因子家族,该家族成员在芸薹属植物抗逆境胁迫过程中具有重要作用.为了探讨芸薹属CAMTA3基因家族的功能,本研究利用生物信息学手段,鉴定了芸薹属(白菜,甘蓝和甘蓝型油菜)CAMTA3基因家族的8个基因,并从蛋白质的理化性质、家族进化与基因结构和上游启动子等方面进行了分析研究.分析表明,芸薹属CAMTA3基因家族8个成员在进化过程中具有较高的保守性,其亲缘关系与禹氏三角理论相符,且各成员在植物响应抗胁迫过程中占重要地位.研究结果为芸薹属CAMTA3基因家族的功能研究提供了一定的信息基础.