tRNA甲基化修饰及其在神经系统疾病中的研究

转运RNA(transfer RNA,tRNA)上存在着大量的转录后修饰,对tRNA行使其正常的生物学功能发挥重要作用.目前已鉴定出100多种tRNA转录后修饰,其中以tRNA甲基转移酶(transfer RNA methyltransferases,Trms)介导的甲基化修饰最为常见.近年来随着tRNA转录组测序技术...     

3′-半分子5′-末端双链结构阻止tRNA连接酶酶促反应

用定点突变技术将不同核苷酸引入酵母苯丙氨酸tRNA反密码子环32,37和38位.体外转录制备tRNA前体,其32,37和38位的核苷酸与野生型tRNA前体相应位点的核苷酸不同.用纯化的酵母tRNA内切酶和tRNA连接酶对这些tR-NA前体进行剪接加工.结果说明,这些位点的核苷酸不仅影响tRNA内切酶对tR-NA前体的酶切效率,而且3’-半分子5’-末端双链结构阻止tRNA连接酶将相应的tRNA半分子连接成整分子tRNA.     

真核生物细胞质tRNA生物合成研究的进展

tRNA是蛋白质翻译机器中的必需成分,它对细胞的生长和增殖及器官的发育起着决定性作用.tRNA生物合成包括tRNA基因的转录、转录后的加工和修饰.对tRNA生物合成的研究还包括tRNA在细胞中的运输、tRNA生物合成的质量监控及其与其他重要细胞途径（如mRNA生物合成、DNA损伤应答和细胞周期）之间的相互作用,以及tRNA生物合成在生长发育和疾病中的作用.本文主要介绍了近年来真核生物细胞质tRNA生物合成研究的一些重要进展.     

大鼠肝tRNA~(Ile)基因的克隆与体外转录

采用PCR扩增出大鼠肝tRNAIle基因,构建了重组质粒pGWIW,并用T7RNA聚合酶／启动子系统对其进行了体外表达．经过对转录产物片段大小及运用Northernblot鉴定,证明获得了不含修饰核苷酸的大鼠肝tRNAIle生物学活性检测显示：合成基因体外转录产物氨基酰化活性是天然tRNA的40％,提示修饰核苷酸在哺乳动物Ile－tRNA合成酶的识别过程中起重要作用     

tRNA 2'-O-甲基化修饰及其修饰酶的生物学功能

转移核糖核酸(transfer RNA, tRNA)上存在着大量的转录后修饰,对tRNA发挥其生物学功能具有重要作用。甲基化修饰作为tRNA修饰中最广泛存在的一种,可以发生在核苷酸的碱基或者2'-O-核糖(2'-O-甲基化修饰)上。tRNA 2'-O-甲基化修饰广泛存在于古细菌、原核生物和真核生物中,并且在tRNA第4位、6位、18位、32位、34位、39位、44位、54位和56位均被鉴定到。研究表明,tRNA 2'-O-甲基化修饰参与调控tRNA的折叠和成熟、影响tRNA稳定性及反密码子与mRNA密码子配对的精确性,并与细胞生长、压力应激和免疫调控密切相关。人细胞质tRNA 2'-O-甲基化修饰缺陷常常与疾病密切相关,并且潜在的tRNA 2'-O-甲基修饰酶已经成为药物研发的新靶点。开展tRNA 2'-O-甲基化修饰及其修饰酶的研究将丰富人们对tRNA 2'-O-甲基化修饰的生物学功能的认识,并为探索tRNA 2'-O-甲基修饰酶在人类疾病中的致病机制打下基础。现将简要介绍已报道的tRNA 2'-O-甲基化修饰及其修饰酶的生物学功能。     

转移核糖核酸(tRNA)与癌症

转移核糖核酸(transfer RNA, tRNA)在蛋白质生物合成过程中起关键作用,是将遗传信息翻译成蛋白质一级结构的接头分子。tRNA长久以来一直被认为是基因表达调控过程中的执行者而不具备调控功能,更不曾与癌症的发生联系起来。最新研究表明,某些tRNA在癌细胞中异常表达,与癌症的发生和发展有密切联系。tRNA来源的小分子非编码RNA (tRFs和tiRNAs)是一类新的基因表达调控分子,tRFs可以调控癌基因的表达或者与RNA结合蛋白相互作用来调控癌细胞增殖和细胞周期进程。tRNA的转录后修饰能够调控mRNA翻译过程,进而影响癌细胞的生长。随着测序技术的发展,tRNA在癌症发生和发展中的调控作用成为近年来的研究热点,现将从"tRNA分子调控癌症的发生和发展"、"tRNA来源的小分子非编码RNA与癌症"以及"tRNA修饰与癌症"三个方面综述tRNA分子在癌症发生和发展中的调控功能。     

