瞬时转染金属硫蛋白-3基因后人神经母细胞瘤细胞系SH—SY5Y细胞的蛋白质差异表达

金属硫蛋白 3(MT 3) ,又称神经生长抑制因子 ,主要表达于中枢神经系统。它属于金属硫蛋白家族 ,但具有几项其他家族蛋白质如MT 1/ 2等所不具有的独特性质 ,是一种多功能蛋白质 ,可在中枢神经系统中发挥重要的神经调节和神经保护作用 ,但是具体发挥机制还很不清楚。实验以人神经母细胞瘤细胞系SH SY5Y为模型 ,运用最近发展起来的比较蛋白质组学研究方法对MT 3基因瞬时转染引起的SH SY5Y细胞蛋白质的整体变化进行了系统的研究。经考马斯亮蓝染色 ,结果表明 ,MT 3转基因后平均每块胶上可检测到约 75 0个蛋白质点。利用ImageMaster 2DElite软件对胶上的蛋白质点进行半定量分析 ,发现共有 17个蛋白质点呈显著的变化 :和对照组比较 ,在这 17个点中 ,有 12个表达明显上调 ,有 5个表达水平明显下降 ,实验结果具有可重复性。结合pI值和分子量 ,应用基质辅助激光解吸 /电离飞行时间质谱对这 17个点进行分析 ,鉴定了其中 10个点 ,包括类锌指蛋白 ,谷氨酸转运蛋白和增强蛋白等。这些蛋白质都可在神经系统功能的调节中发挥作用。实验结果表明MT 3可能是通过调节和 /或协同这些蛋白质来发挥它的多种功能的。     

新基因BRD7对鼻咽癌蛋白质表达谱影响的初步研究

BRD7基因是与鼻咽癌相关的候选抑瘤基因.为了进一步研究该基因的作用机制,将pcDNA3.1(+)/BRD7的表达质粒经脂质体导入HNE1细胞,RNA斑点杂交筛选出阳性克隆,通过双向电泳分离过表达BRD7的HNE1细胞内蛋白质,筛选出差异表达的蛋白质点,并进行质谱分析鉴定.鉴定出10种表达上调的蛋白质点,包括精氨(基)琥珀酸裂解酶,TSA(thio-specific antioxdant), Proteaseome activator28 beta subunit(PA28),金属蛋白酶抑制因子-2前体等,这些蛋白质涉及细胞生长,细胞代谢等很多相关事件.这些结果说明BRD7基因可能通过多种途径影响鼻咽癌的发生发展.     

Pten^＋/＋MEFs与Pten^-/-MEFs细胞系的差异表达蛋白质组分析

目的：研究PTEN缺失细胞的蛋白表达规律。方法：用双向电泳技术比较Pten^＋/＋MEFs与Pten^-/-EFs细胞的蛋白表达差异;用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对差异蛋白进行质谱分析;用肽质量指纹图谱检索数据库对差异蛋白进行鉴定;用Northern印迹和Western印迹验证蛋白的差异表达。结果：与Pten^＋/＋MEFs细胞相比。Pten^-/-MEFs细胞有明显的差异性蛋白表达谱,Pten^-/-MEFs细胞中表达下降的蛋白有铜锌超氧化物歧化酶、过氧化物氧化还原酶5和6等,表达增加的蛋白有低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶和丝切蛋白（cofflin）1。结论：PTEN的缺失引起细胞内多种蛋白表达改变,这些表达改变的蛋白可能与PTEN缺失后细胞癌变相关。     

苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体蛋白的双向电泳飞行时间质谱分析

根据苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体蛋白的特性,对裂解液组成、上样量、聚焦时间等相关技术进行了比较研究和条件优化,首次获得苏云金杆菌杀虫晶体蛋白双向电泳图谱,并对部分蛋白质点进行胰酶酶解,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDITOFMS）测定肽质量指纹图谱,Mascot软件查询SwissProt数据库,最终鉴定出苏云金杆菌4.0718菌株伴孢晶体中所含的Cry1Ac和Cry2Aa蛋白,其精确分子量分别为134160Da和71097Da。     

