P53家族新成员——P73基因

Ｐ5 3基因的突变 ,失活及缺失与 5 0 %的人类肿瘤发生有关 .最近 ,又发现一新“Ｐ5 3样”抑癌基因Ｐ73,定位于1ｐ36 2 1ｐ36 3,由 13个外显子及 12个内含子组成 ,该基因编码的蛋白质在结构和功能上均与 ｐ5 3蛋白相似 .Ｐ73基因转录剪切可产生多种同种型 ｐ73蛋白α ,β,γ及δ .ｐ73α,β低水平表达具广泛性 ;在外周血淋巴细胞、原始角质细胞及不同肿瘤细胞株和白血病中可检测到 ｐ73γ及δ .正常人类组织中 ｐ73低表达 ,很多肿瘤细胞却高表达 ｐ73,研究表明对于癌变细胞最普遍的是 ｐ73的过表达而不是丢失 :ｐ73蛋白过表达发生在胸腺癌…     

p53的两种结合蛋白：53BP1和53BP2

ｐ５３基因是一种广谱的肿瘤抑制基因,其产物ｐ５３为一多功能的转录调节因子,可以发挥调节细胞生长、细胞凋亡和ＤＮＡ修复的作用。在人类肿瘤已发现多种ｐ５３基因的点突变,但突变不是ｐ５３蛋白质丧失功能的唯一途径。胞内蛋白可能影响其活性和功能。５３ＢＰ１和５３ＢＰ２是ｐ５３在胞浆中的两种结合蛋白。本文阐述了有关这两种蛋白质的研究进展。     

细胞辐射抗性关基因的研究进展

电离辐射能够诱导细胞一系列基因的表达,与辐射抗性相关的基因如ｐ５３抑癌基因、癌基因、ＤＮＡ损伤修复相关以及影响细胞生长分化多种调控基因等,通过参与调节细胞周期,促进细胞ＤＮＡ损伤修复和抑制细胞凋亡等多种途径,最终使得细胞的辐射抗性增加。目前人们对其中一些基因的作用机制已有所了解,而对更多的基因的作用机理尚不清楚。认识细胞辐射抗性相关基因的表达调控和生物功能对阐明辐射抗分子机制至关重要。     

p38蛋白激酶在热损伤诱导单核细胞Raw264.7凋亡中的作用

为探讨ｐ３８蛋白激酶在热损伤诱导单核细胞株Ｒａｗ ２６４．７凋亡中的调控作用．应用流式细胞检测术、透射电镜技术、ＤＮＡ 凝胶电泳、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、激酶活性测定检测ｐ３８蛋白激酶在热损伤诱导细胞凋亡中的作用．结果显示,热损伤后５ ｍ ｉｎ,ｐ３８即被激活,３０ ｍ ｉｎ 时达到最高水平,然后逐渐下降,２ ｈ 达基底水平;热损伤后３ ｈ 细胞凋亡率开始明显增高,ｐ３８蛋白激酶活性增高是细胞凋亡发生之前的事件;进一步观察了ｐ３８特异性抑制剂ＦＨＰＩ对细胞凋亡的影响,发现ＦＨＰＩ可以抑制热损伤诱导的细胞凋亡．上述结果提示,ｐ３８参与介导热损伤诱导的Ｒａｗ ２６４．７细胞凋亡．     

p53基因mdm2基因在肿瘤细胞中的相互调控作用

ｍｄｍ２（ｍｕｒｉｎｅ－ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ２）最初是在一种可致瘤的小鼠在纤维细胞中发现的。该基因编码一种锌指蛋白,可与Ｐ５３蛋白酸性活化区结合,抑制Ｐ５３介导的转录活性阻止Ｐ５３诱导凋亡的作用。Ｐ５３基因是一种重要的抑癌基因,该基因编码一种ＤＮＡ结合磷蛋白,在调节细胞增殖和促进细胞凋亡过程中起着重要的作用。Ｐ５３也可调节ｍｄｍ２基因的表达。ｐ５３蛋白水平的升高级相应剌激ＭＤＭ２蛋白水平的升     

