大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较

启动子位于转录起始位点上游并能特异性地结合RNA聚合酶,其作为调控序列驱动外源基因在异源植物中表达,从而实现转基因的高效性,具有时空表达特异性的启动子对获得有效转基因植物及产物具有重要意义。为了解种皮特异启动子的表达模式,该研究基于前期报道的序列,通过同源克隆的方法分别从大麦和油菜中克隆获得Gerb和Bntt两个种皮特异性启动子,并对其进行生物信息学分析,构建了Gerb::GUS和Bntt::GUS植物表达载体并转化拟南芥,通过组织化学染色观察了GUS的表达情况。结果表明:两种启动子序列中都含有多拷贝种皮特异表达启动子元件以及多种胁迫诱导响应元件;转基因拟南芥幼苗期,大麦Gerb种皮特异启动子驱动GUS全株表达且子叶和下胚轴较真叶和根中表达量高;油菜Bntt种皮特异启动子表达较弱;成株期,Gerb在不同组织(叶片、茎、花序和角果)中均有表达,未显示组织特异性;Bntt仅在叶片及角果维管束中有微弱表达。在各种非生物胁迫下,Gerb表达模式未发生显著变化,而Bntt仅在盐胁迫下显示很强的角果和种子特异性表达,其他胁迫未见明显表达。以上结果显示,大麦种皮特异性启动子Gerb和油菜种皮特异性启动子Bntt在时间和空间表达模式上存在差异,这对今后选择种皮特异启动子具有参考作用,但其具体机制仍需进一步研究验证。     

关岭牛MyoD玉基因启动子报告质粒的构建及活性验证

为了克隆关岭牛MyoD玉基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoD玉基因序列设计PCR引物,用PCR技术扩增牛MyoD玉基因的启动子,构建重组克隆载体pUCmT-MyoD玉;并通过PCR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴定;构建报告质粒pGL3-MyoD玉,并将其转染小鼠C2C12、3T3-L1细胞系,检测其24 h后的双荧光素酶活性。实验结果获得了关岭牛MyoD玉基因启动子,其序列长度为993 bp,并成功构建了MyoD玉启动子报告质粒;双荧光素酶活性检测表明pGL3-MyoD玉在小鼠C2C12细胞中的表达是pGL3空载体40.65倍,在小鼠3T3-L1细胞中的表达是空载体的1.13倍,MyoD玉启动子在小鼠C2C12细胞中的表达高于3T3-L1细胞(**p<0.01)。结果表明关岭牛MyoD玉基因启动子具有启动活性,在小鼠骨骼肌细胞中特异性表达。     

植物基因工程中人工启动子的研究进展

启动子是调控基因转录的一段DNA,也是构建基因工程表达载体的重要元件。天然启动子在表达强度和特异性等方面存在一定的局限性。采用人工构建的方法,有望得到诱导因子广、本底活性低、表达强度高、启动表达快等特点的启动子。本文综述了人工启动子在诱导表达、组织特异性表达、高效表达等方面的研究进展。     

骨骼肌特异表达载体的构建与验证

目的:构建肌肉特异性表达线虫ω-3脂肪酸去饱和酶的肌肉特异性载体,证明其表达的有效性.方法:化学合成292bp的带有肌肉特异性转录因子结合位点的DNA序列,然后与线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因cDNA、去除CMV启动子的表达载体pcDNA3.1连接构成肌肉特异性表达载体pcDNA3.1 - SF,4w龄C57BL/6小鼠肌肉注射该重组载体,RT - PCR检测证明其表达有效性.结果:DNA测序结果证明合成的292 bp片段带有肌肉特异性表达元件;PCR鉴定显示启动子片段正确地插入到目的基因上游;RT - PCR鉴定显示肌肉内ω-3脂肪酸去饱和酶基因得到有效转录.结论:该试验为在转基因动物的肌肉中表达外源基因奠定了基础.     

