1．3倍体HBV YIDD变异株真核表达载体构建及鉴定

构建HBV YIDD拉米夫定耐药株1．3倍全基因真核表达载体,为进一步探讨乙肝病毒变异株的生物学特性及筛选抗病毒药物奠定基础。参考GenBankHBV序列设计并合成一系列引物,以临床证实为拉米夫定耐药的病人HBV DNA为模板,通过PCR扩增得到HBV全基因组并克隆至pGEM—T Easy载体中,经测序证实聚合酶基因存在YIDD变异,然后以该病人的HBV全基因组为模板构建1．3倍全基因HBV—YIDD变异真核表达载体pcDNA3．1（＋）-1．3HBV。通过PCR扩增,酶切及测序证明pcDNA3．1（＋）-1．3HBV表达载体构建成功,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HBV—YIDD变异的细胞模型提供材料。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含有天然完整的乙型肝炎病毒(HBV)X基因序列的真核表达载体,观察其在肝癌细胞株中的表达。方法:设计并合成HBV X基因的引物,用PCR方法从含完整HBV全基因的HepG2细胞中扩增X基因序列,并将其连接到真核表达载体pVAX-1上,酶切、PCR鉴定;用Triton X-114去除质粒内毒素后,采用电穿孔法将重组质粒pVAX-HBV X和空质粒pVAX-1分别转染SMMC-7721细胞,RT-PCR法检测HBV X基因mRNA的表达,Western印迹鉴定HBV X蛋白(HBx)的表达。结果:酶切和PCR鉴定证实pVAX-HBV X载体中包含完整的HBVX基因片段,该重组质粒转染的SMMC-7721细胞中HBV X基因mRNA及HBx蛋白的表达稳定。结论:构建了HBV X基因的真核表达载体,为X基因及其编码蛋白的生物学功能的研究提供了可靠的基因材料。     

HBV prec/c shRNA慢病毒真核表达载体的构建和鉴定

目的构建针对HBV prec/c区的shRNA真核表达载体psiHBV,感染HepG2 2.15细胞后观察其对HBeAg表达的抑制作用,为探讨防治HBV感染的新措施提供实验依据。方法针对HBV prec/c基因序列,构建shRNA表达载体psiHBV1、psiHBV2和无关序列psiHBVc。psiHBV与慢病毒辅助系统质粒共转染293T细胞组装慢病毒颗粒后,感染HepG2 2.15细胞,RT-PCR检测prec/c mRNA的转录,微粒子化学发光分析仪(MEIA)检测细胞上清和细胞裂解液中HBeAg表达。结果重组质粒双酶切和测序鉴定与预期结果相符合;组装慢病毒颗粒感染HepG2 2.15细胞后,prec/c mRNA转录降低;与对照组比较,HBeAg的表达水平也显著降低,病毒颗粒对HBeAg表达的抑制作用差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建针对HBVprec/c的慢病毒载体psiHBV1、siHBV2,慢病毒介导的RNA i能抑制HBV表达,为应用RNA干扰技术治疗乙型肝炎提供了实验依据。     

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-1 gag基因,并与真核表达载体pCI-neo连接,构建含有中国流行株HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.经XbaⅠ/SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1 核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG.通过脂质体将pCI-neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物.结果表明所构建的HIV-1 核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础.     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunode- ficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的世界广泛流行、严重危害人类健康的疾病.     

Cpn0308基因真核载体构建及鉴定

目的:构建Cpn0308基因真核表达重组质粒,为肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae,Cpn)核酸疫苗的研制做准备。方法:用PCR技术从Cpn AR39株基因组DNA中扩增Cpn 0308基因,经双酶切、连接等反应,重组入pcDNA3.1/HisA真核表达载体,转化到感受态细胞,再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选,酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果:从Cpn AR39株基因组DNA中扩增出特异的Cpn 0308基因,约400bp;酶切、重组、转化、筛选鉴定出pcDNA3.1/HisA-Cpn0308重组质粒;序列测定证实与GenBank登录的肺炎衣原体Cpn AR39株Cpn0308基因一致。结论:功地构建了pcDNA3.1/HisA-Cpn0308重组质粒,为肺炎衣原体核酸疫苗的研制奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

HBV PreS2＋S／INF—α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBV PreS2 S和INF-α融合基因的真核表达载体HBV PreS2 S/INF-α并在真核细胞中进行表达,应用重叠延伸剪切技术（splicing by overlapping extension,简称SOE）经两次PCR获得嵌合基因片段S2S／IFN－α,回收后直接克隆到pcDNA3.1 V5/His TOPO TA克隆载体,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α然后用指质体法转染Vero E6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定证明连续正确;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN-α成功构建及在Vero E6细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据。     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

肾综合征出血热(HFRS)是一类由汉坦病毒引起的以发热、出血和急性肾功能损伤为特征的急性病毒性传染病.     

