以软刻技术微图案化培养纹状体神经元的形态学研究

探讨以软刻技术微加工带正电荷的聚乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI)图案,对培养纹状体神经元黏附存活及突起生长的影响．以软刻技术(微接触印刷方法)微加工三种不同的黏附底物：层粘连蛋白(laminin, LN)、带正电荷的多聚赖氨酸(poly-L-lysine, PLL)和PEI．新生乳鼠纹状体神经元体外分离培养,观察不同黏附底物对纹状体神经元黏附、存活和突起生长状态的影响,观察神经元在不同黏附底物上形成网络图案的差异．结果表明,在PEI 和PLL表面生长的神经元数量明显大于LN组,PEI与PLL、LN相比能形成更为完整的神经元图案．带强正电荷的PEI有助于神经元在其表面形成相对完整的图案,是构建体外神经网络的一种良好界面材料．     

钩端螺旋体层粘连蛋白结合蛋白Lsa20的表达与功能分析

目的:表达并纯化可溶性重组钩端螺旋体层粘连蛋白结合蛋白Lsa20,并对其与层粘连蛋白(LN)相互作用的生物特性进行分析。方法:优化合成Lsa20基因,连接到表达载体p ET28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达,然后利用Ni-NTA亲和介质纯化目标蛋白,重组蛋白经超滤浓缩后,进行相关ELISA、流式细胞术、间接免疫荧光实验。结果:构建了重组蛋白表达菌株,目标蛋白呈可溶性表达,纯化后纯度达90%以上;ELISA证实重组Lsa20与LN有较强的亲和力,测得解离常数为(27.23±2.53)nmol/L;流式细胞术及间接免疫荧光实验结果表明重组Lsa20可黏附到COS-7细胞表面。结论:重组Lsa20在体外能够与层粘连蛋白结合,具有同天然蛋白类似的生物学特性。同时,以Lsa20与LN相互作用实验为例,建立了研究LN结合蛋白生物功能的基本方案,为后续鉴定和研究新的LN结合蛋白的作用规律及黏附机制奠定了良好的实验基础。     

层粘连蛋白与疾病相关性的研究进展

层粘连蛋白(lanminin,LN)是由3条多肽链组成的异源三聚体,是基膜的主要成分,存在于多种组织中,它可识别细胞表面受体从而使基膜与细胞紧密结合。LN参与基膜的构建及细胞的黏附、生长、增殖、迁移和分化,是机体正常生长发育所必需的。LN的不正常表达常常与肿瘤以及皮肤、神经-骨骼肌、肝、肾等组织疾病的发生发展密切相关。通过深入探讨LN与疾病及肿瘤发生、发展的关系,有望为相关疾病及肿瘤的治疗开拓新的思路。     

新型阳离子基因传递载体PEI-PBLG的细胞转染研究

对新型阳离子聚合物PEI(10kD)-PBLG进行研究,重点考察其基因转染效率与细胞毒性,探讨其作为基因载体的可能性。通过粒径分析及扫描电镜(SEM)观察PEI(10kD)-PBLG与质粒pEGFP自组装形成的颗粒形态及粒径,预测其进入细胞的可能性。使用MTT比色法分析PEI(10kD)-PBLG、PEI(25kD)-PBLG、PEI(10kD)和PEI(25kD)的细胞毒性差异。选用表达增强型绿色荧光蛋白的质粒pEGFP作为报告基因模型,将其与PEI(10kD)-PBLG自组装后,分别转染真核细胞株Hela、COS-7、Vero-E6和ECV304,应用流式细胞术检测细胞转染效率,并比较了血清、缓冲液、细胞谱等多种因素对基因转染效率的影响。PEI(10kD)-PBLG可包裹质粒形成粒径100~120nm的纳米复合物,适合介导质粒进入细胞。该纳米粒复合物对转染缓冲液的敏感度较低,并能够在10%血清存在的条件下,转染全部实验用细胞株,尤其对Hela的转染效率最高,其次是COS-7、Vero-E6和ECV304;其中PEI-PBLG(10kD)/pEGFP复合物转染Hela细胞的比率为45.02%,高于PEI(10kD)/pEGFP的29.16%;PEI(10kD)-PBLG的细胞毒性作用显著低于PEI(25kD)、PEI(10kD)和PEI(25kD)-PBLG。新型阳离子多聚物PEI(10kD)-PBLG在提高PEI介导的基因转染效率的同时降低了其细胞毒性,提高了生物相容性,有望成为基因转移的有效载体。     