反向PCR法扩增花粉特异表达基因PSG076启动子

PSG076基因是从奥地利小麦品种‘Ferdinand’中分离的花粉特异性表达基因,功能未知.为获得可用于小麦基因工程的花粉特异性启动子,采用优化的反向PCR法分离PSG076启动子,获得了起始密码子上游约1.4 kb的启动子序列.生物信息学分析显示,该启动子除含有与花粉特异性表达相关的调控元件AGAAA和GTGA外,还含有花粉特异性表达相关的数量元件AGGTCA和AAATGA,推测其为活性较强的花粉特异性启动子.实验中对反向PCR方法的优化可提高扩增侧翼未知序列的效率,特别适用于启动子序列的扩增.     

肝特异性表达HCV5＇NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的.以2235A-1质粒为模板,通过PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段,用小鼠白蛋白启动子/增强子基因片段取代pHCV-neo4质粒(含HCV5＇NCR调控荧光素酶基因)的CMV启动子,构建了一种白蛋白启动子启动转录的HCV5＇NCR调控荧光素酶表达质粒(pA1b-HCV).该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高,表明成功地构建了肝特异性表达的HCv5＇NCR调控荧光素酶表达质粒.该研究为建立肝特异性表达的HCV5＇NCR转基因小鼠模型奠定了基础,对评价HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义.     

植物组织特异性启动子研究

组织特异性启动子可以调控基因在某些特定的器官或组织部位中表达。通过对植物组织特异性启动子进行分类和比较,概述了植物组织特异性启动子的结构特点、功能及研究进展。     

绵羊Myostatin基因启动子的功能分析

相比于Myostatin基因的作用机制而言, 对Myostatin基因转录和表达的调控机制了解很少. 为了更好地了解Myostatin基因5’调控区的结构和功能, 深入研究Myostatin基因的转录调控机制, 在最近的研究中克隆了绵羊Myostatin基因的启动子(Pro)序列(GenBank 登录号为AY918121). 进一步以EGFP为报告基因, 构建了各种长度的野生型MSTNPro^W-EGFP载体和E-box元件突变型MSTNPro^EM-EGFP载体, 通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞系或绵羊成纤维细胞后, 对各种情况下EGFP的瞬时或稳定表达进行荧光定量分析而比较不同条件下绵羊Myostatin基因启动子的转录调控活性. 结果表明, 0.3~1.2 kb的绵羊Myostatin基因启动子都能不同程度地驱动EGFP在C2C12细胞中的转录和表达, 其中1.2 kb片段的转录调控活性最高. 然 而, 将绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体转染绵羊成纤维细胞后并未观察到EGFP的表达, 说明Myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性. 对稳定转染绵羊1.2 kb MSTNPro^W-EGFP载体的C2C12细胞进行荧光分析, 结果表明细胞生长密度的增加可以反馈性抑制Myostatin基因的转录和表达. 在C2C12分化状态下, 1.2 kb野生型绵羊Myostatin基因启动子的活性比成肌状态时显著升高, 而1.2 kb E(3+5+7)突变型Myostatin基因启动子的活性在C2C12分化前后并未表现出差别. 这一结果暗示肌肉调控因子MyoD可能是通过与E-box结合而引起Myostatin基因在C2C12分化和生长状态时转录和表达差异的一个原因.     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

肝特异性表达HCV5′NCR调控荧光素酶质粒的构建及表达

小鼠白蛋白是肝组织特异性表达的蛋白 ,这种特异性是由白蛋白启动子所介导的 .以2 2 35A- 1质粒为模板 ,通过 PCR扩增获得小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段 ,用小鼠白蛋白启动子 /增强子基因片段取代 p HCV- neo4质粒 (含 HCV5′NCR调控荧光素酶基因 )的 CMV启动子 ,构建了一种白蛋白启动子启动转录的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 (p A1 b- HCV) .该质粒能在小鼠肝癌细胞中表达且较小鼠其它癌细胞中表达水平明显增高 ,表明成功地构建了肝特异性表达的 HCV5′NCR调控荧光素酶表达质粒 .该研究为建立肝特异性表达的 HCV5′NCR转基因小鼠模型奠定了基础 ,对评价 HCV特异性反义药物及肝靶向性运载系统的作用具有重要的实际意义     