p53蛋白多肽片段在大肠杆菌中的表达

在所有研究过的人体肿瘤组织或细胞中，ｐ５３似乎是突变频率最高的一个基因，研究和检测ｐ５３基因及其编码产物的变化将具有很需要的意义，我们将野生型ｐ５３基因编码３＇端７０３ｂｐ的ｃＤＮＡ片段插入到大肠杆菌表达载体ｐＢＶ２２０，得到了一个重组体表达质粒ｐＲＲ３３，经热诱导表达，用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法证实ｐ５３蛋白多肽在大肠杆菌中得到了表达，它不仅可用于抗ｐ５３蛋白抗体的制备，而且也可用     

大鼠催乳素基因真核细胞可表达性质粒的构建及应用研究

７３５ｂｐ的ＰＲＬｃＤＮＡ片段从质粒ＰＲＬ－ＳＰ６５＃１中回收后,用粘性末端连接法将其重组到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３上,筛选出正向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ和反向连接重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＡＳ。将重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬｓ和空载体ｐｃＤＮＡ３分别转入ＮＩＨ３Ｔ３细胞系,用Ｇ４１８筛选出阳性细胞后与未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２的情况下,用原位杂交的方法,分别用ＰＲＬｃＤＮＡ探针和原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓｃＤＮＡ探针进行检测,未转染的ＮＩＨ３Ｔ３细胞在加Ｅ２和不加Ｅ２时都几乎无催乳素基因的表达,同样,转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞也无ＰＲＬ的表达,而转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ的ＮＩＨ３Ｔ３细胞则有大量的ＰＲＬ基因的表达,与对照组相比有显著差异（Ｐ＜０．０１）。正常和转入空载体的ＮＩＨ３Ｔ３细胞有一定程度的原癌基因ｃ－Ｈ－ｒａｓ的表达,当分别加入Ｅ２和转入重组体ｐｃＤＮＡ３－ＰＲＬＳ后,ＮＩＨ３Ｔ３细胞中的ｃ－Ｈ－ｒａｓ基因表达水平都显著升高（Ｐ＜０．０５）。     

血管平滑肌细胞增殖与Cdk抑制蛋白p27的表达

ｐ２７蛋白是细胞周期素依赖性激酶（Ｃｄｋ）抑制蛋白家族中的一种,主要对外部促进或抑制细胞增殖的信号起反应。本研究应用流式细胞仪（ＦＣＭ）双标记的方法观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）、血管加压素（ＡＶＰ）和血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣｓ）细胞周期百分比和ｐ２７蛋白表达量的影响。静止状态培养的ＶＳＭＣｓ加入ＡｎｇⅡ,ＡＶＰ,ＰＤＧＦＢＢ后,在不同时间收集细胞,用碘化丙啶（ＰＩ）标记细胞ＤＮＡ,以确定细胞所处的周期。用ｐ２７蛋白的单抗和标记了ＦＩＴＣ的二抗标记细胞,通过流式细胞仪测定被激发出的荧光量来确定细胞ｐ２７蛋白表达的相对量。结果显示,ＡｎｇⅡ刺激ＶＳＭＣｓ增生,其蛋白含量增加了４３６％（Ｐ＜００１）,但不抑制ｐ２７蛋白的表达;ＡＶＰ可轻度抑制ｐ２７的表达,有轻度促进ＶＳＭＣｓ增殖和增生的作用（Ｐ＜００５）;ＰＤＧＦ明显抑制ｐ２７的表达,引起细胞增殖。本研究结果提示,ｐ２７蛋白抑制ＶＳＭＣｓ通过Ｇ１期进入Ｓ期,是抑制ＶＳＭＣｓ增殖的重要调节因子。     