大豆种子萌发过程中的差异蛋白质组研究

运用蛋白质组学技术对大豆(Glycinemax)N2899种子萌发0h、8h、36h、60h4个时期蛋白质的差异表达情况进行了研究.结果发现,在考马斯亮蓝染色的双向电泳pH3～10胶上,PDQuest图像分析软件可识别的点约350个,其中表达量变化2.5倍以上的蛋白质点有24个,而绝大部分大豆种子贮藏蛋白在萌发期尚未降解.在萌发的第一阶段,24个差异表达蛋白中有10个蛋白质的丰度发生变化.第二阶段,差异表达蛋白的种类和量增加,其中15个蛋白质是动态变化的,14个蛋白质在胚根突破种皮时表达量达到峰值,表明吸胀后种子内的生命活动越来越强.对这24个蛋白质点进行胶内酶解,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定均获得肽质量指纹图谱.搜索大豆的UniGene库初步鉴定出6个蛋白质,分别是核苷二磷酸激酶、热激蛋白、硫氧还蛋白、35ku种子成熟蛋白及种子成熟蛋白PM36.对这些蛋白质在种子萌发过程中可能的作用进行了讨论.     

考马斯亮蓝染色双向电泳凝胶胶内酶切方法的改进

介绍一种简便高效的从考马斯亮蓝染色的双向电泳凝胶切取蛋白质点,通过胶内酶切制备基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI—TOF-MS)样品的方法。该方法操作简便,样品的质谱鉴定结果经网上数据库检索检出率可高达80％以上,适于我国目前小规模蛋白质组学研究的国情,便于推广应用。     

MALDI-TOF质谱在细菌检测及鉴定中的研究进展

近年来,随着质谱技术的快速发展,软电离方式的出现,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱能够对蛋白质、核酸及脂类等生物大分子进行快速、准确的分析,进而使得其被应用于细菌的检测及鉴定成为可能。本文综述了当前基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱在细菌检测及鉴定方面的研究进展。     

采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定曲霉属Flavi组和Fumigati组的一些种（英文）

一些曲霉是主要的食物腐败菌及人的病原体,特别是免疫系统受损的病人可能导致严重的感染。本研究评价了利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对一些临床和环境中重要的Flavi组和Fumigati组曲霉,进行鉴定的可能性,并将结果与形态学及测序结果(ITS区和部分-tubulin和钙调蛋白基因)进行比较分析。通过曲霉中34个Flavi组菌株和30个Fumigati组菌株的质谱分析,来建立基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的数据库。对光谱数据进行聚类分析表明Fumigati组的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的结果与系统发育结果完全一致;Flavi组的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法将A.flavus,A.oryzae,A.sojae和A.parasiticus分开的效果比测序方法好。随后,再选取用于验证数据库的50个菌株中49个(98%)菌株用质谱数据得到正确鉴定。对于分离本研究中曲霉的隐形种,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱方法优于测序方法。这种方法可以用于曲霉临床实验室鉴定的标准方法,因为临床需要快速和稳定的鉴定方法,这对于适当的治疗方案的选择很重要,此方法同样适于环境研究工作。     

温度对人肺癌细胞A549蛋白质表达的影响

肺癌蛋白质组的研究,有助于阐明其发病机制并对肺癌的防治有益。本文从研究人肺癌细胞热休克蛋白的表达情况出发,通过比较37℃、42℃和45℃培养条件下的人肺癌细胞A549总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个温度敏感的差异蛋白点,依次命名为P1、P2、P3。对差异蛋白进行MALDI－TOF－MS分析和采用SWISS－PROT数据库中的Peptident软件检索后,初步鉴定P1与2种醛酮还原酶家族成员相匹配,P2可能为一种新蛋白,P3为锌指蛋白11A。     

温度对人肺癌细胞 A549蛋白质表达的影响

肺癌蛋白质组的研究,有助于阐明其发病机制并对肺癌的防治有益。本文从研究人肺癌细胞热休克蛋白的表达情况出发,通过比较37℃、42℃和45℃培养条件下的人肺癌细胞A549总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个温度敏感的差异蛋白点,依次命名为P_1、P_2、P_3。对差异蛋白进行MALDI-TOF-MS分析和采用SWISS-PROT数据库中的Peptident软件检索后,初步鉴定P_1与2种醛酮还原酶家族成员相匹配,P_2可能为一种新蛋白,P_3为锌指蛋白11A。     

