单细胞转录组测序技术及在哺乳动物上的应用

哺乳动物的器官是由多种细胞类型组成,它们通过细胞间的相互作用来发出信号,以维持体内平衡和确保机体发育。传统转录组测序是以大量细胞或组织为研究样本,反映的是细胞总体上转录组特征,不能分析单个细胞的基因表达情况,而单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术的发展为揭示单个细胞转录组特征提供了有效方法。本文通过对scRNA-seq平台、scRNA-seq主要技术类型及scRNA-seq在哺乳动物上的应用展开综述。     

细菌转录起始调控机制*

原核生物同一种群的每个细胞都是和外界环境直接接触的,它们主要通过开启或关闭某些基因的表达来适应环境条件。所以,环境因子往往是调控的效应因子,必须严格调控转录来确保细胞对环境改变做出有效且充分的反应。原核生物基因的表达受多种因素的调控,而对于大多数细菌来说,调控基因表达的关键步骤是启动子识别和RNA聚合酶启动转录。在细菌的细胞中,可以通过调节RNA聚合酶的活性以及改变RNA聚合酶对启动子的结合来优化基因的转录过程以适应不同环境变化。总结了目前已发现的参与细菌细胞转录调节的各类因子,从这些因子对启动子的作用、RNA聚合酶的作用以及两者的相互作用等方面阐述它们调控基因表达的分子机制。总结多种基因调控的作用,加深对转录起始过程的认识,希望能对未来调控转录起始过程来实现目标基因的高效表达和不利基因的抑制表达提供思路,为以后的工业菌株改造提供依据。     

长非编码RNA在基因表达调节中的作用

转录物组学研究发现真核生物基因组可以进行活跃的转录,并产生具有多种功能的长非编码RNA(large noncoding RNA,lncRNA)。这些lncRNA在生物发育的某些阶段表达,往往具有组织或细胞特异性,其中很多长度超过了200个核苷酸残基。现在的研究成果已经揭示,这些lncRNA可以通过影响mRNA的转录、拼接、转运、稳定性和翻译等过程,从而调节蛋白质基因的表达。本文就lncRNA调节基因表达机制的研究进展做一论述     

cDNA微阵列技术分析NAG7基因对鼻咽癌细胞基因表达谱的影响

运用cDNA微阵列技术分析NAG7基因重表达对HNE1细胞基因表达谱的影响.抽提HNE1细胞和pcDNA3.1(+)/NAG7/HNE1细胞总RNA,分离polyA mRNA,将mRNA逆转录为cDNA,并在逆转录过程中用³³P-dATP进行标记,与含有16 150个基因和表达序列标签(EST)的cDNA表达阵列膜杂交,获得基因表达图谱.Array Gauge软件分析NAG7基因的重表达所导致的鼻咽癌细胞HNE1基因表达谱改变,并用RNA印迹对微阵列杂交结果进行验证.结果分析表明,2倍以上的差异表达基因或EST 179个,其中表达上调的91个,表达下调的88个;已明确基因表达产物的上调基因29个,下调基因37个.在差异表达基因中,涉及基因转录调控、信号转导、细胞生长、细胞代谢和细胞凋亡等基因.RNA印迹证实生长阻滞特异蛋白1（gas 1）基因表达上调.特别值得关注的是, 先前的蛋白质组研究结果亦发现NAG7基因可导致生长阻滞特异蛋白1表达上调,说明gas 1基因在NAG7重表达的HNE1细胞中具有重要作用,这为深入研究NAG7基因的作用环节和机理提供了重要的线索.     

LINCS——面向转化医学的细胞反应大数据计划

正近十几年来,基因芯片、转录组测序、蛋白质组等技术的发展是极大地推动了生物医学研究的重要手段.通过基因和蛋白质表达谱分析可以发现疾病发生与发展的关键分子、辅助辨识诊断标志物和药物治疗靶标.然而,传统的组学分析主要关注显著差异表达基因,由于噪声的影响,差异表达分析往往带来较多的假阳性.近年来,基因表达谱关联图谱分析逐渐成为基因表达谱分析的另一重要途径.基因表达谱关联图     

RNA原位杂交技术的一些应用技巧

目的:检测基因在动物组织或细胞中的时空表达模式。方法:转录反义RNA探针;利用RNA原位杂交技术检测人和小鼠牙原基中若干基因的表达。结果与结论:通过优化条件,转录出完整的反义RNA探针,并成功地利用RNA原位杂交技术在组织中检测到基因的表达;分析了一些在RNA原位杂交的过程中可能碰到的问题及其解决方法。     

单细胞转录组测序技术在动物上的应用研究

细胞是机体最基本的结构组成及功能单位,细胞类型和功能由其整个转录表达谱决定,通过单细胞转录组测序可以获得单个细胞转录表达谱,由此以高精度分辨率鉴定细胞类型、细胞状态以及稀有类型细胞,从而可以在单细胞水平分析细胞动态变化及细胞间的关系,深入解析驱动细胞变化及细胞异常背后的分子细胞机制。随着单细胞测序技术稳定性和测序通量的提高,以及测序成本的降低,其在发育生物学、肿瘤、免疫及疾病等领域被广泛应用,研究对象主要涉及人及模式生物,在动物上的应用研究相对较少。本文主要介绍单细胞转录组测序技术及其生物学应用并综述目前其在动物上的一些开创性研究,以期为今后更好的在动物上应用单细胞转录组测序提供方法参考。     

