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相似文献
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1.
水稻巯基蛋白酶抑制剂的纯化及其性质研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
水稻的糠皮和胚经生理盐水浸取、离心后的上清液加热至80℃处理10min,离心获得的上清液调pH至8.0,得到沉淀。沉淀溶解于0.01mol/LHCl,经透析冷冻干燥得水稻巯基蛋白酶抑制剂(CPI)粗品;粗品再经DEAE-Sepharose柱线性离子梯度洗脱和SephadexG-100柱分子筛层析,即可获得在PAGE、SDS-PAGE和HPLC上均为单一蛋白带的CPI样品。经上述步骤,CPI可被纯化58倍。经SephadexG-100和SDS-PAGE测定其分子量均为12000,N末端氨基酸为Pro,等电点5.6.水稻CPI经100℃处理10min后,其抑制活性无任何变化,在pH2.0~9.0之间,活性也不发生改变,但pH在9.0以上,其活性逐渐下降,水稻CPI对木瓜蛋白酶是一种高亲和性的抑制剂,它对木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶有强抑制作用,对菠萝蛋白酶仅有弱抑制作用,但对胰蛋白酶则全无抑制作用;其抑制类型属竞争性抑制剂类型,K_i值约3.5×10 ̄(-8)mol/L对木瓜蛋白酶的抑制摩尔比约为1:1。  相似文献   

2.
与光系统Ⅱ颗粒结合的对DTT敏感的蛋白酶的纯化和性质   总被引:1,自引:0,他引:1  
菠菜光系统Ⅱ颗粒的1mol/LNaCl抽提液经butyl-Toyopearl650M疏水层析和DEAE-SephadexA-50柱层析分离得一种对DTT敏感的蛋白酶。用SDS-PAGE和Superose12凝胶过滤测得该酶的分子量为37kD,其为单体酶。该酶可降解18kD和24kD水溶性蛋白质,分别产生13.2kD、12kD、10.5kD和23kD、22kD、20kD片段,最适pH为8.0,对NaCl不敏感,对DTT和β-Me敏感。抑制实验表明该酶不属丝氨酸类蛋白酶。  相似文献   

3.
百合的鳞茎中含有一种对木瓜蛋白酶有强抑制作用的巯基蛋白酶抑制剂.百合的鳞茎经浸取加热处理,木瓜蛋白酶偶联的Sepharose4B柱亲和层析和SephadexG-100分子筛层析,可获得在PAGE和SDS-PAGE均为单一蛋白带的百合巯基蛋白酶抑制剂(CPI).此CPI为单链蛋白,含有0.307%的中性糖;N端氨基酸为Ile;SDS-PAGE测得亚基分子量为12000;SephadexG-100测得分子量为12500.百合CPI在100℃内和pH2~12范围内非常稳定;对木瓜蛋白酶的抑制属竞争性抑制类型,其Ki值为1.15×10~(-9)mol/L,对木瓜蛋白酶的抑制摩尔比为8.5:1.  相似文献   

4.
柑叶片蔗糖酶的分离纯化及其部分性质的研究   总被引:8,自引:0,他引:8  
柑(Citrusreticulata Blanco)幼叶中存在高活性的酸性蔗糖酶。经硫酸铵盐析、DEAE-琼脂糖离子交换层析、SephacrylS-200 凝胶层析纯化,活性回收率6.4% ,纯化倍数179.2 倍。纯化的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,SDS-PAGE显示1 条蛋白带,其亚基分子量40 kD。用SephacrylS-200 凝胶层析法测得分子量为80 kD。推测该酶由两个相同亚基构成。以蔗糖为底物测定该酶的表观Km 为1.6×10- 2 m ol·L- 1,Vm ax为100 m g 还原糖·m g- 1蛋白质·h- 1。最适pH 5.0,酸碱稳定区在pH 4.5—5.5 之间。最适温度55℃  相似文献   

5.
麻蝇幼虫肠液经硫铵沉淀, DEAE-Sephadex A-25离子交换层析, SBBI-Sepharose 4B亲和层析,分离纯化出一种分子量为 16kD的蛋白酶。底物及抑制剂的特异性表明,该酶为类胰蛋白酶。其能够强烈地降解蛋白酶非专一底物酪蛋白和 Hide powder azure,以及类胰蛋白酶专一底物 Bz-Phe-Val-Arg NA, Bz-Pro-Phe-Arg NA和Bz-Val-Gly-Arg NA.该酶又能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF,类胰蛋白酶抑制剂 SB-BI和Leupeptin强烈地抑制。蛋白酶在酸性环境下极不稳定,在弱碱环境(pH8.5-9.5)中活性最高。  相似文献   

