甜菜ATP合酶β亚基基因atpB的克隆、序列分析及进化

atpB基因编码ATP合酶β亚基,是光合作用中的重要基因。ATP合酶是生物体内能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化和光合磷酸化反应。利用植物叶绿体基因组在进化过程中高度保守的特点,根据已知植物烟草、水稻和菠菜等的叶绿体基因组全序列,设计并合成了一对引物,以甜菜叶绿体DNA为模板,PCR扩增得到包含atpB 完整基因（GenBank登录号为 DQ067451）在内的一段序列,测序与序列分析表明：该克隆片段全长2 293 bp,其中包括有1 497 bp的编码区序列,推测编码498个氨基酸。同源性比较,该克隆基因与烟草、菠菜、油菜、水稻atpB基因的核苷酸序列同源性分别为90.92%、95.79%、87.71%和86.37%,推测的氨基酸序列同源性分别为94.58%、97.19%、92.17%和91.97%。同时,建立了几种植物的氨基酸序列系统进化树。     

小苍兰ACC合成酶FhACS1基因的克隆与序列分析

以小苍兰品种“上农金皇后”为研究对象,利用PCR技术和染色体步移技术首次克隆到了ACC合成酶FhACS1基因的全长序列和编码序列。结果表明：FhACS1基因全长为2 576 bp,包含长为433 bp的5′端非编码区序列（5′-UTR）以及长为373 bp的3′端非编码区序列（3′-UTR）;开放读码框（ORF）长度为1 371 bp,推定编码457个氨基酸。分析表明,该基因包含3个内含子和4个外显子。序列分析结果显示,FhACS1推导蛋白具备ACS蛋白的7个保守结构域;在氨基酸水平上,FhACS1与小果芭蕉的同源性最高（85%）;系统进化分析表明,FhACS1与孟宗竹BaACS（BAC56949.1）、水稻OsACS1（AAA33888.1）、小果芭蕉MaACS1（AAQ13435）的亲缘关系最近。在其已知启动子区域,发现有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素响应的顺式元件,以及对干旱和低温等逆境胁迫响应的顺式元件。     

长春花Crlea基因的克隆及原核表达初步分析

晚期胚胎丰富（Late Embryogenesis Abundant, LEA）蛋白是植物在干旱胁迫下响应并被描述为具有潜在的抗旱功能的一类重要的抗旱蛋白。通过建立干旱胁迫下长春花（Catharanthus roseus）的cDNA文库并进行测序筛选分析,首次分离得到Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）全长基因。该基因具有492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸,其中偏性氨基酸含量占总蛋白的55.9%。同源性分析表明该假定蛋白与胡萝卜（Daucus carota）LEA DC3 的同源性达69%。亲水性分析表明具有极强的亲水性。为进一步验证CrLEA蛋白的功能,构建了Crlea基因的原核表达载体并在大肠杆菌中对其表达进行了分析。结果表明,原核载体成功的表达了CrLEA蛋白,亲水性实验及热稳定性实验表明CrLEA蛋白具有极强的亲水性和热稳定性。     

丹参咖啡酸-O-甲基转移酶基因(SmCOMT1)的克隆及其分析

依据丹参转录组数据库得到的咖啡酸-O-甲基转移酶基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR方法从丹参分离得到一个新的COMT基因,命名为SmCOMT1(GenBank注册号为JF693491）。该基因cDNA全长1 158 bp,包含一个长为1 095 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸。SmCOMT1 gDNA序列长2 275 bp,包含4个外显子和3个内含子。序列分析结果表明,SmCOMT1编码的多肽具有COMT的序列保守元件,与同科植物罗勒COMT编码的多肽高度同源,同源性达到89%。系统进化树分析表明,SmCOMT1与双子叶植物的COMT亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,SmCOMT1基因在丹参不同组织器官中差异表达,其中茎中的表达量最高,并且其表达受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导,显示SmCOMT1基因可能在植物防御反应中发挥作用。     

普通烟草鸟氨酸转氨酶基因Ntδ-OAT的克隆与表达分析

鸟氨酸转氨酶是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸的关键酶,对植物适应逆境胁迫起关键作用。本研究根据其已知保守序列设计兼并引物,从普通烟草品种中烟14中克隆到一条425bp的中间片段,应用RACE方法设计特异性引物扩增得到5′末端和3′末端cDNA序列,经BLAST验证,首次从普通烟草中克隆到了鸟氨酸转氨酶基因,命名为Ntδ-OAT,其GenBank登录号为GU144571。该基因cDNA全长为1781bp,共编码477个氨基酸。系统进化树分析显示,Ntδ-OAT基因的进化符合传统的生物学分类,主要功能域在生物进化中保守性较高。Real-time PCR分析表明,Ntδ-OAT基因受干旱、高盐、低温、ABA等多种胁迫处理的诱导表达,可能参与普通烟草体内抗渗透胁迫过程。     

