纤黏连蛋白重组多肽CH50抑制黑色素瘤MMP-2和MMP-9表达、激活的研究

目的 研究纤黏连蛋白重组多肽CH50对黑色素瘤B16细胞侵袭能力的影响,探讨CH50多肽抑制肿瘤生长、侵袭的机制。方法 体外培养小鼠黑色素瘤B16细胞、小鼠腿部皮下注射B16细胞建立肿瘤动物模型。采用明胶电泳法检测B16细胞和黑色素瘤组织中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和激活;以CH50多肽体外处理B16细胞或体内表达CH50,观察CH50下调MMPs表达以及对肿瘤细胞侵袭能力的抑制作用。结果 B16细胞在体外培养条件下主要表达MMP-2,而在肿瘤微环境中则同时表达MMP-2和MMP-9。肿瘤组织中MMPs的表达明显高于体外培养B16细胞。CH50多肽对体外培养B16细胞的MMPs表达和激活无明显抑制作用,但处理后的B16细胞进入体内后表达MMPs的能力受到明显抑制。体内转染表达的CHSO多肽亦可明显抑制肿瘤表达MMPs、并抑制肿瘤侵袭能力。结论 纤黏连蛋白重组多肽CHSO可以抑制肿瘤微环境中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达和激活,从而抑制黑色素瘤生长及侵袭能力。     

三结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物性质的初步鉴定

为探讨三结构域重组迁连蛋白（ＦＮ）在肿瘤治疗中的作用,构建了两个三结构域重组ＦＮ表达质粒ｐＦ９４－６２和ｐＦ９４－８２,它们分别编码两个重组多肽：ＣＨ６２（ＦＮＰｒｏ１２３９－Ｓｅｒ１５１５经Ｍｅｔ、Ａｌａ １６９０－Ｖａｌ２０４９相连）和ＣＨ８２（从ＣＨ６２中删除了ＨｅｒｐⅡＣ端和ＣｅｌｌⅡ结构域Ｎ端的Ｐｒｏ１９５３－Ｇｌｕ１９７８）。含表达质粒ｐＦ９４－８２的工程菌经３７℃培养,ＣＨ８２得到表     

Onconase对B16黑色素瘤细胞的体内外生长抑制作用

Onconase(Onc)是一种从林蛙(Rana pipiens)卵细胞内提取的核酸酶,实验证实其在体外和体内对多种肿瘤细胞都具有显著的杀伤效果。在大肠杆菌中表达纯化的重组Onc和天然提取蛋白质具有相似的活性,通过测定该蛋白质对黑色素瘤B16细胞的IC50和建立荷瘤小鼠模型探讨了Onc体内外的抗肿瘤效果。实验结果表明:B16细胞在体外对Onc敏感性较K562细胞低,其IC50为6.37μmol/L;但体内每次每只小鼠给予5mg/kg Onc也可显著地抑制B16细胞的生长,延长小鼠的生存时间。实验提供了一种简化高效获得具有天然活性Onc的方法,同时通过Onc对低敏感性肿瘤黑色素瘤细胞的杀伤研究,丰富了对Onc抗肿瘤作用的认识,为治疗黑色素瘤提供了线索。     

重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤B16细胞增殖效应的研究北大核心CSCD

旨在探讨重组骆驼蓬脂转移蛋白(Recombinant Peganum harmala lipid transfer protein,r Ph LTP)与顺铂(DDP)联用对鼠黑色素瘤B16细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。MTT法检测r Ph LTP、顺铂单独及联用后对鼠黑色素瘤B16细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和线粒体膜电位(Δψm)的变化情况。结果显示,r Ph LTP和DDP联用后细胞生长抑制率和凋亡率显著高于DDP单独处理组(P<0.01);而且胞内ROS升高的水平均高于单独处理组(P<0.01),胞内Δψm水平均低于单独处理组,但无显著性差异。r Ph LTP可增强顺铂对B16细胞的生长抑制并促进细胞凋亡,与顺铂具有协同作用。     