应用二维电泳和质谱技术初步研究NAG7基因的功能

为了进一步研究鼻咽癌相关基因NAG7的功能,NAG7基因编码框的cDNA片段被亚克隆至pcDNA3.1( )的表达载体,通过脂质体转染入鼻咽癌细胞系HNE1。抽提HNE1细胞和已转染了NAG7基因的HNE1细胞总蛋白质,用二维凝胶电泳分离蛋白质,获得二维凝胶图谱,PDQuest软件包分析后,确立表达上调的蛋白质斑点进行质谱分析,得到的肽质指纹经蛋白质数据库分析鉴定蛋白质。共分析了12个蛋白质点,其中3个未有质谱结果,已鉴定的9个蛋白质包括生长捕获特异蛋白、DNA结合蛋白、c-myc启动子结合蛋白及胱冬肽酶（caspase)6等蛋白质。通过对这些蛋白质性质和功能的讨论,发现它们参与了细胞周期调控、转录调节及细胞凋亡等重要事件。因此,VAG7很可能是通过介导上述蛋白质的表达上调而发挥作用。     

Combination of Micropreparative Capillary Electrophoresis and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry for Peptide Analysis

Signal suppression is a problem in matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of peptides prepared by capillary electrophoresis. Many common electrolytes that are efficient for separation, such as sodium phosphate, also are strongly suppressive during laser desorption/ionization. We have tested individual electrolytes for highest performance in each step of separation and collection, respectively. Suppression is not observed if citrate, trifluoroacetic acid, or hydrochloric acid is used for collection, while phosphate still can be employed in the capillary providing excellent resolution. Low concentrations of hydrochloric acid added to the sample/matrix mixture generate mass spectra with better ion intensities than if trifluoroacetic acid or citrate is used.     

二维电泳和质谱技术鉴定肝癌血清差异表达的N-连接糖蛋白

缺乏有效的早期诊断方法是导致肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)预后极差的主要原因之一.蛋白质异常糖基化与恶性肿瘤细胞侵袭、转移等生物学过程关系密切,人体内至少有50%的蛋白质发生了糖基化修饰.本实验采用IgY12去除血清高丰度蛋白、多植物凝集素亲和层析技术分别从20例肝癌和年龄、性别匹配的20例非癌慢性肝病患者血清中纯化N 连接糖蛋白、二维电泳分析差异表达的蛋白质斑点,质谱检测、生物信息学等技术鉴定了18个差异表达的糖蛋白和/或其异质体（12种高表达和6种低表达）.ExPASy数据库比对结果表明,本实验鉴定的糖蛋白质分子含有至少1个已报道的N 糖基化位点.这些差异表达的糖蛋白属于急性期反应蛋白,分别具有蛋白酶抑制、生物转运、凝血和纤溶等功能,表明肝癌的发生发展过程中机体产生的急性期反应物可能是潜在的肝癌血清标志物.     

正常与重金属铅注射的兔脑蛋白质双向电泳图谱比较与鉴定

重金属污染对人类健康的威胁日益受到关注,为了了解大量重金属摄入对脑蛋白质的影响,对比研究了正常兔脑组织蛋白质与重金属铅腹腔注射2周后的兔脑组织在蛋白质双向电泳图谱中的差异,分析重金属注射对脑蛋白质表达的可能影响.通过对脑组织蛋白质的提取,分离出水溶性的蛋白质组分,经双向电泳图谱比较正常与注射重金属铅的兔子在脑蛋白质表达上的差异,其中3个蛋白质斑点经提取,反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离,基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-TOF MS)确定了分子质量,并利用肽质量指纹图谱检索数据库确定蛋白质的归属.实验结果表明正常兔脑与金属铅注射的兔脑在水溶性蛋白质的表达上具有显著性差异.     