6.
本文以GST-UVS.2抗体和卵黄膜为检测手段,采用凝胶过滤和离子交换等方法将非洲爪蟾(Xenopuslaevis)孵化酶纯化了90倍以上,并研究了其酶活性和生化特性。实验发现,孵化酶分子量为60kD,有很强的蛋白酶活性和卵黄膜溶解活性;它很不稳定,在纯化时极易降解为40kD分子,40kD分子没有卵黄膜溶解活性,但仍有很强的蛋白酶活性。40kD分子很可能只代表60kD分子中的蛋白酶功能区,而丢失了两个CUB重复区。孵化酶对EDTA和金属离子非常敏感、又为p-APMSF等胰蛋白酶抑制剂所强烈抑制,表明它是属于胰蛋白酶类型的一种金属蛋白酶。其特异性MCA-底物为Boc-Leu-Gly-Arg-MCA。  相似文献   

7.
麻蝇幼虫肠道蛋白酶BGP的分离纯化及性质   总被引:1,自引:0,他引:1  
棕尾别麻蝇幼虫肠液经SDS-PAGE后,X光片显影,呈现两条蛋白酶活性带.IEF后,两条蛋白酶活性带的等电点分别为pH7.7和6.8.麻蝇幼虫肠液经55%~75%硫酸铵沉淀,以及连续两次制备等电聚焦,分离纯化出等电点约为pH7.7,分子量约为35kD的蛋白酶BGP.该酶能分解酪蛋白和类胰蛋白酶专一底物Bz-Phe-Val-ArgNA,不能分解弹性蛋白酶专一底物elastin-CongoRed和类胰凝乳蛋白酶专一底物Suc(Ala)2Pro-PheNA.SBBI,Leupeptin和PMSF能强烈抑制其活性.专一底物和抑制剂的结果表明,BGP是一种类胰蛋白酶.其最适反应温度为50℃,最适作用pH为8.5.不耐高温,50℃保温30min活性急剧下降.Hg2+,Zn2+和Cu2+能抑制酶活性.Ca2+,Mg2+对酶无激活作用,EDTA无抑制作用.  相似文献   

8.
通过硫酸铵分级沉淀、CM-52阳离子交换层析、HRLC分子排阻层析及FPLCMonoS离子交换层析等步骤,从丝瓜籽中分离到一组分子量为8kD左右的小分子核糖体失活蛋白——LufinS1、LufinS2、LufinS3。末端分析结果表明,它们的N端氨基酸分别为Ala、Pro和Thr。氨基酸序列分析确定了LufinS2的N端9个氨基酸的序列是Pro-Arg-Arg-Gly-Gln-Glu-Ala-Phe-Asp。LufinSs对核糖体的失活机制与天花粉蛋白(TCS)一致,是RNAN-糖苷酶催化型的。它们对无细胞蛋白质生物合成的抑制活性较TCS略强,IC50分别为1.3×10-11、1.0×10-10和6.3×10-11mol/L左右。因此LufinSs有可能开发成免疫毒素的高效“弹头”。  相似文献   

9.
由凝胶电泳酶谱检测到黑曲霉149发酵液中存在两型木聚糖酶,依次为X-Ⅰ和X-Ⅱ.通过硫酸铵分级沉淀及DEAE-SephadexA50柱层析分别将X-Ⅰ、X-Ⅱ纯化到凝胶电泳均一。由SDS一凝胶电泳和浓度梯度凝胶电泳测得X-Ⅰ和X-Ⅱ的分子量分别为37kDa,76kDa,24kDa和23kDa,X-Ⅰ具有亚基。二者的含糖量分别为276%和7.3%。X-Ⅰ和X-Ⅱ最适反应温度分别为50℃和55℃,pH为46和5.2。在pH4.6~9.2和pH4.0~10.0之间X-Ⅰ、X-Ⅱ活力稳定。50℃保温24h,X-Ⅰ活力仍为100%,而X-Ⅱ的活力已降为2.8%。HgCl2和AgNO3显著抑制X-Ⅰ、X-Ⅱ的活力。X-Ⅰ与X-Ⅱ水解不同来源的木聚糖,其产物有所不同。  相似文献   