内皮抑素基因抗黑色素瘤细胞高转移的动物研究

目的:验证转内皮抑素基因抑制高转移性黑色素瘤细胞的转移能力.方法:将 pcDNA3.1-Endo 真核表达载体转染小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16F10,运用RT-PCR和Western-blot验证Endo的表达后,进行瘤细胞的粘附实验、体外侵袭和运动实验以及C57BL/6小鼠的皮下种植瘤和肺转移瘤试验,并进一步统计分析.结果:内皮抑素基因能明显抑制B16F10黑色素瘤细胞的粘附、体外侵袭和运动、体内成瘤以及肺转移能力,其中粘附抑制率36.4%,体外侵袭抑制率48.4%,细胞运动功能抑制率52.1%,肺转移抑制率为67.3%.结论:转内皮抑素基因能明显抑制黑色素瘤细胞的高转移能力.     

3,5-二氯苯基双胍抑制黑色素瘤肺转移的裸鼠体内药效学研究

目的 确认整合素αvβ3新型抑制剂3,5-二氯苯基双胍对人黑色素瘤肺转移的抑制作用.方法 应用前期建立的人黑色素瘤裸鼠肺转移模型,观察3,5-二氯苯基双胍的治疗效果.裸鼠尾静脉接种黑色素瘤细胞(第1天)后,于第5、9、13、17和21天给予该药物治疗.50 d实验结束,处死裸鼠并取完整的肺组织,Bouin氏液固定24 h后根据肺表面癌结节的大小和数量给予评分,以此评价肺转移的程度.结果 3,5-二氯苯基双胍6、12 mg/kg和24 mg/kg治疗组的转移分数分别为(55.25±13.60)、(35.13±17.36)和(12.83±11.44),与溶剂对照组(转移分数是82.50±17.72)相比具有明显差异(P＜0.05).阳性对照组的转移分数为(11.50±10.44)(P＜0.05 vs 溶剂对照组),阴性对照组和PBS对照组的转移分数分别为(88.50±17.21)、和(88.87±11.29) (P ＞0.05 vs溶剂对照组).结论 3,5-二氯苯基双胍在裸鼠体内能够明显抑制黑色素瘤肺转移,并呈现一定的剂量依赖性.     

人黑色素瘤细胞裸鼠肺转移模型的建立

目的建立整合素αvβ3高表达的黑色素瘤细胞肺转移模型。方法通过将不同数目的M21细胞经尾静脉接种裸鼠,适时处死后计数肺表面癌结节。通过实时定量PCR和明胶酶谱的方法比较肺转移灶细胞与亲代M21细胞差异。结果M21细胞1×10^6、2×10^6、5×10^6尾静脉接种裸鼠,均能形成肺转移灶,癌结节数目均值分别为：84±8、70±6、88±12,三组之间没有明显差异,阴性对照组未形成转移灶。M21肺转移灶细胞与亲代细胞相比,增殖增快,MMP-2活性增高,整合素αv和β3mRNA表达水平明显增高。结论M21细胞1×10^6经尾静脉接种裸鼠50d内即可100%成瘤。M21肺转移灶细胞具有更快的增殖能力,整合素αvβ3和MMP-2表达水平明显增高。本实验建立了稳定的肺转移模型,为黑色素瘤和整合素αvβ3的研究提供重要的动物模型。     

带HSV—tk基因的重组腺病毒基因治疗小鼠B16黑色素瘤的实验研究

我父成功开展了携带单纯疹疹Ⅰ型病毒胸腺嘧啶激酶基因（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｈｙ－ｍｎｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ,ＨＳＶ－ｔｋ）的复制缺陷型重组腺病毒Ａｄ（ＨＳＶ－ｔｋ）结合使用ＧＣＶ治疗Ｃ５７ＢＬ／６小鼠Ｂ１６黑色素瘤的离体及动物试验。     