水稻谷蛋白基因GluC启动子的克隆及表达分析

水稻谷蛋白仅在水稻种子胚乳中表达,其启动子是分离胚乳特异性表达启动子的理想材料。本研究克隆了GluC基因启动子pGluC,生物信息学分析表明pGluC内部含有胚乳特异性表达所需要的Skn-1 motif和ACGT-box元件。将pGluC启动子和7个5'端缺失启动子片段构建到pGPTV-GUS载体上,转化水稻愈伤组织,进行组织化学染色和GUS酶活分析。结果表明：全长及截短的-1 911、-1 611、-1 311 bp启动子均能驱动GUS基因在水稻种子胚乳中高效稳定表达。-999、-451、-203、-102 bp启动子失去了胚乳表达特异性,在根、茎或者叶中也检测到GUS表达。该结果为实现外源目的基因在水稻胚乳中特异高效表达提供了理论依据。     

韧皮部特异性启动子研究概述

韧皮部特异性启动子可驱动其下游基因在植物的韧皮部特异性表达,通过将几种韧皮部特异性启动子的序列进行比较,发现这类启动子在结构上存在可能与组织特异性有关的保守基序。对这类启动子的结构与功能的研究将有助于提高人们对植物维管组织分化及有机物质运输机制的了解,而且也会为植物抗病虫基因工程的研究提供有应用价值的启动子元件。就韧皮部特异性启动子的结构特点、分类及应用进行了概述。     

P53参与抑制PC-1基因转录的结构域分析

目的:分析P53分子参与抑制PC-1基因转录的结构域。方法:构建P53分子突变体;将前列腺癌LNCaP细胞瞬时转染野生型或突变型p53及含PC-1启动子的荧光素酶表达载体p4939,分析PC-1启动子的转录活性。结果:P53分子N端转录激活域及富含脯氨酸功能域突变体没有减弱对PC-1启动子的转录抑制作用,而特异性DNA结合域上175、273位突变体和C端339～346位氨基酸的缺失突变体都减弱了对PC-1启动子转录的抑制作用;另外P53分子第175和273位突变体在前列腺癌细胞中对野生型P53的转录抑制功能表现出显性负效应。结论:P53分子特异性DNA结合域和C端结构域参与对PC-1基因启动子的转录抑制,而P53突变体的显性负效应可能是PC-1在前列腺癌进展中表达失调的因素之一。     

内皮细胞特异性启动子pvWF和pVE的克隆及表达

目的:克隆并验证内皮细胞(Endothelial Cells,ECs)特异性启动子,为转染人胚胎干细胞(h ESC)后实时监测ECs的定向分化情况以及利用干细胞实施血友病A的基因治疗研究提供基础。方法:通过酶消化法原代分离人脐静脉内皮细胞(HUVECs),结合RT-PCR和免疫荧光验证分离后的HUVECs表达内皮细胞特异性标志基因血管性血友病因子(v WF)和血管内皮钙粘素(VE-cadherin/CDH5)。抽提HUVECs的g DNA,通过PCR扩增内皮细胞特异性表达基因v WF和VE-cadherin转录起始位点上游不同大小的启动子片段,将其取代报告基因载体p EGFP-N1中的广谱启动子CMV,构建4个质粒,即pv WF-1、pv WF-2、p VE-1、p VE-2,分别转染HUVECs和h ESCs,48 h后观察并比较各启动子片段启动绿色荧光蛋白GFP表达情况,筛选最具特异性及转录活性的启动子片段。结果:通过酶消化法,本研究成功分离出具有典型上皮样细胞的HUVECs。RT-PCR和免疫荧光结果表明HUVECs特异性表达v WF和VE-cadherin。酶切及测序证实所构建的4个含ECs特异性启动子片段的质粒与理论序列相符,通过核转染至HUVECs及h ESCs后,48 h后观察到所克隆的VE-cadherin 2105bp启动子片段具有内皮细胞表达的特异性和较强的转录活性。结论:本研究成功筛选出具有内皮细胞表达特异性及较强转录活性的启动子片段。     