狼疮性肾炎病变肾组织中bFGF、CD68和PCNA表达的研究

目的　通过对狼疮性肾炎 (LN)与肾小球轻微病变 (GML)肾组织中bFGF、CD6 8、PCNA的原位检测和相关分析 ,以了解它们在LN发病中的意义及其相互关系。方法　以 14例GML为对照组 ,采用ABC免疫组化法对 2 3例LN病例的肾穿刺组织 ,分别检测其bFGF、CD6 8和PCNA表达情况。结果　与GML病例相比 ,LN组肾小球bFGF表达明显增强 (P <0 0 5 ) ,CD6 8和PCNA表达的阳性细胞数也明显增多 (P <0 0 1) ;IV型LN组肾小球bFGF明显强于II型LN组 ;LN组肾小球内CD6 8+ 与PCNA+ 细胞数间呈正相关 (r =0 5 6 ,P <0 0 5 ) ,其中IV型LN组中有肾小球新月体形成的病例 ,CD6 8+ 与PCNA+ 细胞数间也呈正相关 (r =0 86 ,P <0 0 5 )。结论　LN病变肾小球bFGF、CD6 8和PCNA表达均明显增强 ,其表达在某种程度上可反映临床LN病变程度的严重性。     

两种阳离子纳米基因载体及植物基因介导效果的研究

以阳离子聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)和壳聚糖(chitosan, CS)作为两种植物基因载体,分别制备了载基因PEI纳米粒(PEI/DNA)和壳聚糖-DNA纳米粒(CS/DNA),并对其形态、粒度分布、包封率、DNA结合的稳定性及纳米颗粒对DNA的保护等方面进行表征.并以GFP基因为报告基因进行植物细胞转染,比较两者转化效率.结果表明PEI/DNA纳米粒稳定性,对DNA的保护以及转染效率等方面均优于壳聚糖-DNA纳米粒.     

彩色多普勒超声对无水酒精治疗肝细胞癌早期疗效的评价

目的:探讨彩色多普勒超声评价无水酒精治疗肝细胞癌早期疗效的临床应用价值。方法:利用彩色多普勒血流显像(CDFI)、彩色多普勒能量图(CDE)检查技术,经皮无水酒精瘤内注射(PEI)治疗52例肝细胞癌(肿块直径1.65.0cm),疗程结束后一周,以CDFI及CDE血流显示的有无作为评价PEI早期疗效的观察指标,并行组织学活检病理检查。结果:52个肿块经PEI治疗后,CDFI及CDE示大部分肿块血流信号消失,小部分肿块能检出血流信号,但较治疗前明显减少。以病理检查结果为金标准,CDFI及CDE评价PEI治疗后肿瘤的灭活情况,其敏感性为:50.0%、77.8%,准确性为78.8%、90.4%,Kappa值为:0.486、0.779。结论:CDFI、CDE动态监控PEI治疗过程对指导治疗意义重大,CDFI、CDE评价PEI结果客观、可靠,CDE可以敏感而直观地显示PEI治疗后肿瘤周边及内部残存的血流信号,对指导PEI治疗、时机及靶目标的选择以提高疗效具有重要的临床应用价值。     