人线粒体tRNA修饰碱基与遗传性脑肌病

人的多种遗传疾病与线粒体tRNA基因突变有关,这些突变导致疾病发生的分子机理是当前研究的热点.通过研究线粒体tRNA分子上的碱基修饰情况,人们发现了一类特殊的带有牛磺酸衍生物基团的修饰,这类修饰主要位于线粒体tRNALys和线粒体tRNALeu(UUR)反密码子第一位摆动(wobble)位点的碱基上.最近的研究表明,位于这两种线粒体tRNA基因上的多种突变与遗传性脑肌病相关,包括A8344G,A3243G,T3271C等等,它们可以导致tRNA上相应摆动位点的碱基修饰缺失.无论是在体外培养的带有相应突变的细胞内,还是在来源于脑肌病病人的组织中,科学家都发现了相同的线粒体tRNA碱基修饰缺陷.通过分子手术证实,此类碱基修饰对于维持这两种tRNA的反密码子与mRNA上相应密码子的相互识别至关重要,缺失了这种修饰的tRNA将无法识别一些对应的密码子.通过进一步的实验,人们还鉴定出负责催化此类碱基修饰的酶.这些研究不但揭示了线粒体遗传性脑肌病相关突变的致病机理,也将为研究基因治疗提供可能的新手段.     

与内含子相邻的核苷酸是tRNA内切酶的识别特征

含有内含子的tRNA前体必须经过剪接反应加工成熟.顺序比较指出与内含子顺序相邻的核苷酸有一定的特异性.用寡核苷酸定点突变技术改变这2个位点的核苷酸,确定这些tRNA前体的剪接效率.结果如下:当37位和38位都是嘌呤核苷酸时,tRNA内切酶能够有效地酶切酵母 tRNA~(phe)前体;如果其中的 1个位点变成嘧啶核苷酸,但另1个位点的核苷酸是野生型的嘌呤核苷酸,tRNA前体的酶切效率将降低.如果2个位点的核苷酸都发生变异,其中1个是嘧啶核苷酸,另1个是变异的嘌呤核苷酸,tRNA前体的酶切效率就会进一步降低.如果2个位点都是嘧啶核苷酸,tRNA前体就难以为tRNA内切酶酶切了.由此提出,与内含子相邻的核苷酸也是tRNA由切酶识别的结构特征.tRNA前体的37位和38位核苷酸的改变可能影响剪接位点之间的距离或它们的精细结构,从而影响tRNA内切酶酶切的效率.     

十字花科黑腐病菌中存在tRNA衍生片段(tRF)的证据

tRNA衍生片段(tRNA-derived fragment,tRF)是一种由内切核糖核酸酶将初级tRNA(primary tRNA)或成熟tRNA分子剪切后形成的长度为14～30 nt(核苷酸)的稳定的RNA片段.研究表明,tRF广泛存在于各种真核生物中,它们既可以作为信号分子,又可以作为基因表达的调控因子,在细胞的...     

延伸因子复合物对真核生物tRNA的修饰作用

延伸因子复合物(Elongator complex, Elp)由6个亚基蛋白Elp1～6组成,在真核细胞生物中呈现高度的进化保守,提示其具有重要的生物学功能。研究表明,Elp涉及多种细胞行为如转录延伸、细胞外分泌、端粒基因沉默和DNA损伤修复、神经系统的发育和功能等。然而越来越多的证据显示,Elp通过介导tRNA修饰影响翻译过程,从而间接调控上述细胞行为。在人类,ELP1/IKBKAP突变可导致家族性植物神经功能障碍症,ELP2、ELP3和ELP4基因的遗传变异也可能与其他神经退行性病变相关。本文对Elp的结构、Elp修饰tRNA和Elp相关疾病等的研究现状及其进展进行综述。     