油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。     

纽荷尔脐橙CCS基因的克隆与分析

利用RT-PCR技术从纽荷尔脐橙果实cDNA中分离出辣椒红／辣椒玉红素合成酶（Capsanthin/Capsorubin synthase,CCS）基因（Ccs）全长。该片断长为1619bp,编码503个氨基酸。BLAST比较其氨基酸同源性发现,该序列所推导的氨基酸与已知的甜橙CCS完全一致,与胡萝卜和辣椒的CCS,以及马铃薯新黄质合成酶（neoxanthin synthase,NSY）有70％的同源性。此外,与番茄和柑橘等的番茄红素环化酶也有50%~70%的同源性。半定量RT-PCR分析表明,Ccs在纽荷尔脐橙果实成熟过程中呈先上升后下降的表达趋势,期间9月份的表达量最高。     

南京椴HMGR基因的克隆和功能验证

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR）是植物萜类代谢中甲羟戊酸途径的关键酶,本研究运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,首次从珍稀植物南京椴中克隆出HMGR的全长基因TmiHMGR,其长度为2 160 bp,包含一个1 758 bp的开放阅读框,其推导蛋白TmiHMGR编码585个氨基酸残基,相对分子量为62.9 kD,pI为6.11。将TmiHMGR与其他植物HMGR氨基酸序列构建进化树,结果显示TmiHMGR与苹果的HMGR聚为一枝。采用半定量RT-PCR分析TmiHMGR在根、茎和叶中的表达情况,结果表明该基因在茎中的表达量最高,根和叶中的表达量相对较弱。验证功能的颜色互补实验结果显示,TmiHMGR能够使代谢流明显朝类胡萝卜素合成的方向进行,说明TmiHMGR在萜类产物生物合成中是一个重要因子。     

番茄泛素蛋白基因LeEBF1和LeEBF2的克隆表达分析

通过RACE和RT-PCR方法从番茄中克隆了LeEBF1（EIN3 binding F-box protein 1）和LeEBF2（EIN3 binding F-box protein 2）的全长cDNA序列,两个基因LeEBF1、LeEBF2全长分别是2 866和2 891 bp,对序列的分析表明,它们的开放阅读框分别是1 911和1 995 bp,编码区编码637和665个氨基酸残基,在氨基端含保守的F-box区域和在羧基端有14个亮氨酸重复单位,通过BLAST软件和DNAMAN分析表明这两个基因的氨基酸序列与拟南芥EBF1和EBF2有58.6％相似,同时又与其他物种的EBF蛋白的F-box区域比较有24.4％到73.2％的相近。Northern杂交指出：LeEBF1与LeEBF2在野生型和Nr的幼叶中的表达量高于成熟叶;当在果实发育期,LeEBF1与LeEBF2在青果期的表达量相比其他时期要弱。初步结果表明,LeEBF1与LeEBF2可能在番茄的生长发育中起着重要的作用。     

京大戟hmgr基因家族3个保守区片段的克隆与分析

采用RT-PCR技术以及两条简并引物,以京大戟嫩叶总RNA反转录的cDNA为模板扩增3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的保守区片断。序列分析表明,所克隆的cDNA保守区序列长度为458 bp,而且同时得到了三个不同的核苷酸序列,分别命名为hmgr1、hmgr2、hmgr3。与之前得到的京大戟hmgr保守区片段的核苷酸序列的同源性分别为98.03%、96.29%、78.38%,推断的相应氨基酸序列的同源性分别为98.68％、96.71%和85.53%。推断这可能是该基因家族中的三个新的成员。而且同源序列比对发现,由这三个核苷酸序列推断的氨基酸序列与其它植物都有较高的同源性。种系进化树分析表明hmgr3与hmgr1、hmgr2及以前报道的京大戟的hmgr之间有较大的差别。     

