VEGF受体KDR胞外区基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

VEGF(血管内皮细胞生长因子,Vascular Endothelial Growth Factor)是刺激内皮细胞增殖和新生血管形成的最重要因子,与多种实体瘤的生长和转移密切相关。应用其可溶性受体阻断它的病理作用是一个非常有前景的课题。将VEGF受体KDR胞外区前三个Loop 969碱基对的cDNA片段克隆到杆状病毒表达载体pFastBacI,与杆状病毒表达载体Bacmid同源重组后,转染昆虫细胞SF9,获得重组杆状病毒并证明了目的基因的高效表达。经Western blot证实表达产物的特异性。经ELISA和体外生物学活性检测表明表达产物可阻断VEGF的生物学活性,抑制鸡胚CAM血管的生长。     

人生长激素基因在哺乳动物培养细胞中的导入与表达

将小鼠金属硫蛋白I(MT—I)启动子置换人生长激素(hGH)基因的启动子,构建成MT—hGH嵌合基因。当与疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因(tk)的质粒共转染小鼠L—tk-细胞,在tk⁺转化细胞中所整合的MT-hGH基因可被重金属镉诱导。获得可表达和分泌hGH的细胞株,其中一株hGH的产率为2．5μg／10⁶细胞／24h．所产生的hGH分子量为22000道尔顿,表明小鼠L一tk+细胞株能对外源hGH基因所产生的mRNA进行正确的加工并能删除激素原的信号肽。     

eNOS基因在JAR细胞中的表达

本研究应用脂质体介导转染技术将人内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转入绒癌细胞系JAR细胞 ,获得转染阳性细胞。用RT PCR和Westernblot技术从基因及蛋白水平对表达产物进行鉴定 ,结果显示 :有较高水平的mRNA转录和特异目的蛋白表达 ;通过免疫细胞化学方法证实 ,转染eNOS基因的阳性JAR细胞与对照组相比 ,有外源eNOS蛋白高表达 ;但是一氧化氮合酶 (NOS)活性及其催化产物NO并没有直接升高 ;使用A2 3187处理则能增加NOS的活性 ,说明在转染的JAR细胞中 ,NOS没有被直接激活     

HBsAg基因在酵母细胞中的表达

先前从酵母染色体[DNA中得一个作用较强的启动基因片段,使HBsAg基因在其控制下,构建了大肠杆菌一酵母细胞穿梭质粒。这种质粒转化的酵母细胞能生产和装配HBsAg颗粒。经放射免疫分析,超离心沉降研究和电子显微镜观察,酵母产生的HBsAg颗粒与人血清中的HBsAg颗粒十分相似。     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许—奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

细菌基因在哺乳动物细胞中的表达

纯系繁殖的编码黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶的大肠杆菌(E.coli)基因,同一系列的由SV40DNA衍生的不同载体构成重组体DNA。用这样的重组体DNA转染培养的猴肾细胞,结果产生的转化体能合成大量的易于测定的大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶。而且,把这种细菌基因引进到嘌呤核苷酸合成特性缺陷的人莱许-奈恩(Lesch-Nyhan)细胞,这些细胞的此种生理缺陷便得到了纠正。     

大豆油体与EGF融合基因的克隆及其在红花种子中的表达

目的：旨在建立一种在红花油体中表达EGF的转基因植物的方法。方法：通过PCR技术把大豆油体基因（DDoil）与EGF构建成融合基因,克隆至植物表达载体pCAMBIA1390R中,构建成植物表达载体p1390Do-EGF,然后转化进农杆菌 LBA4404 中用于侵染红花外植体,通过甘露糖筛选培养基培养可获得红花转化苗。通过PCR、实时荧光相对定量RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot分析目的基因的表达情况,通过MTT法检测EGF的促细胞增殖活性。结果：PCR结果显示,红花叶片中能检测到EGF基因;实时荧光相对定量RT-PCR结果显示,在红花种子中EGF能成功实现转录;SDS-PAGE和Western blot检测证明,在转基因红花种子中能有效表达出EGF,并具有其原有的免疫原性,MTT法实验结果表明EGF具有促进balb/c 3T3细胞增殖的生物活性。结论：大豆油体和EGF融合基因已经成功转化进红花细胞的基因组中,并实现了EGF外源蛋白在红花种子油体中的表达,为EGF蛋白的产业化生产探讨了一种新的生产途径。     

EGFP基因在粉纹夜蛾细胞中的高效表达

绿色荧光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ,ＧＦＰ）基因是从一种水母体内分离的新型报告基因（ｒｅｐｏｒｔｇｅｎｅ）（Ｃｈａｌｆｉｅ等,１９９４）,其编码的、由２３８个氨基酸组成的ＧＦＰ是一种对光稳定的可溶性蛋白,在长波紫外光或蓝光激发下就能发出绿色荧光,而不需添加任何酶或底物,因而检测十分方便快速,无背景干扰。同时ＧＦＰ也是目前唯一能在异源细胞内表达后自发产生荧光的蛋白质。ＥＧＦＰ基因是由野生型ＧＦＰ基因经人工改造后更适合于在真核细胞中表达的突变体,基因编码区长７１７ｂｐ,编码…     

人乳铁蛋白基因在昆虫细胞中的表达

将人乳铁蛋白ｃＤＮＡ（ｈＬＦｃ）克隆在质粒ｐＢａｃＰＡＫ８的ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ位点,构建成转移质粒８ｈＬＦｃ。该质粒ＤＮＡ与ＡｃＮＰＶ ＢａｃＰＡＫ６病毒株基因组ＤＮＡ经共转染草地夜峨培养细胞Ｓｆ２１,在培养的贴壁细胞中挑出空斑,经过３轮纯化,结合斑点杂交筛选,获得重组病毒。用蛋白质免疫印迹法检测到在重组病毒感染的Ｓｆ－２１细胞中存在乳铁蛋白基因的表达产物。酶联免疫检测结果表明：重组人乳铁蛋白在     