两种具有调节血管生成作用的氨基酰-tRNA合成酶

氨基酰-tRNA合成酶是生物体内蛋白质合成过程中的一类关键酶,它催化体内tRNA的氨基酰化反应.作为一类古老的蛋白质,氨基酰-tRNA合成酶在其漫长的进化过程中,通过其他结构域的插入或融合逐渐演化出许多新的功能.最近的研究结果表明,人酪氨酰-tRNA合成酶的片段具有促进血管生成的功能,而人色氨酰-tRNA合成酶的片段则具有抑制血管生长的功能.在哺乳动物细胞中,蛋白质的生物合成途径与细胞信号转导途径紧密相连.今后,随着对氨基酰-tRNA合成酶研究的不断深入,可以通过它们与细胞因子和信号转导相连的功能治疗人类的疾病.     

Wobble modification deficiency in mutant tRNAs in patients with mitochondrial diseases

Point mutations in mitochondrial (mt) tRNA genes are associated with a variety of human mitochondrial diseases. We have shown previously that mt tRNA(Leu(UUR)) with a MELAS A3243G mutation and mt tRNA(Lys) with a MERRF A8344G mutation derived from HeLa background cybrid cells are deficient in normal taurine-containing modifications [taum(5)(s(2))U; 5-taurinomethyl-(2-thio)uridine] at the anticodon wobble position in both cases. The wobble modification deficiency results in defective translation. We report here wobble modification deficiencies of mutant mt tRNAs from cybrid cells with different nuclear backgrounds, as well as from patient tissues. These findings demonstrate the generality of the wobble modification deficiency in mutant tRNAs in MELAS and MERRF.     

Avoidance of antisense, antiterminator tRNA anticodons in vertebrate mitochondria

Protein synthesis (translation) stops at stop codons, codons not complemented by tRNA anticodons. tRNAs matching stops, antitermination (Ter) tRNAs, prevent translational termination, producing dysfunctional proteins. Genomes avoid tRNAs with anticodons whose complement (the anticodon of the ‘antisense’ tRNA) matches stops. This suggests that antisense tRNAs, which also form cloverleaves, are occasionally expressed. Mitochondrial antisense tRNA expression is plausible, because both DNA strands are transcribed as single RNAs, and tRNA structures signal RNA maturation. Results describe potential antisense Ter tRNAs in mammalian mitochondrial genomes detected by tRNAscan-SE, and evidence for adaptations preventing translational antitermination: genomes possessing Ter tRNAs use less corresponding stop codons; antisense Ter tRNAs form weaker cloverleaves than homologuous non-Ter antisense tRNAs; and genomic stop codon usages decrease with stabilities of codon-anticodon interactions and of Ter tRNA cloverleaves. This suggests that antisense tRNAs frequently function in translation. Results suggest that opposite strand coding is exceptional in modern genes, yet might be frequent for mitochondrial tRNAs. This adds antisense tRNA templating to other mitochondrial tRNA functions: sense tRNA templating, formation and regulation of secondary (light strand DNA) replication origins. Antitermination probably affects mitochondrial degenerative diseases and ageing: pathogenic mutations are twice as frequent in tRNAs with antisense Ter anticodons than in other tRNAs, and species lacking mitochondrial antisense Ter tRNAs have longer mean maximal lifespans than those possessing antisense Ter tRNAs.     

Large Conformational Changes of Insertion 3 in Human Glycyl-tRNA Synthetase (hGlyRS) during Catalysis

Glycyl-tRNA synthetase (GlyRS) is the enzyme that covalently links glycine to cognate tRNA for translation. It is of great research interest because of its nonconserved quaternary structures, unique species-specific aminoacylation properties, and noncanonical functions in neurological diseases, but none of these is fully understood. We report two crystal structures of human GlyRS variants, in the free form and in complex with tRNA^Gly respectively, and reveal new aspects of the glycylation mechanism. We discover that insertion 3 differs considerably in conformation in catalysis and that it acts like a “switch” and fully opens to allow tRNA to bind in a cross-subunit fashion. The flexibility of the protein is supported by molecular dynamics simulation, as well as enzymatic activity assays. The biophysical and biochemical studies suggest that human GlyRS may utilize its flexibility for both the traditional function (regulate tRNA binding) and alternative functions (roles in diseases).