HCV全长基因真核表达载体的构建及其细胞内表达

本实验成功构建了HCV全长基因的真核表达载体pCI-HCVFL,转染HepG2细胞后经免疫荧光和免疫组化法分别检测到结构基因区(C)和非结构基因区(NS3)病毒蛋白的表达,该载体可用于建立HCV转基因细胞模型以及进一步开展有关HCV复制与表达的深入研究。     

中国株HIV-1外膜蛋白真核表达载体的构建与表达

To construct the eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 gene and observe its expression in vitro, the recombinant expression vector pVAX1GP120 was constructed by inserting the gp120 gene into the eukaryotic expression vector pVAX1. The pVAX1GP120 was transfected into Vero cells by lipofectamine and the expressed product was detected by indirect immunofluore- scence.Restriction enzymes digestion analysis and sequencing results revealed that the recombinant expression vector pVAX1GP120 has been constructed successfully. The indirect immunofluorescence result showed green fluorescence on the membrane of transfected cells. The constructed eukaryotic expression vector of HIV-1 gp120 can be expressed in vitro, which lay the foundation for the further study of HIV-1 DNA vaccine.     

隐匿性乙肝病毒表面抗原Y100C位点替换的表达及其作用研究

目的:探讨隐匿性乙肝病毒表面抗原Y100C位点突变与乙肝病毒隐匿性感染的相关性.方法:分别构建含有隐匿性乙肝病毒表面抗原Y100C位点替换基因和野生型表面抗原基因的表达载体,转染HeLa细胞,培养一定时间后用ELISA方法检测细胞中HBsAg的表达情况,并进行统计学分析.结果:含有点突变基因的重组载体转染的细胞培养上清和提取物中HBsAg的表达量均低于含有野生型基因表达载体转染的细胞,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:HBsAg蛋白Y100C位点替换降低了HBsAg的合成及分泌,可能参与隐匿性异性肝炎的发生和发展,下一步的研究可结合HBV全基因的研究,以期更好的阐明隐匿性乙型肝炎的机制.     

中国株HIV-1核心蛋白真核表达载体的构建与表达

运用限制性内切酶XbaⅠ、SalⅠ对pKSGAG进行双酶切,获得HIV-lgag基因,并与真核表达载体pCI—neo连接,构建含有中国流行株HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI—neoGAG。经XbaⅠ／SalⅠ双酶切及测序鉴定证实,成功地构建了HIV-1核心蛋白真核表达载体pCI-neoGAG。通过脂质体将pCI—neoGAG转染入p815细胞,G418筛选4周后,使用间接免疫荧光方法检测表达产物。结果表明所构建的HIV-1核心蛋白真核表达载体能在p815细胞中高效表达,为下一步进行HIV-1 DNA疫苗研究奠定了基础。     

猪GM-CSF基因的克隆及其真核表达载体的构建

采用PCR方法从猪外周血液淋巴细胞cDNA中扩增出与预期设计大小相符的GM-CSF基因特异性条带,PCR产物经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,插入到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GM-CSF.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性.将构建好的真核表达质粒转染到山羊胎儿成纤维细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功.pIRES2-EGFP-pGM-CSF真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GM-CSF蛋白功能以及进一步将其开发为高档疫苗佐方剂奠定了基础.     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

To improve the effect of the gene immunization against Hantaan virus, we constructed the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) containing Hantaan Virus S gene coding region and CpG motif by cloning S gene segment with CpG motif into eukaryotic expression vector pTARGET^TM.After conformed by enzyme analysis, the recombinant expression vector pTARGET-hans(ISS) was transferred into Vero-E6 cells by electroporation and the transient expression of Hantaan virus nucleocapsid protein was detected by indirect immunofluorescence assay(IFA). In some transferred Vero-E6, the green fluorescence was showed, thus we can conclude that the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) was successfully constructed and expressed in vitro,which will lay a foundation for further animal vaccination.