用重叠PCR合成植物甜蛋白brazzein基因

目的:为在泡盛曲霉(Aspergillus awamori)中进行表达,采用重叠PCR合成了植物甜蛋白brazzein基因。方法:根据非洲热带植物Pentadiplandra brazzeana产生的天然甜蛋白brazzein的氨基酸序列及泡盛曲霉糖化酶基因glaA的密码子偏爱性,设计并化学合成了2对3’-端互补的寡聚核苷酸,通过PCR延伸获得2条末端有部分重叠的双链核苷酸片段,再通过重叠PCR扩增,合成了用于泡盛曲霉表达的植物甜蛋白brazzein基因。结果:将brazzein基因克隆到pMD18-T载体,随机挑取6个重组质粒测序,结果1个重组质粒有连续4个碱基缺失,3个重组质粒各有1个碱基缺失,2个重组质粒携带的brazzein基因核苷酸序列完全正确。结论:合成的brazzein基因大小162 bp,编码54个氨基酸,推断的氨基酸序列与Pentadiplandra brazzeana产生的天然brazzein完全一致,表明植物甜蛋白brazzein基因成功合成。     

耐热甜味蛋白brazzein的溶液NMR结构研究——二级结构和分子骨架

brazzein是从非洲西部野生植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果实中提取的一种甜味蛋白 .在所有已知的甜味蛋白质中 ,brazzein的分子量最小 ,水溶性最好 ,并且具有很好的热稳定性 .利用二维核磁共振 ( 2DNMR)技术研究brazzein的溶液三维结构 ,完成了包括主链和侧链在内的所有质子共振峰的序列归属 .brazzein的二级结构包含一段α螺旋 ( 2 1～ 2 9) ,一段较短的 310 螺旋 ( 1 4～ 1 7)和两股反平行 β折叠 ( 34～ 39,44～ 5 0 ) ,分子N端可能形成了第 3股 β链 ( 5～ 7) .比较研究发现 ,该甜味分子骨架CSαβ与蝎毒、昆虫防卫素和植物抗菌蛋白γ 硫素的分子支架基本相同 .以此为基础 ,讨论了这种多功能分子支架的意义 ,可能的甜味活性中心及其热稳定性的结构基础 .     

类甜蛋白的结构特征以及功能研究进展

类甜蛋白是一种具有多种生物学活性及重要功能的植物防御蛋白,属于病程相关蛋白。近年来关于类甜蛋白具有抗真菌活性的研究较多。类甜蛋白具有葡聚糖酶活性,能结合并降解真菌细胞壁的组成成分—β-1,3葡聚糖酶。在三维晶体结构中类甜蛋白表面的一个酸性“V”字形裂缝对其抗真菌活性起着至关重要的作用。对类甜蛋白结构与功能的关系,不同植物中类甜蛋白的生物学特性,以及国内外基因工程中类甜蛋白基因的应用研究进展进行了综述。     

奇甜蛋白基因在园艺作物中的表达

奇甜蛋白（thaumatin）是从非洲西部植物katemfe（Thaumatococcus daniellii Benth）中提取得到的几种关系相近的甜味蛋白的统称,其中最主要的为奇甜蛋白Ⅰ和奇甜蛋白Ⅱ。奇甜蛋白不仅甜度高,而且具有低热量、安全无毒以及不易诱发糖尿病等优点。因此,将奇甜蛋白基因转入园艺作物中并使之表达,用以提高可食部分的甜味,有其特别的研究意义。奇甜蛋白基因已先后在马铃薯、梨树、黄瓜、番茄等园艺作物得到表达,但仍有一些问题需要解决。现从奇甜蛋白基因的克隆、测序与表达,转基因果实的安全性检测,甜度的感官评价,甜味遗传特点以及奇甜蛋白抗真菌病害检验等几个方面综述了国内外研究进展,并对今后的研究提出了建议。     

植物甜蛋白brazzein基因的克隆与表达

根据大肠杆菌偏爱的密码子,利用PCR技术体外人工合成brazzein cDNA序列,并将其克隆至原核高效表达载体pET30a( )中。重组载体pET30a( )-brazzein转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果证明pET30a( )-brazzein在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白25％左右。     

应乐果甜蛋白及其基因工程

应乐果甜蛋白（monellin)是一种分子量为10.7kD的超甜蛋白。由A,B两条链组成,其中A链44个氨基酸,B链50个氨基酸。分子内有5个反向平行的β折叠链和一个α螺旋。实验表明,Asp^B7可能是应乐果甜蛋白的甜味活性中心。此外,Cys^41,Ca^2 等对应乐果甜蛋白的甜味也会产生影响。研究人员把应乐果甜蛋白的单链类似物相断转入大肠杆菌,土豆,莴苣和酵母中,得到了具甜味,稳定性和耐受力强的表达产物。     