朵丽蝶兰 MADS-box 基因 DtpsMADS1 的克隆与表达特性简

植物MADS-box基因家族编码高度保守的转录因子,参与了包括花器官发育和开花在内的多种发育进程。为阐释兰科植物成花的分子调控机制,根据MADS-box基因保守序列设计简并引物,用RACE方法从朵丽蝶兰花葶中克隆到1个MADS-box家族基因,该基因cDNA全长960 bp,包含37 bp 5′UTR,一个738 bp的开放阅读框(ORF)和185 bp 3′UTR,共编码245个氨基酸。序列和系统进化树分析表明,该基因与其他植物的MADS-box基因具有很高的同源性,属于AP1/FUL-like亚家族,命名为DtpsMADS1,GeneBank登录号为JQ065097。实时荧光定量PCR检测结果显示：DtpsMADS1具有明显的组织表达特异性;在根和叶中,DtpsMADS1在花前期和花后期表达量较高;苗期和盛花期表达量较低;DtpsMADS1在花葶中的表达趋势与根和叶相似;而在花器官中,DtpsMADS1只有痕量表达。由此推断,DtpsMADS1可能参与开花进程调控,而不参与花器官的形态建成。     

白木香 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶 A 合酶(AsHMGS)基因的克隆与表达分析简

以白木香（Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg）茎cDNA为模板,采用反转录PCR及RACE技术分离得到HMGS基因cDNA全长。序列分析表明该基因序列全长1 831 bp,共编码465个氨基酸,推导的蛋白质分子量为51.4 kD,理论等电点6.25,命名为AsHMGS。推导的AsHMGS蛋白质序列具有植物HMGS酶的典型结构,并预测出HMGS酶的活性中心。系统进化树分析表明,AsHMGS蛋白与拟南芥、琴叶拟南芥、芥菜的相应蛋白相似度最高,其次为人参、喜树和野茶树。荧光定量PCR结果显示,茉莉酸甲酯能诱导白木香AsHMGS的表达。     

海南岛巴西橡胶和香蕉cat相关基因的克隆及分析

根据GenBank上已有的植物cat基因序列,设计一对兼并引物。在海南岛采集香蕉、巴西橡胶、黄灯笼辣椒、菠萝、甘蔗、番木瓜等作物的叶片并提取总RNA,反转录成cDNA,PCR进行同源克隆。结果获得了巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因,而未获得其它4种作物cat相关基因。序列分析发现,巴西橡胶cat-1和香蕉的cat-2基因开放阅读框(ORF)都为1 479 bp,编码492个氨基酸,GenBank登陆号分别为HQ660587和HQ660588。生物信息学软件分析巴西橡胶CAT-1和香蕉CAT-2蛋白的三级结构分别与Exiguobacteriu Oxidotolerans(PDB code：2j2mA0)和Pseudomonas Syringae(PDB code：1m7sA)相似。构建系统发育树表明巴西橡胶CAT-1与蓖麻CAT-1氨基酸序列(Ricinus communis:XP_002521709.1)同源性最高,为92.1%;香蕉CAT-2与油棕CAT-2氨基酸序列(Elaeis guineensis:ACF06566.1)同源性最高,达90.9%。     

荧光定量PCR检测干旱胁迫下长春花Crlea基因的相对表达

首次从长春花中克隆了Crlea（Crlea for Catharanthus roseus late embryogenesis abundant）的全长基因,采用荧光定量PCR方法对干旱胁迫下长春花叶片和根部Crlea基因的表达模式进行监测,结果表明,在0.5～8 h的胁迫时间中,叶片和根部的Crlea基因表现出相似的积累模式。长春花Crlea基因的表达随着胁迫时间的延长而表达增强。在叶片中,在6 h和8 h的干旱处理后,Crlea基因表达显著提高,分别是未处理材料的9.984和20.431倍。在根部, 在8 h的处理后,Crlea基因的表达量显著提高（2.831倍于对照)。初步结果表明Crlea基因的表达没有组织特异性,并且为干旱胁迫正调控。     

慈竹C3H基因克隆及其生物信息学分析

香豆酸-3-羟化酶(C3H)是调控植物木质素生物合成的关键酶,本文以慈竹为材料,利用RT-PCR技术克隆慈竹C3H基因,并对其进行生物信息学分析,为通过基因工程手段降低工业用竹木质素含量奠定基础。结果表明,该cDNA序列全长为1 581 bp,编码区为1 539 bp,编码512个氨基酸,蛋白分子量为58.33KD,等电点为9.09;氨基酸序列和结构分析显示C3H有一个保守区域,即P450结构域。系统进化分析表明,该基因与毛竹和水稻的C3H基因具有很高的同源性。慈竹与毛竹和水稻C3H基因编码蛋白为亲水性蛋白,这三种编码蛋白很可能定位在内质网(膜)上,其编码蛋白的二级结构及三级结构都含有丰富的α-螺旋和无规卷曲,β-转角和延伸链的含量较少,都含有2个相对保守的无序化区域。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为JF693629,可能与慈竹木质素的生物合成有关。     

