基于转录组数据的密花香薷SSR位点特征分析

利用MISA软件对密花香薷转录组42 362条Unigene进行SSR位点搜索,并对其SSR序列结构及分布特征进行了分析.结果表明:(1)密花香薷转录组Unigene序列中共检测到17 564个SSR重复序列,分布于11 903条Unigene上,出现频率为28.10％,平均每3 200 bp出现一个SSR位点.(2)...     

重要食药同源植物余甘子转录组微卫星特征分析

为全面了解余甘子转录组SSR位点的分布特征和变异规律,本研究利用Illumina Hiseq 4000平台对余甘子叶片转录组进行测序,通过MISA软件对获得的Unigenes进行SSR位点搜索和统计分析。结果发现9 538条包含SSR位点的Unigenes,共检测到9 991个SSR位点,平均每5.49 kB出现1个SSR。单碱基和二碱基为余甘子转录组SSR主要重复类型,分别占SSR总数的42.3%和30.79%。位于基因编码区的SSR位点共有1 731个,出现频率为0.039 SSRs/kB,优势重复类型为三碱基重复。余甘子转录组SSR中共有169种重复基元,其中所占比例最高的是A/T（42.10%）,其次是AG/CT（22.91%）和AAG/CTT（5.02%）。SSR各基元的重复次数波动于4~75次,且多数集中于4~20次。重复片段长度≥ 20 bp的SSR占21.20%,且SSR发生频率与片段长度呈显著负相关（P<0.01）,相关系数为-0.561。本研究获得的余甘子转录组SSR位点出现频率较高、分布密度较大、低级重复基元较多,重复次数较高、长片段较多,大多数SSR位点的多态性潜能较高,用于余甘子遗传多样性分析的潜力较大,为下一步余甘子转录组SSR标记的大规模开发和群体遗传学研究提供了重要的数据信息,进而为余甘子野生资源的保护和合理开发利用提供了参考依据。     

基于转录组数据的意大利蝗微卫星位点分析与分子标记开发

【目的】意大利蝗Calliptamus italicus (L.)是新疆荒漠半荒漠草原重要害虫。本研究利用已获得的意大利蝗转录组数据,鉴定其微卫星位点。【方法】使用MISA筛选SSR位点,利用Primer Premier 5设计引物,通过PCR扩增对引物进行验证。【结果】在意大利蝗转录组数据库中,共检测出156500个SSR位点,分布在126369条unigene中。其中,单核苷酸重复为60.88%,二核苷酸重复为23.58%,三核苷酸重复和四核苷酸重复分别为12.99%和2.04%。单核苷酸重复主要为A/T(44.38%),二核苷酸重复主要为AC/GT(12.99%)和AG/CT(8.05%)。基于筛选的SSR位点设计引物,随机挑选24对引物,对10个不同地理种群意大利蝗成虫DNA样品进行PCR扩增,共有6对引物扩增成功。【结论】本研究利用转录组数据发掘意大利蝗SSR位点,为意大利蝗分子标记、种群遗传及功能基因等研究奠定基础。     

基于RNA-seq数据大规模开发中华蜜蜂幼虫的SSR分子标记

中华蜜蜂是东方蜜蜂的一个亚种,也是我国的特有蜂种。本研究基于已获得的中华蜜蜂幼虫肠道转录组数据预测SSR分子标记,并进行SSR位点的信息分析和SSR引物的发掘。利用MISA软件对幼虫肠道转录组中数据组装得到的43557条unigenes进行搜索,共预测出13448个SSR位点,它们分布于7763条unigene中,其中最主要的重复类型为二核苷酸重复(58.03%),其次为三核苷酸重复(28.23%)和四核苷酸重复(9.72%)。二核苷酸重复中的基序主要是AT/AT(占总量的30.4%)。对于所有的SSR位点,利用Primer Premier 5软件成功设计出21627对引物,随机选取48对引物对5个不同来源的中华蜜蜂幼虫肠道样品进行SSR位点扩增,共有15对成功扩增出符合预期的目的片段。研究结果表明利用转录组数据大规模开发中华蜜蜂幼虫的SSR引物是可行的,本研究开发出的SSR引物为研究中华蜜蜂分子遗传学奠定了基础。     