反义p73基因诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡

目的：构建表达重组反义p73基因的重组逆转录病毒,观察其对人肝癌细胞HepG2的凋亡诱导活性,并进一步探讨其作用机制。方法：克隆p73基因的反义片段,重组法构成逆转录病毒载体pBabe-p73（pBP73）,以脂质体Lipofectamine2000将其转染293A细胞进行病毒包装;将逆转录病毒感染人肝癌细胞HepG2,用MTT法检测细胞生长抑制情况,Western blotting检测p73的表达;再分别用琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡;最后检测p53,caspase-3和bcl-2蛋白的表达变化。结果  重组质粒pBP73经鉴定连接正确,其转染293A细胞后上清液中可得到病毒,滴度达5×107pfu;MTT检测见pBP73病毒组48和72h细胞抑制率高于对照组（45.1% vs. 5.3%,69.5% vs.17.3%,均p<0.05）。琼脂糖凝胶电泳出现典型梯形条带;流式细胞仪检测出现凋亡峰,于转染48h后达最高峰,其凋亡百分率高达20.47%;p73蛋白高表达组p53和caspase-3蛋白的表达亦有显著升高（p<0.05）,但bcl-2蛋白未见表达差异。结论：成功构建了p73逆转录病毒,反义p73基因在体外能够有效地诱导人肝癌细胞HepG2的凋亡,其可能机制是通过激活caspase-3而发生作用。     

白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡通路的探究

研究发现白色念珠菌诱导小鼠胸腺细胞凋亡与白色念珠菌上调小鼠血清ＴＮＦ α水平、胸腺细胞ｃａｓｐａｓｅ 3的活性及ｂａｘ ,ｐ5 3基因表达有关。尾静脉注射 4× 10 6白色念珠菌 ,于 2 4ｈ处死小鼠 ,用流式细胞仪检测发现白色念珠菌组小鼠胸腺细胞凋亡百分率 (2 3.6 3± 1.85 ) %显著高于正常对照组 (1.87±0 .81) %,Ｐ <0 .0 1。ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳结果显示 ,白色念珠菌组呈现典型的凋亡“梯状带” ,而正常对照组无“梯状带”出现。ＥＬＩＳＡ方法检测小鼠血清ＴＮＦ α水平结果发现 ,正常对照组小鼠血清ＴＮＦ α小于 2 5ｎｇ/Ｌ ,而…     

毛细血管扩张性共济失调突变蛋白在细胞凋亡过程中被Caspase┐3降解

新近的研究揭示：ｃａｓｐａｓｅ蛋白酶在细胞凋亡中起着死亡执行者的重要功能．一些蛋白相继被证明在细胞凋亡中可被ｃａｓｐａｓｅ特异切割,其中参与ＤＮＡ损伤修复过程的聚ＡＤＰ核糖聚合酶（ＰＡＲＰ）以及ＤＮＡ依赖的蛋白激酶（ＤＮＡ－ＰＫ）,在细胞凋亡过程中被ｃａｓｐａｓｅ选择性切割具有特殊的功能意义．为探索与ＤＮＡ－ＰＫ催化亚基有较高同源性,含有ｃａｓｐａｓｅ切割位点,且功能上目前也被认为是感受ＤＮＡ损伤和参与信号传导途径的ＡＴＭ（Ａｔａｘｉａｔｅｌａｎｇ－ｉｅｃｔａｓｉａｍｕｔａｔｅｄ）蛋白,是否在凋亡过程中也可被切割而降解？应用体外转录与翻译系统获得ＡＴＭ蛋白的ＰＩ３Ｋ结构域,同时通过建立无细胞反应体系获得含ｃａｓｐａｓｅ活性的细胞抽提液,将两者在体外共同保温．结果发现：ＡＴＭ蛋白与ｃａｓｐａｓｅ－３能免疫共沉淀,ＡＴＭ蛋白的ＰＩ３Ｋ结构域可被ｃａｓｐａｓｅ－３特异切割,并观察到辐射诱发细胞调亡中ＡＴＭ蛋白的降解．从而进一步证实了ＤＮＡ损伤修复的抑制,促进细胞凋亡的发生．     

细胞凋亡相关基因研究进展

细胞凋亡研究已成为当今国内外研究的新热点,本就近年来有关与细胞凋亡相关的基因或因子研究的进展做一综述,着重阐述了ｂｃ１－２、ｍｙｃ、ｐ５３和ＡＰＯ－１／ＦａｓＴＧＦβ１等对细胞凋亡的影响和作用,以期有助于进一步提示细胞凋亡的分子机理。     