白桦肌动蛋白(Actin)基因全长cDNA克隆与序列分析

以白桦(Betula platyphylla Suk.)次生木质部为材料,用改良CTAB方法提取总RNA。根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出Actin基因全长序列。该基因cDNA全长1 785 bp,序列分析表明,该基因编码区1 134 bp,编码377个氨基酸,5′非编码区157 bp,3′非编码区495 bp。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上。此基因已在GenBank注册（EU588981）。根据高等植物肌动蛋白相似性构建了进化树,表明白桦肌动蛋白与蓖麻肌动蛋白之间的亲缘关系最为密切,在进化中分化时间最为接近。     

千里光肌动蛋白基因（Actin）的生物信息学及功能分析

肌动蛋白（Actin）是广泛存在于高等植物中的组成型表达蛋白质,与细胞分裂、细胞运动、细胞信号转导等功能密切相关。为明确肌动蛋白性质与功能的关系,本研究从千里光全长cDNA文库中分离得到Actin基因。序列分析结果表明：该基因长度为1 481 bp,编码360个氨基酸残基的多肽,与甘草Actin基因编码的氨基酸序列（GenBank登录号：ABW71681.1）的同源性最高,达96%;预测蛋白质的分子量为40.02 kDa,理论等电点为5.85;结构分析发现,螺旋结构和无规则卷曲构成Actin二级结构的主要组分;三级结构预测发现,Actin具有4个结构域;蛋白系统发生树发现,与甘草和鹰嘴豆的亲缘关系较近。本研究认为,高等植物Actin可能参与基因的转录调控,其氨基酸突变位点未对功能结构域产生影响。     

藜磷酸肌醇5-磷酸酶基因(CaP5P)的表达分析和胁迫响应检测

植物通过多种信号途径感知外界环境变化,从而引发一系列的信号级联反应,其中磷脂信号途径起着重要的作用。本研究从藜盐胁迫差减文库中获得了一个EST05序列,利用RT-PCR检测了其在非生物胁迫下表达趋势,显示EST05序列在非生物胁迫下的表达有升高。随后利用RACE技术获得其全长编码序列,测序结果显示其与蓖麻(Ricinus communis) 的磷酸肌醇5-磷酸酶基因(P5P)的同源性达56%,遂将其命名为CaP5P。最后过量表达CaP5P在拟南芥中初步验证了功能,转基因植株表现对盐胁迫耐受性降低的趋势,呈现负调控的特征。本研究对磷酸肌醇5-磷酸酶基因功能的初步研究为磷脂信号途径中负调控组分的分析提供了参考依据。     

番茄 DEAD-box RNA 解旋酶基因 SlDEAH1 的克隆及表达分析简

DEAD-box RNA解旋酶是一种特殊的RNA分子伴侣,参与了RNA代谢,包括前体RNA剪接、核糖体合成、RNA降解以及基因表达,并对植物的发育和抗性等也具有重要作用。根据已报道的拟南芥DEAD-box蛋白,通过同源比对,在NCBI据库中筛选得到一个DEAD-box RNA解旋酶同源蛋白,命名为SlDEAH1,并根据其基因序列设计特异引物,应用RT-PCR方法从野生型番茄（Solanum lycopersicum）AC⁺⁺中克隆得到了该基因的全长编码区序列。利用生物学网站、软件及实时荧光定量PCR方法,对其进行生物信息学、表达模式、胁迫及激素处理分析。结果表明：SlDEAH1包括2 073 bp的开放阅读框,编码690个氨基酸残基,其编码蛋白有9个保守结构基序,其所涉及到的ATP结合、ATP水解及RNA结合等功能对于解旋酶活性是至关重要的;表达模式分析表明SlDEAH1基因可能在野生型番茄萼片、叶片发育及果实成熟方面起到重要作用;高温、低温、脱水、伤害、盐胁迫不同程度的诱导了SlDEAH1的表达,但在根中该基因的表达受盐胁迫抑制;ABA、ACC、IAA、GA₃、MeJA和ZT均不同程度诱导了SlDEAH1的表达,其中ABA诱导效应最为明显。这些结果为进一步研究SlDEAH1在番茄发育和胁迫响应中的功能奠定了基础。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。