10.
以对硝基苯糖苷基为底物,测定了慈菇的12种糖苷酶,其中α-甘露糖苷酶、α-和β-半乳糖苷酶活力较高;经硫酸铵分级沉淀,SephadexG-150分子筛层析,ConASepharose4B亲和层析,DEAE-SepharoseCL-6B离子交换层析,从慈菇抽提液纯化了α-半乳糖苷酶。纯化酶的比活提高1072倍,活力回收15.6%,在圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-PAGE上均显示1条蛋白质带,在α-半乳糖苷酶浓度为150mU/ml的溶液中测不到其他糖苷酶的活力。慈菇α-半乳糖苷酶的分子量用SephadexG-100凝胶过滤柱测定或在SDS-PAGE上测定均为60kD,酶反应的最适pH在5.8附近,最适温度为60℃。该酶分解对硝基苯基-α-半乳糖苷的K_m值为3.7×10 ̄(-4)mol/L,V_m值为2.1×10 ̄(-4)mol/L。银离子、汞离子显著抑制酶活力,D-半乳糖和密二糖均竞争性地抑制该酶水解对硝基苯基α-D-半乳糖苷的活力,根据Dixon作图求得其K_i值分别为0.92×10 ̄(-3)mol/L和1.98×10 ̄(-3)mol/L。2-脱氧-D-半乳糖和L-岩藻糖为酶活力的非竞争性抑制剂。化学修饰  相似文献   

11.
一种苦荞麦种子蛋白酶抑制剂的纯化、特性及其抗虫活性   总被引:1,自引:0,他引:1  
蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内, 是自然界含量最为丰富且具有一定防御作用的蛋白种类之一. 本文采用离子交换层析和凝胶层析等方法,从苦荞麦种子中分离出一种胰蛋白酶抑制剂(TBTI-Ⅱ). SDS-PAGE分析表明,TBTI Ⅱ的分子量约9.0 kD,由80个氨基酸残基组成,分子中含有较多的 Glu, Asp 和Arg. TBTI-Ⅱ具有较高热稳定性.当在100℃加热处理10 min后,仍保留有67.6%的抑制剂活性. 动力学测定显示,来自苦荞麦中的TBTI-Ⅱ对胰蛋白酶的抑制作用常数(Ki)为1.01×10-4 mol/L. 另外,将含有不同活力单位的苦荞麦蛋白酶抑制剂掺入到棉铃虫的饲料中进行饲养试验显示,TBTI-Ⅱ具有明显的抑制棉铃虫生长的作用. 这些结果表明,来自苦荞麦种子中的小分子蛋白酶抑制剂可能是一种潜在的抗虫因子.  相似文献   

12.
利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10~(-8),4.78×10~(-9),1.22×10~(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。  相似文献   

13.
豆薯(Pachyrrhizuserosus)种子经磷酸盐缓冲液抽提,S-SepharoseFastFlow柱,DE-52纤维素柱和SephadexG-75柱层析,提取出两种高纯度的蛋白成分,命名为PachyrinⅠ和Ⅱ.SDS-PAGE测得其分子量分别为33kD和14.5kD,但HPLC分子筛的结果显示PachyrinⅡ的分子量为28kD,无论在还原条件下,还是在非还原条件下,PachyrinⅡ电泳的结果都完全相同,表明该蛋白的亚基不是以二硫键相连。两种蛋白的等电点分别为4.5和6.5.用酸解法测定了它们的氨基酸组成。在无细胞体系中,它们对蛋白合成有较弱的抑制活性,显示它们可能是核糖体失活蛋白(RIPs)家族中的新成员。  相似文献   

14.
经硫酸铵分级、CM-纤维素柱层析和Sephadex G-75柱层析,从野生型秘鲁蕃茄未成熟果实的匀浆液中分离纯化了蛋白酶抑制剂Ⅱa、Ⅱb。纯化的蛋白酶抑制剂经SDS-PAGE鉴定呈单一带,分子量均为17kD。Western blotting结果表明蛋白酶抑制剂Ⅱa、Ⅱb均与马铃薯蛋白酶抑制剂Ⅱ有血清学上的交叉反应。抑制蛋白酶活性测定显示两种蛋白酶抑制剂都表现強的抑制胰凝乳蛋白酶的活性,但对胰蛋白酶的抑制活性蛋白酶抑制剂Ⅱb強于蛋白酶抑制剂Ⅱa。  相似文献   