单链莫内甜蛋白基因的合成及其植物表达载体的构建

目的:合成单链莫内甜蛋白基因,构建其植物表达载体。方法与结果:根据已报道的单链莫内甜蛋白的氨基酸序列及甜味机理,重新设计合成了全长294bp的莫内甜蛋白基因,其中单链莫内甜蛋白氨基酸序列中的Asp69(原AspA16)突变为Asn。利用DNA重组技术,将莫内甜蛋白基因克隆到植物表达载体pBl221中,构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体pBI221-monellin。结论:构建了莫内甜蛋白基因的植物表达载体,为转化园艺植物以改善其口感奠定了基础。     

马槟榔甜味蛋白的研究—Ⅲ.在种子中储存的位点和状态

甜蛋白mabinlin是马槟榔(Capparis masaikai Levl.)种子的主要储存蛋白。它位于胚轴细胞的蛋白体中,其含量为蛋白体总蛋白的90％。圆形蛋白体直径约2—10μm,内含许多球粒体(globoid),但无类晶体(crystalloid)。作为一种强碱性清蛋白,甜蛋白与一种强酸性化合物2-羟乙基葡硫甙磺酸(2-hydroxy-ethyl-glucosinolate)结合为可溶性盐,组成蛋白体的衬质(matrix)。衬质中还有酸性磷酸酯酶。球粒体无一定大小,主要含植酸钾盐。当种子或种子脱脂干粉在水中匀浆时,大部分甜蛋白与植酸结合为沉淀而不能被提取。但甜蛋白-植酸复合物溶于大于0.5N的氯化钠溶液。这容易引起以为种子主要储存蛋白是球蛋白的假象。在水浸泡的完整种子中,部分甜蛋白从蛋白体中渗出,部分与植酸结合而后逐步释放,受到进一步降解。     

马槟榔甜味蛋白的研究——Ⅰ.提取、纯化和某些特性

从中药马槟榔(Capparis masaikai Levl.)成熟种子中分离了一种能引起持久甜味的蛋白质,取名为马槟榔甜蛋白(Mabinlin),分子量11,700,等电点pH11.8,在280nm波长有最大吸收峰,其引起甜味感觉的最低浓度为0.1％,种仁含甜蛋白量约4％。     

设计更甜的番茄

发达国家的目标是产生含糖量不高但更甜的果实和蔬菜。California 大学Berkely 分校的研究人员用遗传工程法把一种天然甜味剂的合成文本导入了莴苣和番茄。monellin 是一种从非洲植物serendipity(Dioscorephyllum cumminsii)中提取到的甜味剂,其分子甜度比蔗糖约甜10万倍。尚未广泛以monellin 作甜味剂使用的原因是,这种由两条肽链组成的蛋白,在受热或处于酸性条件下时,迅速失去其形状和风味。而且经遗传操作获取两种肽也是一件难事。     

植物甜蛋白Thaumatin研究进展

甜蛋白自 2 0世纪 70年代发现以来 ,一直倍受人们关注 ,而源于自然的Thaumatin是植物甜蛋白中的一种 ,它具有低热量、高甜度、安全无毒 ,并可降解为人体所需的氨基酸等多种优点 ,是一种新型甜味剂。在物质文化生活日益丰富的今天 ,人们越来越重视饮食的科学性 ,吃饱的同时更加关注所摄入食品的品质 ,无疑具多功能的非糖类物质 Thaumatin就是人们所需求的理想食品。因此 ,Thaumatin成为热门研究领域之一也就不足为怪了。1 　植物甜蛋白研究概况迄今为止 ,人们从多种植物中发现并分离出 7种甜味蛋白 [1 ]。更确切地说 ,其中 5种( Thaumatin,…     

甜蛋白与抗虫蛋白

在植物中发现有极甜的蛋白质。植物中也有抗虫的蛋白质,其中一类抗虫蛋白与甜蛋白在结构上极为相似。介绍了它们的研究现状和广泛的应用前景。     

超甜蛋白的基因工程及开发研究进展

甜蛋白是一类高甜度、低热量、多功能的新型超级甜味剂,应用前景广阔。由于它们存在于几种稀有的植物中,产地偏僻,产量低,提取困难,因而不能发挥它们的使用价值。运用基因工程等高新生物技术,将甜蛋白基因克到微生物细胞中,构建产生甜蛋白基因工程菌株,将为工厂化发酵生产甜蛋白开辟一条快速有效的新途径。     