龙眼顶芽转录组简单重复序列(SSR)标记信息分析及分子标记开发

随着新一代测序技术的发展,大量的转录组数据和表达序列标签(EST)成为开发简单重复序列(SSR)标记的可利用资源。本研究利用MISA软件筛选龙眼(Dimocarpus longan)顶芽转录组数据库序列,从114 445条龙眼转录组unigene序列中发现11 546个SSR位点,SSR出现频率为10.09%。其中1 975条unigene含有两个或两个以上EST-SSR位点,占所有SSR位点的比例为17.10%,SSR出现的平均距离为7.52 kb。从龙眼转录组SSR核苷酸基序类型来看,二核苷酸(52.11%)和三核苷酸(46.15%)出现频率最高,占所有核苷酸出现频率的99.26%。在龙眼转录组SSR中二核苷酸重复基元出现频率最高的是AG/CT(4 250个,占36.81%),三核苷酸重复基元出现频率最高的是AAG/CTT(1 109个,占9.61%)。对含SSR位点的9 571条unigene序列进行引物设计,共设计出了8 347对SSR位点特异引物。随机挑选合成50对EST-SSR引物,以‘石硖’、‘储良’、‘古山2号’、‘立冬本’等四份龙眼材料的基因组DNA为模板对这批引物进行PCR扩增、筛选,结果表明,其中21对引物能产生理想的PCR产物,有效扩增率为42%;16对引物扩增条带具有多态性,占有效引物的76.2%;16对多态性引物共扩增获得50个条带,其中多态性片段21个,每对引物平均产生1.31个多态性片段。     

两种黄连转录组中SSR位点信息分析与多态性引物开发

本研究通过对两种黄连,即黄连(Coptis chinensis Franch.)和云南黄连(C.teeta Wall.)转录组中SSR位点信息的分析,设计SSR引物,为开发新的SSR标记提供理论基础。利用MISA工具筛选黄连及云南黄连转录组测序获得的55 903和49 741条Unigenes,对其SSR位点信息进行了分析;Primer3设计SSR引物,随机选取60对引物对两种黄连,每种20株,共40株进行多态性扩增分析。黄连和云南黄连转录组分别搜索到4 071和4 041个SSR位点。两种黄连中二核苷酸和三核苷酸重复皆是主要的类型,分别占总SSR的87.71%和87.58%。黄连中,二核苷酸重复基元出现最多的为AG/CT,共953个,占总SSR的23.40%,三核苷酸重复基元出现最多的为AAG/CTT,共746个,占总SSR的18.3%;在云黄连中,AG/CT和AAG/CTT分别为934(23.10%)和773(19.10%)。随机选取60对引物进行PCR扩增,其中12对(20.00%)表现出多态性差异。利用Populations软件作图,将40个材料分为2类。两种黄连转录组中SSR位点出现频率高,类型丰富;大量的SSR为其遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了丰富的候选分子标记。     

基于转录组数据的桔小实蝇微卫星位点信息分析

以桔小实蝇为材料,从其转录组数据库中筛选功能微卫星(EST-SSR)序列,并进行SSR位点的信息分析.共获得1890个EST-SSR位点,可用于引物设计的SSR数为1296个.EST-SSR平均分布频率为1/10.21 kb,但这种分布频率在不同重复类型SSR之间相差很大.其中,三碱基重复SSR在该种昆虫的EST-SSR中出现的频率最高,结合其他文献推断三碱基重复可能是所有昆虫EST-SSR的优势类型.本文共设计了42对桔小实蝇EST-SSR引物,其中有18对引物可以扩增得到预期大小的条带.最后,探讨了基于转录组数据发掘昆虫SSR的前景和挑战,以及进行转录组EST-SSR筛选时应注意的问题.
     