QCM 监测自组装膜上心肌细胞黏附及其与心血管药物作用

目的:本试验采用石英晶体微天平(QCM)实时监测大鼠心肌细胞(H9C2)在含有细胞黏附识别多肽RGD自组装膜上的动态黏附过程及随后与两种心血管药物(一种正性肌力、另一种负性肌力)相互作用。方法:在金电极表面自组装3-巯基丙酸(MPA)单层膜,并经酰胺化共价耦合细胞黏附分子KRGD,形成对大鼠心肌细胞有特异性黏附的致密分子自组装膜。QCM以动态持续的方式实时监测MPA/RGD自组装及其不同浓度梯度H9C2细胞在自组装膜金电极上的细胞黏附过程。此外,选用20,000个H9C2细胞和正性肌力药物异丙肾上腺素、负性肌力药物维拉帕米,用QCM评估了细胞-心血管药物的相互作用。结果:与裸金电极相比,MPA/RGD修饰金电极增大了H9C2细胞黏附所引起的QCM频移(△f)与动态电阻变化(△R)响应。在所试H9C2浓度范围(5×10~4-4×10~5 cells/m L),△f与H9C2浓度呈线性关系,△R与H9C2浓度呈幂函数关系。我们用细胞粘弹性指数(CVI=△R/△f)来表征细胞的粘弹性。H9C2在异丙肾上腺素作用下,△f与△R增加、细胞-QCM表面黏附加强,细胞变硬;在维拉帕米作用下,△f与△R降低、细胞QCM表面黏附减弱,细胞变软。结论:QCM可用于不同浓度大鼠心肌细胞的动态细胞黏附监测,并可基于其细胞黏附与细胞黏弹性测定能力区分正性与负性肌力药物而可望用于心血管药物的筛选。     

食品上的应用

923091经粘着作用表面固定与食品有关的微生物细胞〔会,英〕/D,Souza,5.F.了Food Bioteehnol一1991,透(1)一373一382仁译自DBA,1992,11 (3),92一01748〕 用面包酵母(酿酒酵母)验证了一种在多种聚合物表面上固定细胞的新方法。将酿酒酵母细胞与一2%聚乙烯亚胺(PEI)(P H7)悬于水中温育 2小时,并与玻璃片、丙烯酸片、棉布或棉丝载体共同深温。还可将载体置于。.2%PEI中浸饱2小时使之具聚阳离子特性,再与天然细胞一起温育20分钟。PEI处理的细胞在玻璃表面(模型系统)单层粘着。处理细胞或用PEI处理棉布后细胞粘着在棉布上。在PEI处理的…     

一种新的非病毒基因转移载体及其体外细胞转染活性研究

目的：用低分子量的聚乙亚胺(PEI)有效地进行基因转染,为基因转染在基因治疗中的应用提供一种可靠、廉价、高效的方法。方法：将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的真核表达质粒与阳离子聚合物聚乙亚胺(PEI)结合,用肝癌细胞系SMMC7721实验,研究PEI分子量与转染活性以及可能引起的细胞毒性之间的关系;进一步研究在血清存在的情况下,PEG(聚乙二醇8000)、叶酸等物质对PEI介导的转染效率的影响。结果：分子量为600Da的PEI在pH值为6．0时与质粒DNA以1：1的质量比混合,细胞转染效率最高为43．6 /-7．3％,随着分子量的增大,转染活性略有下降;进一步研究发现,在血清存在下,20μM的叶酸和15％的PEG能有效地改善PEI介导的转染活性,使其转染活性提高了13％;用光学相差显微镜检测了PEI潜在的细胞毒性,结果发现分子量为600Da的PEI没有使细胞形态改变或死亡,但是随着分子量的增大,PEI潜在的细胞毒性也相应增大。结论：PEI是一种高效、有用的非病毒载体,能够在培养的哺乳动物细胞中进行基因转移,这对疾病的基因治疗具有潜在的应用价值。     