甜蛋与抗虫蛋白

在植物中发现有极甜的蛋白质。植物中也有抗虫的蛋白质。其中一类抗虫蛋白与甜蛋白在结构上极为相似。介绍了它们的研究现状和广泛的应用前景。     

不同石榴品种对井上蛀果斑螟生长发育和繁殖的影响

井上蛀果斑螟是云南石榴上的一种主要蛀果害虫.为明确石榴不同品种对该虫生长发育和繁殖的影响,在温度(25±1) ℃、光周期15 L∶9 D、相对湿度(70±10)%条件下,系统观察了井上蛀果斑螟在甜绿籽、厚皮甜沙籽、甜光颜、酸绿籽和酸沙籽5个品种上的发育历期、存活率和产卵量等生物学特性,并组建了其实验种群生命表.结果表明: 井上蛀果斑螟在5个石榴品种上的卵期、幼虫期、蛹期、雄成虫寿命、全世代历期及卵孵化率均无显著差异;预蛹期、雌成虫寿命、幼虫存活率、化蛹率、羽化率、总成活率、单雌产卵量及雌雄蛹质量存在显著差异,除幼虫存活率外,均以酸绿籽种群较高,厚皮甜沙籽种群次之,二者间差异不显著.生命表参数表明,净增殖率、内禀增长率和周限增长率均为酸绿籽种群显著高于甜绿籽、甜光颜和酸沙籽种群,但与厚皮甜沙籽种群差异不显著;平均世代周期各品种间无显著差异;种群加倍时间为酸绿籽种群显著小于其余4个品种.5个石榴品种中,酸绿籽和厚皮甜沙籽较适宜井上蛀果斑螟的生长发育和繁殖.     

马槟榔甜味蛋白的研究Ⅱ.甜蛋白Ⅱ和甜蛋白Ⅰ的比较

从马槟榔(Capparis masaikai Levl.)种子分离鉴定了二种甜蛋白:甜蛋白Ⅰ(mabinlinⅠ或MaⅠ)分子量MW11600,等电点pI 11.8;甜蛋白Ⅱ(mabinlinⅡ或MaⅡ)MW10400,pI 11.3。另一组分mabinlinⅢ MW10200,pI 11.8,可能是提取过程产物。MaⅡ有84个氨基酸残基,比MaⅠ少15个。它们有80个氨基酸残基是共同的,都是缺丝氨酸和蛋氨酸的单一多肽链。MaⅠ还缺赖氨酸和酪氨酸。测不出有自由SH基。在8M尿素中用巯基乙醇还原处理,两种甜蛋白分子都可转变为二聚体而失去甜味。 自去壳脱脂的种子干粉中提取MaⅠ和MaⅡ的得率依所用溶剂和提取条件而异。用50％丙酮水溶液提取,继用CM-纤维素分离,甜蛋白的得率达13％。用水或0.1N pH6.2磷酸缓冲液提取,得率低于1％。     

马槟榔甜味蛋白的研究Ⅱ．甜蛋白Ⅱ和甜蛋白Ⅰ的比较

从马槟榔（Capparis masaikai Levl．）种子分离鉴定了二种甜蛋白：甜蛋白I（mabinlinⅠ或MaⅠ）分子量MWll600,等电点PⅠll.8;甜蛋白Ⅱ（mabinlinⅡ或MaⅡ）MW 10400,PⅠll.3。另一组分mabinlinⅡ MW10200,pl 11.8,可能是提取过程产物。MaⅡ有84个氨基酸残基,比MaⅠ少15个。它们有80个氨基酸残基是共同的,都是缺丝氨酸和蛋氨酸的单一多肽链。MaⅠ还缺赖氨酸和酪氨酸。测不出有自由SH基。在8 M尿素中用巯基乙醇还原处理,两种甜蛋白分子都可转变为二聚体而失去甜味。     

利用基因工程技术高效表达高甜度蛋白

甜蛋白来源于西非热带植物的果实,正常结实所需生态环境非常苛刻,很难在其他地区引种成功,从天然植物来源中提取甜蛋白难以形成规模.     

黄麻两个栽培种及其野生类型与三个近缘种的核型分析

本研究选取黄麻属（Corchorus）2个栽培品种及其4个野生类型和3个野生近缘种为材料,采用常规根尖压片法对黄麻属供试材料的染色体数目和核型进行研究。结果表明：染色体数目均为2n=14。核型公式分别为：宽叶长果（长果黄麻栽培种）2n=2x=14=14m(4SAT);南阳野生长果（长果黄麻野生类型）2n=2x=14=14m(2SAT);坦桑尼亚野生长果（长果黄麻野生类型）2n=2x=14=2M+12m;闽麻5号（圆果黄麻栽培种）2n=2x=14=12m+2sm;爱店野生圆果（圆果黄麻野生类型）2n=2x=14=14m ;廉江野生圆果（圆果黄麻野生类型） 2n=2x=14=4M+10m;假黄麻（黄麻属野生近缘种）2n=2x=14=2M+12m;假长果（黄麻属野生近缘种）2n=2x=14=2M+12m;甜麻（黄麻属野生近缘种）2n=2x=14=14m。其中除了宽叶长果核型分类为1B外,其他的都为1A型。本文还讨论了黄麻野生近缘种甜麻的分类学地位。     

甜蛋白Monellin基因在大肠杆菌中的高效表达

据已报道的单链monellin甜蛋白的氨基酸序列,采用细菌偏爱密码子,人工合成了全长 294bp的 monellin基因。插入到大肠杆菌表达载体Pet_22b中,构建重组分泌型表达载体Petmo。经IPTG诱导Petmo所含有的甜蛋白基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达,表达量占菌体可溶性蛋白的44.8％。且经纯化后测定其甜度是蔗糖的3000倍。得到的甜蛋白热稳性及耐酸性均比天然产物有所提高。