抑制消减杂交技术的原理及应用

基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动,对这些差异表达基因进行分离、克隆有助于了解人体各项生命活动的分子调控机制。抑制硝减杂交技术是新建立的一个快速克隆差异表达基因ｃＤＮＡ的有效方法。本将详细介绍该技术的原理及应用。     

抑制消减杂交及其应用

抑制消减杂交(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)是以消减杂交为基础结合抑制PCR方法发展起来的分离克隆差异表达基因的一种策略。该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点。主要介绍其原理、方法及其应用,并对方法的优缺点和应用前景作分析。     

抑制消减杂交（SSH）技术及在克隆基因方面的最新进展

基因表达的变化是调控细胞生命活动的核心机制,分离并克隆差异表达基因已成为现代分子生物学研究的热点,亦是功能基因组学研究的重要内容之一。抑制消减杂交技术以其低假阳性率、高灵敏度等优点,被广泛应用于生物及医学领域中差异表达基因的克隆。     

抑制消减杂交技术在肿瘤转移调控研究中的应用

为探讨肿瘤转移发生的分子生物学机制奠定基础,通过使用抑制消减杂交技术从一对同一新本、转移表型不同的人肺巨细胞癌细胞株中分离转移抑制相关基因可核苷酸片段。结果获得５个在低转移肺巨细胞癌中高表达的、均与已知的人类基因片段有很高同源性的核苷酸片段,它们可能在维持肿瘤细胞自身稳定防止转移中起重要作用。     

以抑制消减杂交法筛选肿瘤耐药相关基因

避开化疗诱导多药耐药性的常规方法,建立烷基磷脂类化合物（十六烷基磷酸胆碱,HePC)诱导人上皮性肿瘤细胞系产生交叉耐药。旨在以新的角度认识肿瘤多药耐药性,揭示新的调控机制。利用抑制消减杂交技术,对库进行克隆分析,在获得的可分析的78个克隆中,27%没有同源基因片段或同源性很低,暂定为“新基因”;14%具有染色体明确定位,认为是化疗敏感肿瘤KB细胞所特有的cDNA片段;19%在人类EST库库MGC和CGAP中出现,可能是肿瘤细胞特有基因;发现与耐药相关的巳知功能基因高达40%。     

抑制消减杂交和辐射小鼠血虚模型筛选"四物汤"诱导表达的基因

应用抑制性消减杂交技术构建受辐射小鼠血虚模型在中药四物汤诱导前后消减cDNA库,并从中克隆鉴定出与四物汤药效相关基因。从受辐射小鼠四物汤诱导前后骨髓细胞中提取mRNA并合成cDNA,分别作为tester和driver进行消减杂交及抑制性PCR,将PCR产物与载体连接构建cDNA库,高效电转化大肠杆菌进行库扩增,随机挑取其中的克隆进行酶切、测序分析。成功构建了具有高消减效率的受辐射小鼠四物汤诱导前后的消减cDNA库。库挑选得到512个阳性克隆。随机挑取30个插入片段测序,生物信息学分析结果显示大部分与红细胞分化、骨髓组织修复、结构重建有密切关系,其中8个为新基因片段。应用抑制性消减杂交技术所构建的受辐射小鼠四物汤诱导前后cDNA消减库为大批量筛选、克隆四物汤药效特异性相关基因奠定了基础。并从分子水平上发现四物汤对抑制凋亡、促进骨髓组织修复和结构重建、诱导红细胞分化的基因具有调节作用,可能和四物汤补血作用有关。     

抑制消减杂交结合cDNA微阵列技术鉴定人肾癌组织高表达基因谱

为克隆肾癌组织高表达基因, 探讨肾癌发生、发展的分子基础, 以人肾癌组织mRNA为试验方, 正常肾组织mRNA为对照构建抑制消减杂交文库. 用文库379个克隆制作基因芯片, 以同位素标记探针对文库进行高通量筛选, 对肾癌组织中表达增高6倍以上的67个克隆进行测序, 结果在GenBank中进行比对分析, 其中4个克隆为新EST片段, 2个为KIAA类基因, 其余克隆为已知基因. 其中已有文献报道的肾癌相关基因, 如VEGF, 波形蛋白, 组织因子等, 大部分为新发现的肾癌相关基因, 包括锌带蛋白、垂体瘤转化基因1等. 3个EST及一些在肾癌组织中高表达的已知基因以Northern杂交、RT-PCR作了验证. 免疫组化与Western blot进一步证实锌带蛋白与垂体瘤转化基因1在肾癌组织中表达显著增强. 这些高表达的基因可能成为肾癌诊断、治疗的潜在靶点, 有助于从基因谱的角度进一步认识肾癌发生、发展的分子机制.     