Epstein—Barr病毒膜抗原基因免疫的研究

将Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒（ＥＢＶ）膜抗原（ＭＡ）ＢＬＬＦ１基因,插入含有ＣＭＶ启动子的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３下游ＢａｍＨＩ位点,构建成真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＭＡ。将纯化的ＤＮＡ注射Ｂａｌｂ／ｃ小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗ＥＢ病毒ＭＡ特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用（ＡＤＣＣ）,特异性Ｔ淋巴细胞增生性反应及细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）杀伤作用。基因免疫与基因－蛋白     

利用GFP示踪细胞内源性P53活性检测DNA损伤

ＤＮＡ损伤的检测对预防癌症和遗传病等非常重要。采用分子克隆技术,将报告基因—绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）置于ＳＶ４０基本启动子调控下,构建成对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ。在ＳＶ４０基本启动子上游插入寡核苷酸Ｐ５３ＲＥ,构建成示踪载体ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ。转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,以ＧＦＰ示踪细胞内源性Ｐ５３的转录激活活性。紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理转化细胞使ＤＮＡ损伤,诱导细胞内源性Ｐ５３的表达。用激光扫描共聚焦成像系统（ＬＳＣＩＳ）对细胞进行红、绿、蓝三色光融合成像,并测定ＧＦＰ经４８８ｎｍ激发后发出的绿色荧光光密度,验证ＧＦＰ示踪Ｐ５３的特异性。ｐ５３ＲＥ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＲＥＧ经紫外线照射或Ｈ２Ｏ２处理后,ＧＦＰ的表达增高,处理后１ｈｒ光密度即达到最高水平,随后逐渐降低。血清“饥饿”—非ＤＮＡ损伤处理的３Ｔ３－ＲＥＧ细胞,以及经紫外和Ｈ２Ｏ２处理的对照载体ｐＳＶ－ＧＦＰ转化细胞３Ｔ３－ＳＶＧ,ＧＦＰ的表达无明显增强。实验表明：ＧＦＰ示踪内源性Ｐ５３转录激活活性用于检测ＤＮＡ损伤有很高的灵敏度和特异性,适宜推广应用。     

生长素结合蛋白cDNA的克隆及其在烟草中的表达

基于拟南芥内质网生长素结合蛋白基因的ｃＤＮＡ序列,设计合成了Ａｐ５和Ａｐ３两个引物,应用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增了拟南芥的ＡＢＰ基因。将该基因克隆在植物表达载体ｐ３５ＳＳＩＮ的３５Ｓ启动子必Ｎｏｓ３‘端之间,得到植物表达载体ｐ３５ＳＥ。通过农杆菌介导的方法对烟草ＳＲ１进行了转化,由分子杂交等检测证明,生长素结合蛋白基因已在烟草中表达,同时转基因烟草后代对生长素的敏感性明显增加。     

p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化

为了研究错义突变对ｐ１６功能的影响,应用ＰＣＲ体外定点突变方法对ｐ１６ｃＤＮＡ进行体外定点突变,并将野生型和突变型ｐ１６ｃＤＮＡ克隆于ｐＧＥＸ－５Ｔ载体,在大肠杆菌中经ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定确证表达．而后用谷胱甘肽－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析纯化野生型和突变型ｐ１６融合蛋白．得到了第４８位密码子ＣＣＧ（Ｐｒｏ）→ＣＴＧ（Ｌｅｕ）突变的ｐ１６－Ｐ４８突变体,并在大肠杆菌中表达了４２ｋＤ的ＧＳＴ－ｐ１６和ＧＳＴ－ｐ１６Ｐ４８Ｌ融合蛋白．最后经纯化得到了野生和Ｐ４８Ｌ突变的ｐ１６融合蛋白     