彩色多普勒超声对无水酒精治疗肝细胞癌早期疗效的评价

目的：探讨彩色多普勒超声评价无水酒精治疗肝细胞癌早期疗效的临床应用价值。方法：利用彩色多普勒血流显像(CDFI)、彩色多普勒能量图(CDE)检查技术,经皮无水酒精瘤内注射(PEI)治疗52例肝细胞癌(肿块直径1．65.0cm),疗程结束后一周,以CDFI及CDE血流显示的有无作为评价PEI早期疗效的观察指标,并行组织学活检病理检查。结果：52个肿块经PEI治疗后,CDFI及CDE示大部分肿块血流信号消失,小部分肿块能检出血流信号,但较治疗前明显减少。以病理检查结果为金标准,CDFI及CDE评价PEI治疗后肿瘤的灭活情况,其敏感性为：50．0％、77.8％,准确性为78．8％、90．4％,Kappa值为：0．486、0．779。结论：CDFI、DE动态监控PEI治疗过程对指导治疗意义重大,CDFI、CDE评价PEI结果客观、可靠,CDE可以敏感而直观地显示PEI治疗后肿瘤周边及内部残存的血流信号,对指导PEI治疗、时机及靶目标的选择以提高疗效具有重要的临床应用价值。     

用聚乙烯亚胺反向转染siRNA表达盒进行RNA干扰的研究

目的:建立适用于大规模RNA干扰(RNAi)筛选的siRNA生成与导入技术。方法:以绿色荧光蛋白(GFP)为模型,用PCR方法生成了包含U6启动子、互补的反义链和正义链以及终止序列的特异性siRNA表达盒(SEC),对聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染SEC的方法及其效率进行研究。结果:PEI对细胞的毒性呈剂量依赖关系,当PEI与DNA的N/P=7.53,即PEI与DNA等量时,转染效率达到最高。PEI与脂质体LipofectAMINETM2000的转染效率无显著差异(P>0.05),对SEC的转染效率显著高于质粒载体(P<0.01)。反向转染的转染效率显著高于常规转染(P<0.01)。利用PEI将表达GFP特异性siRNA的SEC反向转染可稳定表达GFP的HeLa细胞株(HeLa-EGFP),荧光染色和Western印迹检测均表明可显著抑制GFP的表达。结论:PEI介导的SEC反向转染具有简便、快捷、经济的优点,可满足大规模RNAi筛选的需要。     

高效凝胶色谱法测定聚乙烯亚胺的分子量及其分布

目的:探讨高效凝胶色谱法测定聚乙烯亚胺(PEI)及其衍生物的分子量及其分布.方法:采用Ultrahydrogel 250(300mmx7.8mm)色谱柱;以已知相对分子量的PEI为标样;醋酸-醋酸盐缓冲液(0.2mol/l醋酸-0.1mol/l醋酸钠)为流动相;柱温40℃;流速lml/min;示差折光检测器.结果:测得自制PEI衍生物的重均分子量(Mw)为5093,数均分子量(Mn)为2090、Z均分子量(Mz)为11031,分布宽度(Mw/Mn)为2.44.结论:高效凝胶色谱法操作简单、灵敏度高,适合于快速、简便地测定PEI及其衍生聚合物的分子量及其分布.     