珍贵树种火力楠转录组SSR特征分析

为了全面了解珍贵乡土树种火力楠转录组SSR位点的分布及序列特征,为火力楠遗传资源的保存和合理开发利用提供遗传学资料,为同属植物及近缘种SSR标记的开发及遗传研究提供便利。利用Illumina Hiseq2000高通量测序平台对火力楠进行转录组测序,再通过MISA软件对测序所得Unigenes进行SSR位点的发掘和分析。分析的结果显示发现含SSR的序列21 218条,共得到27 379个SSR,出现频率为28.08%,平均约每3 kb出现1个SSR。单碱基和二碱基重复为火力楠SSR主要重复单元类型,分别占SSR总数的42.18%和35.66%,所有重复基元共85种,其中(A/T) n所占比例最高41.65%,然后是(AG/CT)n(29.47%)、(AAG/CTT)n (6.83%)和(AC/GT)n (4.11%)。在SSR和CDS的交集基因中,共发现24 668个SSR位点,其中3 805个位于编码区,出现频率为0.099 SSR/kb,而非编码区为0.287 SSR/kb,在基因编码区中出现频率最高的是三碱基重复(2 030, 53.35%)。在SSR序列长度方面,长度变化范围最大的为单碱基重复SSR,其次是二碱基重复。火力楠转录组SSR位点的出现频率高、分布密度大、基元类型丰富、重复次数较高、长片段较多,具有较高的多态性潜能,用于遗传分析的潜力很大,能满足该物种的保护遗传学研究。     

星天牛转录组SSR位点特征分析

【目的】为了获得星天牛Anoplophora chinensis的SSR位点信息并开发其SSR分子标记技术,进一步为其遗传多样性以及综合治理提供理论依据。【方法】利用MISA软件,对星天牛转录组数据进行简单重复序列(SSR)位点筛选与分析;使用Primer3软件设计引物,采用PCR扩增以及电泳检测,筛选SSR引物,开发星天牛SSR分子标记技术。【结果】在9 325条unigene序列中共挖掘到2 360个SSR位点,出现频率为25.31%,涉及SSR位点序列1 758条,发生频率为18.85%。星天牛转录组中SSR的主要重复类型为单碱基重复,其次是三碱基重复,分别占总数的79.03%、12.54%。在核苷酸重复类型中,A/T基元种类数目最多,所占比例高达99.30%。SSR长度为10-11 bp的占比最高,为56.10%;重复次数为10次的数量最多,SSR位点数为1 188(50.34%)。重复次数和长度的分析结果对SSR位点的多态性获得了初步验证。在随机挑选序列设计的60对引物中,53对扩增产物达到预期大小,候选引物可用率高达88%,可在今后的研究中利用。【结论】本文对星天牛SSR位点的信息分析以及引物的设计与验证将有助于星天牛基因挖掘、种群遗传结构、遗传多样性、进化关系和综合治理的研究。     

基于转录组的白沙蒿SSR分子标记的开发

[目的]利用转录组数据开发白沙蒿的SSR分子标记,探索其分布特点并对SSR引物进行有效性检测。[方法]以9个不同样品白沙蒿转录组数据为基础,利用MISA软件对1kb以上的Unigenes进行筛选;把重复序列单元相同、重复次数存在差异、侧翼序列长度完全相同的SSR位点作为引物合成的标准,采用PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对其有效性进行初步验证。[结果]在20 149条Unigenes中共检测出5 692个SSR位点,发生频率为22.95%,平均每隔6.66 kb出现1个位点。优势重复单元单、三、二核苷酸分别占总SSR位点的52.09%、28.30%和17.38%。经过验证筛选出具有多态性且扩增条带清晰的引物18对。[结论]印证了利用白沙蒿转录组测序产生的Unigene信息可作为开发SSR标记的有效来源,且开发的有效SSR引物可用于后续群体的相关研究中。     

山地虎耳草和棒腺虎耳草转录组SSR和SNP分析

利用Illumina HiSeqTM2000对山地虎耳草和棒腺虎耳草进行转录组测序,分析和比较其SSR和SNP特征。结果表明:山地虎耳草63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00kb出现一个SSR位点;棒腺虎耳草60 972条Unigene序列中含有4 542个SSR,发生频率为7.45%,有85种重复基元,平均每10.40kb出现一个SSR位点,略低于山地虎耳草。山地虎耳草和棒腺虎耳草转录组序列的SSR优势基元均为三核苷酸重复。2个物种的转录组SSR以5~10次的较低重复次数为主,长度主要集中于12~30bp,具有较高的多态性。山地虎耳草和棒腺虎耳草中分别获得118 424个和112 006个SNP位点,编码区的SNP位点分别占30.40%和28.59%,且在编码SNP中同义突变所占比例(30.27%、28.48%)远高于非同义突变(0.13%、0.11%)。比较发现,2个物种的各项检索结果基本一致,推测与选取的组织部位、组织的发育阶段以及物种的亲缘关系有关。     