基因在B 细胞淋巴瘤细胞中的表达及意义

目的：探讨基因CHFR在B细胞淋巴瘤Raji 细胞中的表达,以及基因甲基化对Raji 细胞增殖和凋亡中所产生的影 响。方法：体外培养人B细胞淋巴瘤细胞株Raji 细胞,用不同浓度的去甲基化试剂5- 氮杂-2 脱氧胞苷处理Raji 细胞株,通过 RT-PCR 检测CHFR 基因表达水平的变化,通过MS-PCR 检测基因甲基化变化,CCK 法及流式细胞术检测Raji 细胞增殖 及凋亡变化。结果： 基因在Raji 细胞中出现弱表达,经去甲基化试剂处理后基因表达水平增高,随药物浓度增加Raji 细胞的抑制率及凋亡率增高。结论：5-氮杂-2 脱氧胞苷可以恢复基因表达水平,抑制Raji 细胞的增殖,促进凋亡。基 因在细胞增殖起负向调控的作用。     

乙肝病毒表面抗原基因在人参细胞中的表达

为获得表达乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的人参细胞系,构建携带HBsAg基因的植物细胞表达载体pBIBSa,采用以农杆菌LBA4404感染的方法,经G418筛选后得到13株具有抗性的人参细胞.提取基因组DNA进行PCR反应,其中8株得到约700bp的HBsAg基因片段;提取mRNA进行RT-PCR反应,其中6株得到约700bp的HBsAg基因片段;用ELISA方法检测HBsAg,6株均为阳性.每克人参细胞中最高含HBsAg184 ng,占细胞可溶性蛋白的0.009%.免疫组化切片染色显示HBsAg主要分布在细胞膜上,少量位于细胞核中.这些结果表明人参细胞整合了HBsAg基因,并能稳定表达HBsAg.     

植物的光调节基因在受体细胞中的表达-植物遗传工程的一个新进展

在植物分子遗传学和遗传工程研究中,根癌农杆菌的Ti质粒是个重要的载体。实验已经证明,它可将外源的功能基因插入到植物细胞并整合到植物细胞核的基因组中。在某些情况下,这些细胞再生成植株,而插入的基因可以通过减数分裂转给种子遗传下来。     

用杆状病毒载体在家蚕细胞中表达HBeAg基因

以ＰＣＲ技术扩增含有ＰｒｅＣ信号肽序列及完整的ＨＢｅＡｇ基因的序列（即ＨＢｃＡｇ基因５′端４４７ｂｐ）,在５′端加上合适的酶切位点,克隆到家蚕核多角体病毒转移载体ｐＢｍ０３０上,与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞,空斑纯化后得到多角体基因失活的重组病毒。ＥＬＩＳＡ法测定表明培养液上清中ＨＢｅＡｇ效价达１∶３２０００,细胞内ＨＢｅＡｇ效价为１∶２０００,培养液及细胞内的ＨＢｃＡｇ含量极低（＜１∶１６０）。研究结果表明,ＢｍＮ细胞能正确识别与切割ＨＢｅＡｇ信号肽序列,所表达的ＨＢｅＡｇ效价高,纯度好,明显优于大肠杆菌表达系统     

bFGF、NGF、EGF及其受体在人胚神经管早期发育中的表达

研究bFGF、NGF、EGF及其受体在人胚神经管早期发育中的表达。方法 应用免疫组织化学方法和图像分析。结果显示bFGF和NGF的表达时序不同,bFGF阳性细胞出现较早,在所检测在各个发育阶段均呈阳性表达,而NGF出现较晚,随着胚龄增加,免疫阳性着色逐渐增强,bFGF分布较NGF广泛,而EGF在所检测的各个发育阶段均呈阴性。flg、TrkA、EGFR表达时序和分布相似,三者在所检测的各个发育阶段均阳性。结果表明NGF和bFGF均通过其特异性受体介导,在胚胎神经管形成和分化的不同阶段发挥着重作用,EGF及其受体的作用有待进一步研究。     

EGFP基因在中国明对虾原代培养细胞中的导入和表达

本文以我国重要水产养殖动物中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）贴壁培养和悬浮培养的血细胞、植块培养的类淋巴器官（Oka器官）细胞和卵巢细胞为材料,通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导的转染（脂染）和电穿孔法等多种方法进行了导入EGFP基因的实验。结果表明,通过脂染可以成功地将质粒DNA导入悬浮培养的血细胞、植块培养的Oka器官细胞和卵巢细胞,并使报告基因EGFP得到表达。     

EGF受体Ⅲ型突变体在肿瘤治疗中的研究进展

EGFRⅢ型变异体(或EGFRvⅢ)是一种新型的肿瘤特异性靶点。EGFRvⅢ是正常分子经过遗传学重排成为肿瘤特异性靶点的最好例证。由于仅在肿瘤细胞中发现EGFRvⅢ,可以应用它设计靶向性药物选择性治疗肿瘤,而不影响正常细胞,避免传统治疗中所见的副作用。以表达EGFRvⅢ的细胞为靶点的治疗方式有三种:1)作为毒性抗体或修饰病毒的直接靶点,2)利用EGFRvⅢmRNA的特异性核酶或EGFRvⅢ及其下游信号传导分子的特异性抑制剂进行治疗,3)利用EGFRvⅢ触发免疫反应。概括介绍了肿瘤特异性标记物EGFRvⅢ在肿瘤治疗中的研究进展。