层黏连蛋白基质在肿瘤细胞行为及血管生成拟态形成中的机制研究

血管生成拟态(vasculogenic mimicry, VM)描述了肿瘤细胞在无内皮细胞参与下形成新的微循环模式的过程。临床上,VM与侵袭性表型和较差的患者生存率有关。以前的许多研究都集中在血管生成因子方面;最近的研究发现,肿瘤细胞周围的细胞外基质对肿瘤发展具有显著调控作用。细胞外基质蛋白质可能授予肿瘤细胞形成血管生成拟态的能力。在本研究中,我们研究了层黏连蛋白(laminin, LN)基质在黑色素瘤和骨肉瘤的肿瘤进程和VM形成中的作用。相较于Control组,高浓度LN基质培养下,肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移、干性表达和VM形成能力显著增强;利用免疫荧光染色和实时定量PCR分析其内在的分子机制,结果显示：与对照组相比,层黏连蛋白基质可以显著促进肿瘤细胞CD133的表达,同时E-钙黏着蛋白I的mRNA表达下调(P<0.05),而Integrin、N-cadherin、Vimentin以及Snail、Twist的mRNA表达上调(P<0.05)。以上研究结果表明,层黏连蛋白促进肿瘤细胞的黏附、增殖、迁移和VM形成能力,并揭示了VM形成的潜在机制,为后期抗血管生成拟态的诊疗提供...     

昆虫细胞制备AAV-ITR基因表达微载体

AAV-ITR基因表达微载体是只含有腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)倒置末端重复序列(Inverted terminal repeats,ITR)、基因表达顺式元件和目的基因,而不含有其他外源DNA序列的双链或单链DNA。本研究利用杆状病毒表达系统,制备得到两种重组杆状病毒Bac-ITR-EGFP和Bac-inrep,并将二者的P3代病毒共同感染昆虫细胞Spodoptera frugiperda(Sf9),抽提小分子量DNA,获得AAV-ITR-EGFP基因表达微载体,2×107的Sf9细胞抽提可以得到100μg AAV-ITR-EGFP基因表达微载体,核酸电泳显示AAV-ITR-EGFP基因表达微载体主要以单体和二聚体的形式存在。将AAV-ITR-EGFP基因表达微载体通过polyethylenimine(PEI)转染HEK 293T细胞,24 h后荧光显微镜观察有EGFP表达,48 h后达到高峰,转化效率达到65%。     

层粘连蛋白促进实体型瘤细胞粘着、铺展及~3H-TdR参人

 恶性肿瘤细胞或粘着于基膜以及在一定的基质上增殖对于肿瘤的浸润转移至关重要。层粘连蛋白(1aminin,LN)是基膜所特有的非胶原糖蛋白。我们研究了LN在肿瘤细胞粘着、铺展及增殖中的作用。通过测定粘着细胞所释放的LDH活性定量分析细胞粘着率。LN可显著增加体外培养的小鼠S180-V肉瘤及B16-MBK黑色素瘤细胞在玻璃及Ⅳ型胶原基质上粘着及铺展。纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)亦有类似作用。而非糖蛋白(牛血清清蛋白)或其他糖蛋白(鸡卵清清蛋白或免疫球蛋白)均无类似作用。此外,LN或FN抗体可分别抑制细胞粘着于LN或FN。这些结果表明LN或FN促细胞粘着作用是专一性的。扫描电镜观察表明,粘着在LN敷盖的玻璃表面的瘤细胞呈多突扁平形、膜皱襞及微绒毛十分稀少,而粘着在裸露的玻璃表面者为球形,膜皱襞及微绒毛甚多。再者,~3H-TdR向粘着于LN基质上的瘤细胞群的参入量显著高于粘着在裸露玻璃面者。     