华仁杏幼果转录组SSR信息分析及其分子标记开发

为了解华仁杏微卫星(SSR)分布规律,开发EST-SSR引物,为华仁杏种质资源评价与辅助育种提供有效的鉴定标记。本研究采用生物信息学方法对华仁杏幼果转录组SSR位点的数量、频率、分布特征进行了统计分析;利用转录组数据进行了SSR引物的筛选和开发,并利用开发出的引物对华仁杏29个无性系进行了多态位点检测和鉴定。结果表明:华仁杏幼果EST-SSR的分布频率为19.21%,重复单元的重复次数分布在5~24次之间,优势重复基序为单核苷酸、2核苷酸、3核苷酸,分别占总SSR的19.81%、46.47%、32.49%。参试的139对引物中有39对引物可扩增出目标序列,其中24对引物可检测出多态性位点,占参试引物总数的17.27%。24对引物在29个华仁杏无性系中共检测出了170个等位基因位点,多态性信息含量(PIC)介于0.33~0.87之间,平均为0.64,其中高多态性引物19条,占多态性引物比例的79.2%。本研究对华仁杏转录组SSR信息进行了分析,并开发出了19对高多态性SSR引物,5对中多态性引物,为华仁杏种质资源评价及分子标记辅助育种提供了基础。     

基于转录组测序的缺须盆唇鱼微卫星标记特征分析

缺须盆唇鱼(Placocheilus cryptonemus)是云南省怒江流域特有的一种高原经济鱼类.通过在Illumi-naHiSeq 2500平台上对缺须盆唇鱼进行转录组测序(RNA-seq)分析,利用MicroSAtellite (MISA)微卫星识别工具对1～6个碱基重复、碱基数在10 bp以上的微卫星进行鉴定.结果 表明,在缺须盆唇鱼转录组中共发现分布在36764条Unigene上的30500个SSR位点,包含序列的SSR数量为18078,发生频率为49.17％.获得的单纯SSR中共有215种重复基元,其中单核苷酸重复基元类型数量最多,为88个,六碱基重复的SSR最少,其他的重复从二、三、四、五、六碱基开始,SSR的形成呈现递减规律.SSR位点的重复次数主要发生在6～10次和11～15次重复之间,发生频率分别为38.59％和36.02％.本研究对缺须盆唇鱼的转录组数据进行测序鉴定,得到了数量较多的SSR标记,同时对得到的缺须盆唇鱼SSR数据特点进行归纳总结.本研究不仅提供了一个有价值的转录组资源,而且建立了一套SSR标记,可以为缺须盆唇鱼的基础研究、应用研究提供有效的分子标记.     

基于转录组数据的齿缘刺猎蝽微卫星分子标记开发

【目的】齿缘刺猎蝽Sclomina erinacea是我国猎蝽科天敌昆虫常见种类,其不同地理种群存在明显形态差异。本研究旨在利用已经获得的齿缘刺猎蝽转录组数据筛选微卫星位点,为齿缘刺猎蝽种群遗传多样性和遗传分化研究开发可靠的微卫星分子标记。【方法】基于高通量测序技术平台Illumina HiSeq^TM 2000获得齿缘刺猎蝽转录组数据(42 215条unigenes),利用MISA软件进行搜索发掘SSR标记;利用Primer Premier 3软件设计SSR引物,从中随机选取54对SSR引物,利用PCR技术在中国齿缘刺猎蝽9个地理种群上进行验证。【结果】利用MISA软件搜索到微卫星位点2 395个,它们分布在2 107条unigenes上,其主要重复类型是三核苷酸重复(占总SSR的44.43%),其次是二核苷酸重复(占总SSR的40.08%),再次是四核苷酸重复(占总SSR的12.94%)。利用Primer Premier 3 软件成功设计出2 000余对SSR引物。随机选取的54对引物对9个齿缘刺猎蝽不同地理种群进行的SSR位点PCR扩增结果表明,共有16对引物较好地扩增出目的片段。【结论】研究表明利用齿缘刺猎蝽转录组数据可以大量发掘微卫星分子标记。本研究为进一步开展齿缘刺猎蝽的种群遗传学研究奠定了基础。     