抑制性消减杂交在生物基因克隆中的应用

抑制性消减杂交(SSH)是抑制PCR与消减杂交技术相结合,能对未知序列差异表达基因克隆的一种方法。该方法具有速度快、效率高、假阳性率低、目的序列富集程度高、实验结果复杂程度低等特点。本主要介绍其基本原理、操作过程、优缺点、在生物基因克隆中的应用,并对其应用前景进行了分析。     

家蝇幼虫消减文库的构建及差异表达基因的鉴定

为了鉴定家蝇Musca domestica免疫相关基因,应用抑制性消减杂交技术,构建刺激家蝇幼虫差异表达cDNA消减文库。以大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus诱导12 h的家蝇幼虫与未诱导的家蝇幼虫为消减杂交对象,获得了差异表达基因的cDNA片段,将其与T/A载体连接并转化大肠杆菌DH5α,构建了刺激家蝇幼虫cDNA消减文库。PCR检测发现,文库的阳性克隆中插入的cDNA片段大小在200~1 000 bp之间,随机挑选了161个含大小不等差异片段的克隆进行测序和同源性分析,鉴定了36种蛋白的基因片段,包括抗菌肽、酶、核糖体蛋白、其他功能蛋白以及功能不明的蛋白。用半定量RT-PCR分析了其中6种蛋白基因的表达,结果显示：防御素和攻击素基因在细菌刺激后24 h内明显上调表达,而溶菌酶、酚氧化酶原活化因子、糜蛋白酶和蛋白质合成起始因子基因在细菌刺激后0-4 h内表达受抑制,12 h后上调表达。该研究结果为家蝇免疫相关基因的克隆和家蝇免疫防御机制的探讨奠定了良好的基础。     

盐胁迫下西伯利亚蓼茎叶正反消减文库的构建及初步分析

正向文库以3% NaHCO3胁迫48 h的材料(茎、叶)为实验方(tester), 以未胁迫的材料(茎、叶)为消减方(driver); 在负向文库中, 以未胁迫的材料(茎、叶)为实验方(tester), 以3% NaHCO3胁迫48 h的材料(茎、叶)为消减方(driver), 利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH)构建了3% NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎叶正反消减文库。从文库中共获得2 282条有效EST序列, 其中从茎正向消减文库中获得598条, 从茎负向消减文库中获得490条, 从叶正向消减文库中获得627条, 从叶负向消减文库中获得567条。经BlastX序列比对后, 通过MIPs方法对EST功能进行分类并对茎叶正反消减文库做了比较, 其中茎与叶部除细胞救援与防御、转运组件中变化趋势相同外, 在代谢、能量、光合作用、蛋白合成、转录和信号传导等方面均表现为相反趋势, 另外通过荧光定量RT-PCR对12个潜在与盐胁迫相关基因进行定量分析, 结果显示12个基因在未经胁迫与盐胁迫处理后的西伯利亚蓼叶与茎部有着很大差异, 说明叶与茎部在NaHCO3条件下可能具有不同应答机制与分工, 这有助于进一步理解西伯利亚蓼分子耐盐机制。     

锌胁迫下小麦SSH文库的构建及初步分析

Zn是植物必需的微量元素,同时也是近年来造成环境污染的重金属元素之一.为了从基因表达水平揭示小麦Zn胁迫响应的分子机制,本研究利用抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建了Zn胁迫（0.5 mmol/L,1 mmol/L）下小麦的正反向SSH文库.从正反向文库中随机挑选阳性单克隆,并利用通用引物T7/Sp6对其进行验证. 结果显示,正反库中分别获得307和821个EST序列,其片段长度在200～1 000 bp之间,它们反映了Zn胁迫下特异响应的基因.利用BLASTn和BLASTx将这些EST序列进行比对分析,在正、反库中分别筛选出221和641个uniESTs,其中751个uniESTs被注释（包括正库中193个和反库中558个）.这些序列的功能主要涉及信号转导、抗氧化防御、转录与翻译、物质运输、核糖体结构、能量代谢,以及一些功能未知的基因.     

梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库的构建

以梅山猪和长白猪的背最长肌为材料,利用抑制性消减杂交技术成功构建了梅山猪与长白猪肌肉组织间正反向消减cDNA文库。以管家基因G3PDH作为消减指标,检测梅山猪和长白猪两个消减文库的消减效率分别高达2^10和2^5倍,表明某些特异于两种肌肉组织的差异表达基因的富集效率也分别接近2^10和2^5倍。从两个消减文库中分别筛选到了。709和673个有效阳性克隆,PCR鉴定插入片段长度主要分布于150～750bp之间。不同猪种肌肉组织间消减cDNA文库的构建为进一步分离和鉴定与猪肌肉生长和肉质相关基因奠定了基础,对探讨肌肉生长机理和肉质决定因素以及猪的分子育种具有重要意义。     

利用抑制差减杂交技术分离受水稻抗性调控的褐飞虱基因

为分离受水稻抗性调控的褐飞虱Nilaparvata lugens基因, 以取食感虫水稻台中1号和高抗水稻B5的2叶1芯秧苗24 h的褐飞虱4龄若虫为起始材料, 采用抑制差减杂交技术构建了两个群体间的正反向差减cDNA文库。通过斑点杂交从差减文库中筛选代表受水稻抗性调控的基因的cDNA克隆, 进行测序和功能分析, 挑选具功能的基因进行Northern杂交验证。结果表明, 通过斑点杂交筛选到的98个阳性克隆代表92个互不重复的单基因, 其中25个与动物的已知蛋白基因存在较高的同源性。Northern杂交表明, 这25个基因有11个表达上调, 8个表达下调, 提示它们可能在褐飞虱适应抗性水稻过程中发挥了重要作用。本研究结果为克隆上述新基因的全长cDNA序列及进一步研究其在褐飞虱与水稻互作中的功能奠定了基础。     

镍胁迫下安氏伪镖水蚤SSH文库的构建及铁蛋白cDNA的克隆与差异表达

为探讨镍胁迫下桡足类的分子响应机制,以安氏伪镖水蚤为研究对象,利用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了镍胁迫下安氏伪镖水蚤SSHcDNA文库,并随机挑取生长菌落140个克隆子,进行菌液PCR鉴定,计算文库重组率为98.6％,文库容量为1.12×106 cfu.将重组子测序,经BLAST一致性搜索比对分析发现,有一重组片段含有铁蛋白保守结构域,该片段大小为859 bp,连续编码170个氨基酸残基,Gen-Bank登录号为JK312601.半定量PCR证实,镍胁迫24 h后,安氏伪镖水蚤中铁蛋白表达显著上调.本文库的成功构建及铁蛋白cDNA片段的获得为进一步研究镍胁迫下桡足类的分子响应机制奠定了基础.     

SSH 法结合定量 PCR 技术研究双肌臀猪 肌肉组织的差异表达基因

利用抑制性消减杂交技术 (suppression subtractive hybridization , SSH) 成功地构建了双肌臀与非双肌臀大白猪肌肉组织差异表达的消减 cDNA 文库,获得有效克隆 686 个. 对整个文库测序分析,共获得 587 条有效序列. 利用 BLAST 在线软件与 GenBank、 GenBank EST 和 Tigr Porcine EST 等数据库进行同源序列比较,发现其中有 11 个未知新序列,可能代表“双肌臀”大白猪肌肉组织特异表达的新基因. 对文库中所包含的兰尼啶受体基因 (RYR1)、钙依赖性蛋白激酶 基因 (CAMK2)、人类胰岛素生长因子结合蛋白 -7 基因 (IGFBP7),以及 695号、 882号和480号3个新基因进行了实时荧光定量 PCR 检测,结果显示： RYR1、 CAMK2 及 IGFBP7 基因在双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中的表达量,分别为对照的非双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中表达量的 1.87、 1.90 和 1.85 倍; 695 号、 882 号和 480 号 3 个新的 ESTs 在双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中的表达量为非双肌臀猪肌肉组织 RNA 池中表达量的 1.48、 1.44 和 1.78 倍. 这提示我们,上述基因的上调表达很可能与猪双肌臀性状的发生有密切的关系,可以作为研究该性状的候选基因.     

与芒果子叶切段不定根形成相关基因的cDNA片段的克隆

在研究芒果子叶横切所形成的远轴面和近轴面的不定根形成时发现,只在近轴面形成不定根.该研究利用抑制性扣除杂交(suppres sive subtractivehybridization,SSH)方法,以子叶切段远轴切面作为参照样品,近轴切面作为检测样品,构建正向差异cDNA文库,分离与芒果子叶切段不定根形成相关基因的cDNA片段.经VirtualNorthern杂交分析,获得6个阳性克隆.序列分析和同源性比较结果表明这些cDNA片段均为首次报告,它们分别与转运蛋白、转录调控因子及酶基因的DNA序列同源.     