带HSV-tk基因的重组腺病毒基因治疗小鼠B16黑色素瘤的实验研究

我们成功开展了携带单纯疱疹Ⅰ型病毒胸腺嘧啶激酶基因(Herpes simplex virus thy-midine kinase,HSV-tk)的复制缺陷型重组腺病毒Ad(HSV-tk)结合使用GCV治疗C 57 BL/6小鼠B 16黑色素瘤的离体及动物试验。导入了HSV-tk基因的B16细胞对GCV的杀伤作用高度敏感,IC_(50)约为0.1μg/ml;感染与未感染Ad(HSV-tk)的B 16细胞混合后,可观察到显著的细胞毒杀伤作用——“旁观者效应”。Ad(HSV-tk)直接注入C57BL/6小鼠已建成的B16黑色素瘤内,结合连续6 d腹腔给予GCV,肿瘤结节出现萎缩坏死现象,大小仅为对照组的1/25。灵敏的RT-PCR检测结果表明:瘤内注射Ad(HSV-tk)后,腺病毒的扩散范围是有限的,HSV-tk基因的表达局限于肿瘤组织内。因此,Ad(HSV-tk)/GCV疗法可能为黑色素瘤等恶性实体瘤的治疗提供了一种较为有效、安全的选择方案。     

重组卡介苗HSP65抑制小鼠移植黑色素瘤的初步药效学研究

观察卡介苗来源的热休克蛋白HSP65对小鼠移植黑色素瘤的抑制作用并初步探讨可能的作用机制。通过基因工程手段获得纯化的重组HSP65蛋白,与弗氏佐剂联合给药C57BL/6J小鼠。分别设计了两组免疫方案,一组于肿瘤细胞接种前免疫3次,另一组于肿瘤细胞接种前免疫7次。结果在免疫3次的情况下,虽然也能激发较高的特异性抗HSP65抗体,但抑瘤效果不明显(抑瘤率14.2%);增加免疫次数到7次后,抑瘤率高达73.2%,效果显著。经肿瘤组织病理切片发现,增加免疫次数导致肿瘤组织中灶性坏死增加,淋巴细胞浸润增加,且肿瘤细胞病理性核分裂相减少,提示了该疫苗作用的可能机制。     

层连蛋白受体及其与肿瘤转移的关系

层连蛋白受体及其与肿瘤转移的关系李慧芳谢弘（中国科学院上海细胞生物学研究所,上海２０００３１）关键词层连蛋白受体肿瘤转移肿瘤转移是一个复杂的多步连续过程,大致可概括地分为以下几个步骤：（１）恶性瘤细胞穿破基膜形成浸润灶;（２）脱落;（３）瘤细胞穿破脉...     

双功能结构域重组FN多肽表达质粒的构建及其表达产物的功能

构建了纤维结合素（ＦＮ）的双功能结构域重组多肽的两个表达质粒,在大肠杆菌中表达了两个重组多肽：ＣＨ５０（ＦＮ的Ｐｒｏ１２３９Ｓｅｒ１５１５经Ｍｅｔ和Ａｌａ１６９０Ｔｈｒ１９６０相连）和ＣＨ５６（ＦＮ的Ｐｒｏ１２３９Ｔｈｒ１９６０）。两个多肽都具有结合肝素的功能,可通过肝素琼脂糖亲和层析得到纯品,所得纯品亦都具有结合细胞的功能。ＣＨ５０和ＣＨ５６的制备为进一步研究其抑制肿瘤转移的作用奠定了基础     

重组骆驼蓬脂转移蛋白与顺铂联合抑制黑色素瘤B16细胞增殖效应的研究

旨在探讨重组骆驼蓬脂转移蛋白(Recombinant Peganum harmala lipid transfer protein,r Ph LTP)与顺铂(DDP)联用对鼠黑色素瘤B16细胞增殖抑制和凋亡诱导作用。MTT法检测r Ph LTP、顺铂单独及联用后对鼠黑色素瘤B16细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)和线粒体膜电位(Δψm)的变化情况。结果显示,r Ph LTP和DDP联用后细胞生长抑制率和凋亡率显著高于DDP单独处理组(P0.01);而且胞内ROS升高的水平均高于单独处理组(P0.01),胞内Δψm水平均低于单独处理组,但无显著性差异。r Ph LTP可增强顺铂对B16细胞的生长抑制并促进细胞凋亡,与顺铂具有协同作用。     