全转录组学在畜牧业中的应用

RNA作为一种大分子参与基因编码、解码、调控、表达等多种生物学过程。目前,对RNA的功能研究主要通过全转录组测序方法来完成。全转录组研究可以对基因结构与功能进行更深层次地分析和探究,揭示基因表达与生命现象之间的内在联系。现阶段,基于高通量测序技术的转录本结构研究、基因表达水平研究及非编码区域功能研究在模式动物、猪、禽类中已大量开展,但在羊上却鲜有报道。本文介绍了利用RNA-seq及Small RNA-seq技术研究全转录组的一般流程及常用策略,综述了全转录组学技术在畜牧业领域中的研究进展。     

维持胚胎干细胞多能性和自我更新的转录因子Oct-4/ Nanog以及相关的调控网络

Oct-4和Nanog是两种维持干细胞多能性和自我更新的转录因子, 它们通过结合靶基因调控区, 选择性地抑制分化基因表达或促进多能性基因表达。它们通常只在多能干细胞中表达, 在分化细胞中不表达。在不同的发育阶段, 它们的表达量受到特异调控, 并且分别与Sox-2、FoxD3等其他转录因子以及LIF、BMP等胞外信号通路互相作用, 形成一个复杂的转录调节crosstalk网络, 在特异时空激活或抑制靶基因的转录; 通过互相制约最终决定干细胞是保持多能性还是分化, 以及向哪个方向分化。此外, Oct-4和Nanog对体细胞重编程为多能细胞也有重要作用。     

单细胞转录组测序技术在细胞分类中的应用

多细胞有机体的细胞类型多且复杂,细胞间普遍存在异质性。目前,单细胞转录组测序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技术是一项新兴的研究单个细胞转录水平的技术,其从数千个平行的细胞中生成转录谱,揭示个体细胞基因组的差异性表达,反映细胞间的异质性,从而鉴定出不同细胞类型,形成组织或器官的细胞图谱,在生物和临床医学等领域发挥重要作用。该文在对scRNA-seq测序平台进行阐述和比较的基础上,着重介绍其在神经系统和免疫系统细胞类型探索中的应用,并且总结scRNA-seq与空间转录组技术相结合的研究成果。     

氦氧饱和高气压暴露对铜绿假单胞菌PAO1基因表达的诱导调节

研究氦氧饱和高气压暴露对铜绿假单胞菌基因表达谱的系统影响,对急性毒力基因表达的调节。用全基因组DNA芯片分析技术比较菌株暴露前后基因表达谱差异;RT-PCR方法验证部分差异表达基因;用分光光度法在细胞水平验证弹性蛋白酶含量;小鼠染毒法观察暴露组细菌毒力在整体动物水平的变化。基因表达谱分析结果表明,铜绿假单胞菌暴露12 h差异表达基因达243个、72 h差异表达基因为1 168个。72 h差异表达基因中与细菌应激响应、蛋白折叠、转录调节、菌毛和鞭毛合成、毒力因子调节与合成、细菌外膜蛋白和抗原合成的基因大量上调;部分基因的RT-PCR验证结果与芯片结果一致;细胞水平验证结果显示暴露72 h细菌毒力表型增强。因此,氦氧饱和高气压暴露对铜绿假单胞菌基因表达谱有明显影响,对急性侵袭性感染毒力因子基因表达水平有正向诱导调节作用。     

利用小干涉RNA抑制肿瘤细胞MCF-7中NF-IL6的表达

RNA干扰被证明是-项能有效而特异地抑制基因表达的新技术。转录因子NF-IL6特异地在肿瘤组织中过量表达,许多报道表明抑制它的功能对肿瘤治疗有利。构建能够沉默转录因子NF-IL6表达的小干涉RNA（siRNA）质粒,转染肿瘤MCF-7细胞后,用Western印迹法和荧光酶活性实验检测NF-IL6表达水平和转录活性的改变。结果发现NF-IL6的表达水平被下调80％,转录激活能力降低了60％,转染细胞内部出现大量空洞,细胞增殖停滞。     

时空转录组研究进展

时空异质性是造成不同组织功能差异的关键因素,在细胞命运调控过程中发挥重要作用。时空转录组(stRNA-seq)是一项将定量转录组与高分辨率组织成像相结合的新兴组学技术。它将表达数据锚定到目标器官或组织的物理图上,并以无偏见的生物信息学方式对组织切片和细胞层进行分子表征,反映特定细胞内基因的时空异质性表达丰度。受益于高通量测序技术的快速发展,时空转录组为探究各类细胞基因表达的时空异质性提供了新的实验思路和方法。该文介绍了时空转录组的原理和发展进程,以及不同时空转录组的技术特点和优劣,总结了时空转录组在动物、植物和微生物中的应用,可为今后系统开展时空转录组研究提供理论参考。     