CD3ε和PMA对fas基因转录调控作用的研究

研究了ＣＤ３ε和ＰＭＡ对细胞凋亡基因ｆａｓ的转录调控作用．根据已知的人ｆａｓ基因５＇上游序列设计引物,用ＰＣＲ法从人胸腺细胞基因组ＤＮＡ中扩增出ｆａｓ５＇上游长为４４６ｂｐ的启动子片段．将此片段定向克隆到以虫荧光素酶为报告基因的真核细胞表达载体ｐＸＰ２中．经限制性内切酶酶切鉴定及序列测定分析表明此重组表达质粒ＤＮＡ的结构和序列正确．用此质粒（ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ）瞬时转染人ＪｕｒｋａｔＴ淋巴细胞,分析报告基因的表达水平．结果表明ｆａｓ基因上游－５０６到－６０的区域有弱启动子活性,约是阴性对照的１．５倍．抗ＣＤ３ε抗体和ＰＭＡ处理均可增强ｆａｓ启动子的活性,促进报告基因的表达,其虫荧光素酶活性分别是未经处理的ｐＸＰ２－ｆａｓｕｐ转染细胞的１．７倍和３．３倍,但二者没有协同作用．ＰＫＣ的抑制剂ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ和ＰＴＫ的抑制剂ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎＡ可抑制ＰＭＡ诱导的ｆａｓ基因转录,使虫荧光素酶基因的表达降至未用ＰＭＡ处理的水平．但ＰＴＫ的另一种抑制剂ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ可与ＰＭＡ发挥协同作用,上调ｆａｓ基因的转录,使虫荧光素酶活性增加到５倍．这些结果为阐明ＣＤ３ε及ＰＭＡ介导Ｔ淋巴细胞激活和凋亡的分子机制     

转录因子NF-κB p50基因的克隆、表达及抗p50抗体的制备

利用ＤＮＡ重组技术,将转录因子ＮＦ－κＢｐ５０基因片段插入ｐＧＥＸ－２Ｔ质粒载体,经ＤＮＡ序列分析证明克隆的正确性．将重组的ｐＧＥＸ－２Ｔ／ｐ５０转化入大肠杆菌ＪＭ１０９,表达出ｐＧＥＸ－２Ｔ／ｐ５０融合蛋白．经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测证实表达产物对抗ｐ５０ｃ的抗体呈特异性反应,表明克隆的正确性,并成功地应用纯化的ｐ５０蛋白制备了免疫血清．为进一步对ＮＦ－κＢ的功能进行研究打下了良好的基础     

依赖P53的P53R2基因在细胞周期检验点对损伤DNA的修复作用

1 .ｐ5 3基因及Ｐ5 3蛋白ｐ5 3基因最初被认为是一个普通的癌基因 ,其产物的作用是刺激肿瘤细胞的生长。但后来发现原先研究的ｐ5 3基因只是野生型ｐ5 3基因的突变体 ,只有突变型ｐ5 3基因的产物才能刺激不正常细胞 (如癌细胞 )的生长 ,而野生型ｐ5 3基因的产物对肿瘤则有抑制作用 ,正常的ｐ5 3基因原来是一个抑癌基因。经长期研究发现 ,突变型ｐ5 3基因在人类多种肿瘤细胞中广泛存在。Ｐ5 3蛋白是ｐ5 3基因编码的蛋白转录因子 ,其相对分子质量为 5 .3× 1 0 3,是由 393个氨基酸残基组成的[1] 。Ｐ5 3蛋白是一种重要的抗肿瘤因子 ,它能以序…     

恒河猴Fas基因的克隆

目的研究猴艾滋病发病机制中细胞凋亡的作用,克隆凋亡相关基因Ｆａｓ的ｃＤＮＡ序列。方法从恒河猴腹股沟淋巴结中提取总ＲＮＡ,根据人的Ｆａｓ ｃＤＮＡ序列设计上、下游引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出目的ｃＤＮＡ片段,将这一片段克隆到ｐＧＦＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体中,筛选阳性克隆并进行序列测定。结果首次克隆了恒河猴Ｆａｓ基因,编码序列为１００５ ｂｐ,将其序列提交ＧｅｎＢａｎｋ,收录号为ＡＹ００７５７２。结论克隆的新序列与ＧｅｎＢａｎｋ已收录的人和食蟹猴的Ｆａｓ基因在编码序列的长度上稍有区别,人的编码序列为１００８ｂｐ,食蟹猴的为９９６ ｂｐ。