石斑鱼性反转相关基因 ECaM的克隆及表达特征分析

用甲睾酮片饲喂 2 ～ 4 龄赤点石斑鱼 (Epinephelus akaara) , 6 周后 90% 以上的雌鱼性逆转为功能性雄鱼 . 运用抑制性差减杂交技术 (SSH) ,结合 SMART cDNA 合成和 RACE-PCR 方法,从性反转雄鱼性腺中克隆到钙调蛋白基因 (ECaM). 该基因 cDNA 全长为 582 bp ,开放阅读框长 450 bp ,编码的蛋白质由 149 个氨基酸组成, 5 ′端非编码区 74 bp , 3 ′端非编码区 58 bp. 虚拟 RNA 印迹表明, ECaM 在性反转雄鱼性腺中表达,而在正常雌鱼性腺中表达微弱 . 各种组织的半定量 RT-PCR 显示, ECaM 在脑、心、肝、脾、肾都有转录,在精巢和下丘脑中表达水平较高,而在肌肉中表达甚弱 . 性反转不同时期性腺的半定量 RT-PCR 及蛋白质印迹表明,性逆转过程中性腺里 ECaM 的表达量逐渐增加 . 上述结果提示钙调蛋白可能在赤点石斑鱼性逆转过程中发挥着作用, ECaM 可能是促使石斑鱼由雌向雄转变的重要功能基因之一 .     

黄瓜黄绿叶突变性状的遗传分析

在深绿叶的“地串”黄瓜品种单株自交后代群体中,分离出性状稳定的黄绿叶突变株系。遗传分析表明,突变株系的黄绿叶性状受一对隐性核基因控制。该性状在幼苗期表现,突变株能正常生存、繁殖,是一种可利用的形态标记。控制此性状的基因符号暂定名为yg1。 Abstract:A yellow green leaf character mutation in cucumber was isolated from a population of selfed individual plant of dark green leaf ‘De Chuan' cultivar.Genetic analysis showed that the yellow green leaf character was controlled by one pair of recessive nuclear genes.The character expressed at the seedling stage and the mutant plant have the ability to viable and propagate.It could be used as a morpholmarker.This yellow green leaf gene was provisionally designated as yg1.     

苜蓿雄性不育系MS-4 SSH文库构建及基因表达分析

以苜蓿雄性不育系MS-4与可育系花蕾为材料,利用抑制性消减杂交(SSH)技术,分别构建了不育条件下和可育条件下基因差异表达消减cDNA文库,在2个库中分别随机挑选阳性克隆进行测序,经序列比对分析,共获得功能已知的EST序列190条。后经GO功能分类,对推定出的6个相关基因进行荧光定量PCR分析。结果表明:6个基因在苜蓿雄性不育系花蕾不同发育时期中均出现差异表达,推测这6个基因可能与苜蓿雄性育性相关,并且在其育性转换中具有重要作用。     

Identification of over-expressed genes in human renal cell carcinoma by combining suppression subtractive hybridization and cDNA library array

To isolate the over-expressed genes in human renal cell carcinoma (RCC) and analyze its molecular basis of carcinogenesis, we used the mRNA from human RCC tissues as tester and that from the matched normal kidney tissues as driver to construct the suppression subtractive hybridization library. 379 of the subtracted clones were arrayed onto a nylon membrane and the over-expressed genes were then screened by hybridizing the filter with radioactively labeled cDNA from RCC and matched normal kidney tissues. 67 clones over-expressed in RCC by a factor of 6 or more were sequenced and its identities were analyzed in GenBank database. 4 clones were previously unknown fragments and 2 clones represent KIAA genes. The rest clones were the known genes and some of them were RCC-related, including vascular endothelial growth factor, vimentin and tissue factor. Most of the known genes were the RCC-related genes previously unknown, including zinc ribbon domain-containing 1 protein (ZNRD1), pituitary tumor transforming gene1 (PTTG1). Northern blot and semi-quantitative RT-PCR confirmed that the mRNA levels of the 3 novel fragments and 1 KIAA and 3 known genes were significantly higher in RCC than in the matched normal kidney tissues. Immunohistochemical and Western blot analysis for PTTG1 and ZNRD1 revealed increased protein level in RCC. The over-expressed genes in RCC are the potential molecular targets for diagnosis and therapy and it is very important to understand the molecular mechanism of RCC through the profile of over-expressed genes.