长链非编码RNA在心肌生理和病理生理功能调控中的作用北大核心CSCD

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一组超过200个核苷酸的非编码转录RNA,能与DNA或RNA、miRNA结合位点和启动子的靶碱基结合,改变基因表达,或者直接调节蛋白功能,参与胚胎发生发育、器官功能稳态维持以及疾病发生发展等多种生理和病理过程。近年多项研究结果表明,lncRNA不但在生理性心脏发生发育、心脏各类型细胞分化和转化过程发挥重要作用,而且在心脏疾病,如心肌肥厚、心力衰竭、心肌梗死和心脏缺血再灌注损伤等病理性疾病中,表达谱发生动态改变。     

长链非编码 RNA 在心肌生理和病理生理功能调控中的作用

长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一组超过200个核苷酸的非编码转录RNA,能与DNA或RNA、miRNA结合位点和启动子的靶碱基结合,改变基因表达,或者直接调节蛋白功能,参与胚胎发生发育、器官功能稳态维持以及疾病发生发展等多种生理和病理过程。近年多项研究结果表明,lncRNA不但在生理性心脏发生发育、心脏各类型细胞分化和转化过程发挥重要作用,而且在心脏疾病,如心肌肥厚、心力衰竭、心肌梗死和心脏缺血再灌注损伤等病理性疾病中,表达谱发生动态改变。     

基于基因表达谱的肿瘤特异基因表达模式研究

基于肿瘤基因表达谱, 利用生物信息学的方法, 从肿瘤与正常组织的样本分类入手就肿瘤特异表达基因的发现及其表达模式问题进行了分析和研究, 进而探讨了肿瘤在基因表达上的特点. 首先, 在分析肿瘤基因表达谱特点的基础上, 提出了基于Relief算法的样本分类特征基因选取策略; 然后, 以支持向量机为分类工具进行样本类型的识别, 以分类错误率为标准选取样本分类特征基因, 并对其中反映肿瘤与正常样本组织构成特点的组织特异表达基因进行排除以突出肿瘤样本真实的类别特征; 最后结合统计学方法, 从信息学的角度论证了分类特征基因在肿瘤组织中特异表达的确实性和普遍性, 并对这些基因在肿瘤组织中呈现出的特异的表达模式进行了分析.     

干扰小RNA序列非依赖性地影响胰腺癌细胞的基因表达

干扰小RNA(small interference RNA, siRNA)是基因敲减的常用工具,广泛用于基因沉默技术和基因功能研究,在临床疾病治疗等方面也有潜在的应用。一般认为,达到一定长度（比如大于27 bp）的双链RNA可以诱导干扰素反应,降低相关基因的表达。目前,siRNA对基因表达的非特异性作用尚不完全清楚。为研究siRNA干扰的非特异基因表达,本研究以胰腺癌细胞HPAC 和BxPC3 为模型,采用高通量测序技术对6种不同干扰小RNA处理及未作处理的HPAC和BxPC3细胞进行转录组测序分析,筛选出干扰小RNA处理后表达量共同下调的基因进行研究。通过生物信息学方法对表达下调基因的功能进行研究,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对部分下调基因进行验证。结果表明,短片段双链小RNA能够显著改变细胞的基因表达,而这些基因表达谱的变化是有规律的,特定功能的基因优先发生变化。在表达下调的基因中,某些特定类型的基因变化非常显著,包括氨基酸代谢相关基因、Hedgehog信号途径基因和多巴胺受体D5基因等。这些结果表明,在使用siRNA时需要考虑其序列非依赖性地基因表达调控作用。     

转录因子与microRNA在基因表达调控中的功能联系及差异

转录因子和微RNA(microRNA)是最大的两类反式作用因子,它们是基因表达调控的重要调控因子.它们协调发挥调控作用,精细调控基因的表达,在细胞分化和动物生长发育过程中发挥重要的作用.随着对转录因子和microRNA研究的深入,人们发现转录因子和microRNA在基因表达调控网络中关系紧密,它们的分子作用机制有许多相似之处,两者都通过各自的顺式作用元件调控基因表达,且作用的方式类似.但转录因子和microRNA也存在不同之处,转录因子既可以激活基因表达,也可抑制基因表达,而microRNA主要是抑制基因表达.另外,转录因子调控区的复杂性一般高于microRNA的调控区域.本文综述了转录因子和microRNA的异同点,并提出了未来转录因子和microRNA的研究方向.     

miRNAs的表达调控机制

microRNAs(miRNAs)是一类在转录后基因调控中发挥功能的非编码小RNAs,在发育、生长和分化等过程中发挥重要作用.至今已经在动物、植物和微生物等不同生物体中鉴定出来数千种miRNAs. miRNAs可以通过降解mRNA或抑制蛋白翻译的方式调节特异基因表达.生物体内约30%的基因都受miRNAs的调节.miRNAs的表达与功能受到转录因子、表观遗传学、多核苷酸多态性及其RNA编辑等多种因素的调节.此外,特异miRNA基因敲除的成功为研究miRNAs功能提供了有力的实验模型.