黄土丘陵区不同功能群植物碳氮磷生态化学计量特征及其对微地形的响应

研究黄土丘陵区植物碳氮磷生态化学计量特征及其对微地形变化的响应,对于深入理解植物对丘陵山地环境的适应策略具有重要的意义。以黄土丘陵区森林草原带不同微地形环境(坡向、坡位)下的不同功能群植物为研究对象,对不同功能群植物叶片和细根的C、N、P含量及其化学计量特征进行了研究。结果表明:(1)叶氮含量(LN)、叶磷含量(LP)、根氮含量(RN)、根碳含量(RC)、叶碳/叶氮(LC/LN)、叶碳/叶磷(LC/LP)、叶氮/叶磷(LN/LP)、根碳/根氮(RC/RN)和根氮/根磷(RN/RP)在科属间差异显著(P0.05),而叶碳含量(LC)、根磷含量(RP)和根碳/根磷(RC/RP)在科属间差异不显著(P0.05)。(2)不同科属植物生态化学计量特征对微地形变化的响应不同,禾本科细根C/N在阴坡、阳坡差异性显著,豆科植物根N含量在不同坡位间差异显著(P0.05);菊科植物叶N含量、叶C含量、根N含量、叶片C/N和细根C/N在不同坡位间差异显著(P0.05)。(3)禾本科植物在中坡位受N、P元素共同影响,在其它坡位主要受N元素限制;豆科植物在中坡位和上坡位主要受P元素限制,在下坡位和峁顶受N、P元素共同影响;菊科植物上坡位受N、P元素共同影响,在其他坡位主要受N元素限制。研究表明,不同科属植物在不同微地形条件下受限的营养元素不同,对丘陵多变环境也存在不同的适应策略。     

CHO-K1细胞中基因瞬时转染的条件优化

目的:以CHO-K1细胞为宿主基因瞬时转染条件的优化.方法:以GFP(Green Fluorescence Protein)为报告基因,考察了DNA∶PEI比例、DNA用量及血清的加入对CHO-K1细胞的转染效率和细胞数目的影响.结果:DNA∶PEI=1∶2(w/w)、2 gDNA/106 cells时,转染结果最优;血清的加入可降低细胞转染效率.结论:在CHO-K1细胞中进行瞬时转染的最佳条件为DNA∶PEI=1∶2(w/w)、2 gDNA/106 cells,及血清的加入抑制细胞转染.     

交联聚乙烯亚胺衍生物的构建及其转染COS-7 细胞的研究

目的:优化构建交联聚乙烯亚胺(Polyethylenemine,PEI)衍生物PEI-Bu,研究其对非洲绿猴肾成纤维细胞系(COS-7)的转染活性和细胞毒性。方法:以PEI 800Da为骨架,1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂制备聚合物PEI-Bu,琼脂糖凝胶电泳考察其复合质粒DNA的能力,MTT法检测PEI-Bu对COS-7的毒性,以荧光素酶质粒作为报告基因,测定PEI-Bu/DNA复合物在COS-7细胞的转染活性。结果:凝胶电泳表明PEI-Bu/DNA在质量比大于1时即具有复合DNA的能力,PEI-Bu的细胞毒性随浓度增大而增大,在同一浓度下PEI-Bu的细胞毒性小于PEI 25kDa,(P<0.05),PEI-Bu/DNA在质量比为5时达到最高转染活性,高于PEI 25kDa(P<0.01),并与Lipofectamine2000相当(P>0.05)。结论:PEI-Bu在COS-7细胞中是一种低细胞毒性、高转染活性的非病毒基因载体(与商业化的PEI 25kDa比较),其在基因治疗领域中具有潜在的应用前景。     

纸基微流体技术在即时检测中的应用

即时检测(Point-of-care testing,POCT)是在采样现场或病人旁边进行的一种检测方式,它利用便携式分析仪器及配套试剂进行检测,能快速得到结果,被广泛应用于体外诊断行业。其中纸基微流体检测技术以其成本低廉、操作简单、检测快速、设备便携、应用不受场所限制等优点在发展现场POCT技术中具有非常大的潜力。近年来,纸基微流体技术的发展及其与各种新技术、新方法的融合推动了POCT技术和方法的实质性发展。文中简要概括了纸的分类与特性,介绍了基于纸基微流体技术发展而来的样本前处理方法、反应过程中的液流控制方式、反应后检测结果的读取与分析手段,综述了近年来在面向POCT应用中各类基于纸基微流体的分析装置(Microfluidicpaper-basedanalyticaldevices,μPADs)的研究进展,最后对纸基微流体技术在POCT应用中存在的问题进行了讨论,并对未来前景作了展望。