人工合成根特异启动子SRSP的功能分析

根负责吸收水分和养分,是重要的植物组织,但易受生物及非生物胁迫,影响作物的生长发育和产量。设计合成根特异启动子,可为与胁迫相关的抗性基因在作物根部的功能研究及高效表达提供候选启动子。文中将4拷贝的根特异性顺式作用元件(OSE1ROOTNODULE、OSE2ROOTNODULE、SP8BFIBSP8AIB和ROOTMOTIFAPOX1)以串联排列方式设计合成了一个根特异性模块(pro-SRS),并与来自CaMV35S启动子的最小启动子融合,合成一个人工合成启动子SRSP。通过替换CaMV35S启动子将SRSP启动子克隆到pCAMBIA2300.1中以驱动GUS表达。将携带SRSP启动子的构建体通过农杆菌介导的方法转化到烟草中。GUS组织化学染色分析和实时PCR (RT-PCR)分析显示SRSP启动子在转基因烟草中赋予根特异性表达。说明顺式作用元件重复排列可实现启动子预期功能,本研究为理性设计植物组织特异启动子奠定了理论基础。     

高等植物启动子研究进展

 简述了高等植物来源启动子的多种保守顺式调控元件如TATA盒、转录起始位点、G盒等,以及双向启动子和可变启动子。着重介绍了受环境包括激素、光、创伤、真菌、逆境等因子诱导表达的植物启动子以及显示出植物发育特异性表达的启动子。     

高等植物启动子研究进展

简述了高等植物来源启动子的多种保守顺式调控元件如ＴＡＴＡ盒,转录起始位点,Ｇ盒等,以及双向启动子和可变启动子。着重介绍了受环境包括激素,光,创伤,真菌,逆境等因子诱导表达的植物启动子以及显示出植物发育特异性表达的启动子。     

不同启动子对于牛催乳素表达的调控作用

在细胞水平上比较不同启动子对于牛催乳素(bPRL)表达的调控作用.分别构建了以CMV启动子、牛催乳素基因启动子和山羊β-酪蛋白基因启动子作为调控元件的bPRL真核细胞表达载体,分别命名为pCMV、pPRLP和pP1A3.将3种载体分别转染小鼠垂体瘤细胞和小鼠乳腺上皮细胞,使用RT-PCR和定量RT-PCR分析3种启动子启动bPRL在2种细胞系中的表达效果.pCMV在2种细胞中有效表达bPRL;pPRLP在2种细胞中的表达效果与pCMV接近:pP1A3不在垂体细胞中表达,在乳腺细胞中表达.pPlA3具有乳腺表达特异性;pPRLP能够在垂体和乳腺中高表达,在其他组织的表达特异性有待进一步研究.     

羊毛角蛋白基因家族及其启动子调控作用研究进展

羊毛是养羊业重要的畜产品和经济来源之一,近年来羊毛蛋白组学研究取得很大进展,羊毛组分和结构的研究为羊毛角蛋白编码基因及其表达调控研究奠定了基础。该文介绍了羊毛的基本结构组成和在羊毛生长发育过程中羊毛相关角蛋白的表达调控机制,角蛋白基因表达具有高度的组织特异性和时空性,这种特异性表达受到严格调控,而启动子是基因表达调控的关键元件。文章进一步对当前羊毛角蛋白基因启动子研究进展进行综述,分析相关转录因子通过与启动子特异性位点结合来调控最终羊毛性状的机制,围绕羊毛结构、相关基因表达特征以及特异性启动子调控机制等方面论述了羊毛生长发育及其蛋白特异性表达的研究进展,为羊毛发育及分子育种研究提供理论参考。     

特异性启动子调控甜瓜ACC氧化酶反义基因载体构建及对烟草的转化

以甜瓜ACC氧化酶反义基因抑制水果成熟过程中内源乙烯的合成为基础,建立甜瓜特异性启动子调控下ACC氧化酶反义基因表达载体。以pCB-ACO1载体为基础,进行平末端连接加入特异性启动子pCAM-ACO1-promoter,对转基因甜瓜表达载体的构建进行特异性启动子的研究,通过叶盘法转化的烟草经过PCR检测已转入含有特异性启动子promoter调控下ACC氧化酶反义基因表达载体,为下一阶段用该反义基因载体转化甜瓜栽培品种奠定基础。