中间锦鸡儿转录组EST-SSR标记系统性识别与引物筛选

旨在对中间锦鸡儿转录组数据库EST信息进行SSR系统性识别和初步验证,为进一步SSR分子标记开发提供依据。对Hi Seq2000测序技术获得的中间锦鸡儿转录组Unigenes进行SSR位点搜索,共获得45 706个SSR位点,出现频率为10.38%,平均4.30kb出现一个SSR位点。SSR重复类型以单核苷酸重复序列基元为主,所占比例为56.47%;二核苷酸、三核苷酸重复序列基元的数量所占比例分别是20.56%和21.04%;其他数量的基元所占比例仅为1.9%。多核苷酸重复类型中最多的为2核苷酸重复AG/CT;其次为3核苷酸重复AAG/CTT。针对EST-SSR位点随机挑选了150对引物,通过琼脂糖凝胶电泳进行PCR验证,其中有79对能获得扩增条带,21对引物扩增出单一条带,比例为14.0%。     

基于转录组测序的波纹唇鱼SSR和SNP多态特征分析

波纹唇鱼是一种极度濒危的珍贵观赏鱼和高价值食用鱼,全面了解其转录组中SSR和SNP位点的分布及序列特征,可有助于开展波纹唇鱼遗传资源的保存和合理开发利用。利用二代高通量RNA-seq测序技术对波纹唇鱼进行转录组测序,通过MISA和Samtools对所得Unigene进行SSR与SNP位点的发掘与分析。结果显示,在150 218条Unigene序列中共发现22 428个SSR,出现频率为14.93%,平均约5.35 kb出现1个SSR。波纹唇鱼SSR的主要重复单元类型为单碱基和二碱基重复,分别占SSR总数的61.32%和19.12%,除复合类型以外,所有重复基元共65种,其中(A/T)n所占比例最高(55.64%),(AG/CT)n和(AC/GT)n分别占8.31%和6.80%。22 427个SSR处于CDS中,其中1 773个位于编码区。SSR重复次数集中在5～15次,序列平均长度为13.3 bp。3 438个SSR位点共获得669对候选引物。随机选取50对验证,发现21对可扩增出与预期产物长度大小一致的特异性条带,其中5对在4个波纹唇鱼个体间具有多态性。在Unigene中共发现245 373个SNP位点,发生频率为1/490 bp,其中转换类型发生频率显著高于颠换类型,转换类型中A/G (33.61%)和C/T (32.51%)发生频率最高,颠换类型中则是A/T的最高(11.12%)。波纹唇鱼转录组中SSR和SNP位点非常丰富,可为波纹唇鱼遗传多样性分析、亲缘关系鉴定与遗传资源开发利用等方面提供丰富的基础数据信息。     