应用二维电泳和质谱技术筛选喉癌及癌旁组织中的差异表达蛋白质

目的分离并鉴定喉癌和癌旁正常粘膜组织的差异表达蛋白质,为喉癌早期临床诊断、治疗提供新的有关的肿瘤生物学标记和靶标。方法收集5对人喉癌组织和对应的癌旁正常粘膜组织,提取组织总蛋白质,采用二维凝胶电泳技术分离蛋白并进行比较。选择在喉癌中明显差异表达的蛋白质点,进行质谱分析。结果获得了分辨率和重复性均较好的凝胶蛋白图谱。筛选出的在喉癌及癌旁正常粘膜组织中明显差异表达的10个蛋白质点,并成功鉴定。其中在喉癌组织中高表达的7个,低表达的3个。结论喉癌组织与癌旁正常粘膜组织蛋白存在明显的差异,筛选并鉴定出的这些蛋白质可能成为喉癌早期临床诊断、治疗的标志物和靶标。     

Mass spectrometric identification and microcharacterization of proteins from electrophoretic gels: Strategies and applications

The entire genomic DNA sequences of a number of prokaryotic and eukaryotic species are now available and many more, including the human genome, will be completed in the near future. The state-of-life of a cell at any given time, however, is defined by its protein composition, i.e., its proteome. Gel electrophoresis, mass spectrometry, and bioinformatics will be important tools for protein and proteome analysis in the post-genome era. Protein identification from electrophoretic gels by mass spectrometric peptide mapping or peptide sequencing combined with sequence database searching is established and has been applied to numerous biological systems. We describe current strategies and selected applications in molecular and cell biology. The next challenges are detailed structure/function analyses, which include studying the molecular composition of multiprotein complexes and characterization of secondary modifications of proteins. The advantages and limitations of a number of mass spectrometry-based strategies designed for microcharacterization of low amounts of protein from electrophoretic gels are discussed and illustrated by examples. Proteins Suppl. 2:74–89, 1998. © 1998 Wiley-Liss, Inc.     

基体辅助激光解吸电离质谱法及其应用

基体辅助激光解吸电离质谱是近几年才发展起来的一种新技术,它在生命科学研究中具有广阔的应用前景．对基体辅助激光解吸电离质谱技术的基本原理,运用基体辅助激光解吸电离质谱法研究蛋白质分子量的测定,蛋白质混合物的分离鉴定以及用基体辅助激光解吸电离质谱技术进行超快速的蛋白质序列分析和DNA序列分析的可行性和存在的问题作了介绍和讨论．     

同时放化疗敏感性不同宫颈癌组织的二维电泳图谱建立及质谱分析

目的:分析同时放化疗后高敏感和低敏感中晚期宫颈癌组织之间蛋白质组的差异,为确定宫颈癌同时放化疗敏感性相关蛋白提供依据。方法:收集治疗前的中晚期宫颈癌活检组织标本,均为中分化鳞癌,置于—80℃超低温冰箱保存。同时放化疗后,根据WHO实体瘤疗效判断标准,将收集的10例宫颈癌组织标本分为高敏感组(5例)和低敏感组(5例);提取组织总蛋白,进行双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)得到凝胶图谱,采用PD-quest 7.0软件进行匹配和差异分析,识别两组之间表达差异蛋白点。将部分差异蛋白点进行胶内原位酶解后进行MALDI-TOF-MS分析,获取肽质量指纹图,数据库搜索鉴定蛋白质。结果:建立了分辨率高,重复性好的同时放化疗后宫颈癌组织高敏感组和低敏感组的双向凝胶电泳图谱。高敏感组蛋白点数为781±74个,低敏感组蛋白点数为766±52个,组间平均匹配率为87.6%。质谱分析成功鉴定15个差异表达蛋白,其中7个蛋白质在高敏感组高表达,8个蛋白质在高敏感组低表达。结论:蛋白质2-DE图谱和质谱鉴定结果说明同时放化疗后高敏感组和低敏感组宫颈癌组织间存在蛋白质表达的差异,这些蛋白质可能与同时放化疗敏感性有关。     

一种SDS-PAGE与MALDI-TOF质谱联用的方法

以尿激酶的为材料,探索一种从ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上回收蛋白 做ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ质谱的方法,所用的回收方法包括电洗脱、脱盐、除ＳＤＳ等过程,电洗脱用的是高盐阻断法,脱盐用的超滤技术,去除ＳＤＳ用的是冷丙沉淀法,结果证明,此方法至少对一些蛋白质是可行的。