15.
菜心和水稻绿叶中不同等电点的乙醇酸氧化酶   总被引:3,自引:0,他引:3  
The proteins with glycolate oxidase activity from B.parachinensis Bailey and rice( Oryza sativa )green leaves were prepared respectively.From the second protein peak on DEAE\|Cellulose column,two glycolate oxidases,expressed as B.parachinensis Bailey GO Ⅲ(specific activity natove 13 2 U·mg -1 ·min -1 )and rice GOⅢ(specific activity 8 8 U·mg -1 ·min -1 ),could not migrate anywhere in 4%~20% native\|PAGE under a pH8.3 buffer system.GOⅢ's p I was about pH8.3. The protein containing B.parachinensis Bailey GOⅢ showed 67±2,43±2,and 38±2 kD in SDS PAGE,band 43±2 kD was the subunit of B.parachinensis Bailey GOⅢ.From the two proteins above,another group of glycolate oxidases,expressed as B.parachinensis Beiley GOⅠ(specific activity 5 U·mg -1 ·min -1 )and rice GOⅠ(specific activity 1 2 U·mg -1 ·min -1 ),showed only one 43±2 kD band in SDS\|PAGE,and was purified on the Sepharose\|6B column which migrated towards anode in the same native\|PAGE showing the M r about 420 kD,or 460 kD and 260 kD respectively.GOⅠ's p I was smaller than pH8.3.Antibody against B.parachinensis Bailey GOⅠ was prepared and its efficacy was about 1/1600 in ELISA.By native\|PAGE,Western blot and rocket immunoelectrophoresis,the third group of glycolate oxidases,expressed as B.parachinensis Bailey GOⅡ and rice G0Ⅱ,were confirmed in crude protein of green leaves and migrated towards cathode under the same native\|PAGE,so GOⅡ's p I was higher than pH8.3.The M r of B.parachinensis Bailey GOⅡ was about 669 kD determined by native\|PAGE Western blot.Rice GOⅠ,rice GOⅢ and rice GOⅡ showed different quantitation under different physiological conditions.Rice GOⅡ could be induced by glycolate.  相似文献   

16.
根据文献报道的荞麦胰蛋白酶抑制剂的氨基酸序列及本研究室先前已获得的部分基因序列设计引物,经过RT-PCR扩增,获得荞麦胰蛋白酶抑制剂编码区基因全序列.将该基因克隆到原核表达载体pQE-31中,并转化至大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达获得可溶性目的蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的25%.该目的蛋白经Ni2 -NTA柱亲和纯化,SDS-PAGE分析显示,在大约9kD处出现明显的目的条带,与预计蛋白分子量大小一致.Western blot鉴定证实,目的蛋白N端带有6个组氨酸标签.活性测定表明,目的蛋白具有专一性的胰蛋白酶抑制剂活性,抑制活性约为77U/mg纯化蛋白.本实验为进一步研究荞麦胰蛋白酶抑制剂结构与功能的关系奠定了基础.  相似文献   

17.
由健康小鼠通过皮下注射一定量的氯化镉,取肝脏匀浆,离心,经SephadexG-50和DEAE-Sephadex A-50柱层析分离,即可获得MT-Ⅰ和MT-Ⅱ两种金属硫蛋白。经鉴定:两个分子各含18个巯基,结合4个Cd原子和3个Zn原子,无金属蛋白质Thionein的分子量约为6kD,半胱氨酸含量约占氨基酸总量的28%,所提取到的MT-Ⅰ和MT-Ⅱ经氨基酸组成,HPLC和PAGE分析皆证明为高度均一的,且与有关文献报道基本相符。其中MT-Ⅱ已获得晶体。  相似文献   

18.
Plants synthesize a variety of molecules, including proteinaceous proteinase inhibitors, to defend themselves of being attacked by insects. In this work, a novel trypsin inhibitor (PPTI) was purified from the seeds of the native Brazilian tree Poecilanthe parviflora (Benth) (Papilioinodeae, Leguminosae) by gel filtration chromatography on a Sephadex G-100 followed by Superdex G75 chromatography (FPLC), Sepharose 4B-Trypsin column, and fractionated by reversed-phase HPLC on a C-18 column. SDS-PAGE showed that PPTI consisted of a single polypeptide chain with molecular mass of about 16 kDa. The dissociation constant of 1.0 x 10(-7) M was obtained with bovine trypsin. PPTI was stable over a wide range of temperature and pH and in the presence of DTT. The N-terminal sequence of the PPTI showed a high degree of homology with other Kunitz-type inhibitors. Trypsin-like activity in midguts of larval Diatraea saccharalis, Anagasta kuehniella, Spodoptera frugiperda, and Corcyra cephalonica were substantially inhibited by PPTI.  相似文献   

19.
甘薯和花生胰蛋白酶抑制剂的初步研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
许多植物蛋白制成品均含有抑制动物消化的蛋白酶抑制剂。目前已从某些豆类及蔬菜种子中分离出多种对胰蛋白酶具有抑制作用的活性物质。该实验以花生、甘薯等为原料,通过DEAE-Sepharose4BFF阴离子交换柱层析分离胰蛋白酶抑制剂,以N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物测定其对胰蛋白酶的抑制活性;将具有抑制活性的组分通过SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量(Mr);以聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质等电点(pI)。结果显示,甘薯中至少有4种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为20~25kD、等电点在pH5.0~6.6之间;花生中至少有三种胰蛋白酶抑制剂组分,相对分子质量为30~70kD、等电点在pH5.0~5.8之间。  相似文献   

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