扇贝“渤海红”与墨西哥湾扇贝转录组SSR信息分析及unigene功能注释

墨西哥湾扇贝是中国南方海域养殖的重要经济贝类,由于连续累代养殖,种质退化严重,扇贝“渤海红”为山东省近几年培育的国家级新品种,性状优势明显。课题组从北方引进扇贝“渤海红”拟与南方墨西哥湾扇贝进行育成杂交,创新墨西哥湾扇贝种质资源。本研究利用MISA软件对两种扇贝转录组测序获得的unigene序列进行检索,开发SSR标记,同时对SSR位点的生物学信息进行分析,对含SSR的unigene进行功能和KEGG代谢通路注释,并利用primer5软件设计SSR引物。结果显示:扇贝“渤海红”转录组中平均8.27 kb出现1个SSR,出现频率为0.11,检索到的11 512个SSR分布于9 681条unigene上,涉及到137种重复基元,二核苷酸SSR数最多(5 469),占比为46.66%,其次是单核苷酸(4 039),占比为34.46%。墨西哥湾扇贝转录组中,共发现12 241个SSR位点,分布于10 362条unigene序列上,平均8.78 kb出现1个SSR,出现频率为0.10,共包含140种重复基元,SSR重复类型以二核苷酸为主,占SSR总数的45.61%。两种扇贝转录组SSR的重复次数主要集中在5～10次。A/T、AT和ATC/ATG分别是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的优势重复基元。两种扇贝转录组中共筛选出33个含SSR的生长相关unigene,且被注释到KEGG代谢通路的含特异SSR的unigene全部富集在新陈代谢和遗传信息处理两大一级通路中。两种扇贝SSR标记的开发,为杂交双亲遗传差异分析、杂交子代鉴定和杂种优势预测等奠定了分子辅助育种基础。     

基于转录组数据的荔枝蒂蛀虫SSR位点信息分析

荔枝蒂蛀虫Conopomorpha sinensis Bradley是专一性危害我国荔枝和龙眼的重要害虫。简单重复序列标记(Simple sequence repeat,SSR)为短串联重复序列或微卫星标记,其在荔枝蒂蛀虫偏嗜选择寄主的遗传进化机制研究和荔枝蒂蛀虫综合治理中具有重要意义。本研究基于高通量测序获得的荔枝蒂蛀虫转录组数据,利用MISA软件从68996条转录组unigenes结果中发掘出10521个SSR位点,出现频率为15.25%。荔枝蒂蛀虫转录组中SSR的主要重复类型为单碱基重复,占SSR总数的66.22%。其次是三碱基重复,占SSR总数的24.94%。在发现的33种重复基元中共筛选获得8种优势重复基元,其中A/T在单碱基重复基元中所占的比例达98.55%。基于筛选的SSR设计的9对引物中,有4对引物得到扩增预期大小的条带。荔枝蒂蛀虫SSR位点的信息分析将为探究荔枝蒂蛀虫种群遗传结构、遗传多样性和进化关系、害虫综合治理等研究提供重要科学依据。     

山地虎耳草转录组SSR信息分析

利用MISA（MicroSatellite）软件对山地虎耳草转录组拼接序列进行微卫星位点信息分析,为后期SSR标记的开发和物种遗传多样性检测提供候选序列。结果发现,在拼接得到的63 763条Unigene序列中含有4 622个SSR,发生频率为7.25%,有110种重复基元,平均每10.00 kB出现一个SSR位点。山地虎耳草转录组序列的SSR主要集中在三核苷酸重复（55.50%）,其次为二核苷酸重复（30.23%）。二核苷酸重复和三核苷酸重复中的优势重复基元分别为AG/TC和AAG/TTC。二核苷酸重复基元的重复次数类型最多,跨度最大,具有更高的多态性,三核苷酸次之,而四、五、六核苷酸重复类型很少。山地虎耳草转录组SSR以5~9次重复为主,且SSR数量随着重复次数的增加逐渐减少,基序长度主要集中于12~30 bp,多态性均在中等以上。     

茄子EST-SSR分子标记的鉴定及多态性分析

为了加快茄子(Solanumm elongena L.)分子遗传学研究和分子标记辅助育种,对其开展转录组测序,采用软件MISA(MicroSAtellite)对茄子转录组中的SSR位点进行搜索,共检测出5 562个SSR位点,分布于3 438条Unigene中,出现频率为13.23%,平均分布距离为9.73 Kb。三核苷酸和二核苷酸重复出现频率占优势,分别有3 546个和1 270个,分别占总SSR的63.75%和22.83%。利用Primer 3.0设计引物,随机选择其中20 bp以上SSR序列的100对引物进行合成,92对引物实现有效扩增,占100对SSR引物的92%,从有效扩增引物随机选取30对引物对29份茄子材料进行扩增及多态性评价,30对均有多态性差异。通过UPGMA作图,供试的29份不同的茄子材料被划分为2类。基于茄子转录组测序开发的EST-SSR标记具有较高的可用性,为茄子种质鉴定、亲缘关系分析及遗传图谱构建等提供更丰富的标记来源。