小鼠正常黑色素细胞与黑色素瘤细胞(B16)mRNA表达差异分析

黑色素瘤是一种高侵袭性的恶性皮肤肿瘤,转移率高、预后差。研究黑素瘤细胞生物学特性对黑素瘤的治疗和控制具有重要的意义。本研究以C57BL/6J小鼠的正常黑色素细胞及B16黑色素瘤细胞为研究对象,采用二代测序技术分析两种细胞间的转录组表达差异,筛选差异基因,为后续黑色素瘤的形成机制研究提供理论依据。采用差异倍数及错误率分析测序数据,鉴定出1 436个新的mRNA和4 086个差异表达的已知mRNA。GO数据库和KEGG数据库分析显示,差异表达的mRNAs参与了149个调控途径,主要集中在疾病调控、细胞周期调节和环境信息调控方面。qRT-PCR及Western印迹检测发现,调节细胞增殖、迁移的Pdgf-B、Integrinβ1和Integrinβ5以及调节黑色素颗粒增加的Mitf、Tyr、Tyrp1和Tyrp2在B16细胞中的表达量显著高于在正常黑色素细胞中的表达。本研究获得的差异基因为后续黑色素瘤的研究提供了新的候选基因。     

小鼠正常黑素细胞与黑色素瘤细胞（B16）mRNA表达差异分析

黑色素瘤是一种高侵袭性的恶性皮肤肿瘤,转移率高、预后差。研究黑素瘤细胞生物学特性对黑素瘤的治疗和控制具有重要的意义。本研究以C57BL/6J小鼠的正常黑色素细胞及B16黑色素瘤细胞为研究对象,采用二代测序技术分析两种细胞间的转录组表达差异,筛选差异基因,为后续黑色素瘤的形成机制研究提供理论依据。采用差异倍数及错误率分析测序数据,鉴定出1 436个新的mRNA和4 086个差异表达的已知mRNA。GO数据库和KEGG数据库分析显示,差异表达的mRNAs参与了149个调控途径, 主要集中在疾病调控、细胞周期调节和环境信息调控方面。qRT-PCR及Western印迹检测发现,调节细胞增殖、迁移的Pdgf-B、Integrin-β1和Integrin-β5以及调节黑色素颗粒增加的Mitf、Tyr、Tyrp1和Tyrp2在B16细胞中的表达量显著高于在正常黑色素细胞中的表达。本研究获得的差异基因为后续黑色素瘤的研究提供了新的候选基因。     

MiR-150缺失增强小鼠NKT细胞IFN-γ产生并抑制黑色素瘤细胞的肺转移

CD1d限制性NKT细胞(自然杀伤T细胞)是一群具有免疫调节功能的T细胞亚群,在调控多种免疫应答中发挥重要作用．MicroRNAs介导的RNA干扰已被证明是调控NKT细胞发育和功能的关键分子机制,然而特异microRNA在NKT细胞发育和功能中的作用目前仍不清楚．在本研究中,我们采用miR-150基因敲除小鼠以及流式细胞术、ELISA等方法,观察miR-150对小鼠NKT细胞发育和功能的影响．结果表明：miR-150基因缺失致小鼠胸腺NKT细胞数量减少,但不影响外周NKT细胞的数量;活化后miR-150敲除小鼠NKT细胞与野生型小鼠NKT细胞相比,IFN-γ产生增加．进一步采用小鼠黑色素瘤模型观察miR-150对肿瘤细胞转移的影响,发现miR-150敲除显著增强半乳糖神经鞘氨醇(α-Galcer)对小鼠黑色素瘤细胞肺转移的抑制效果．上述结果为特异microRNA调控NKT细胞发育和功能的研究提供了新的线索．     

软骨多糖抑制Hca-F肝癌细胞转移的初步研究

目的:研究软骨多糖抑制小鼠淋巴结高转移肝癌细胞Hca-F侵袭转移的作用。方法:以615近交系小鼠右脚垫皮下注射肝癌细胞Hca-F建立转移模型,设模型组和给药组。检测软骨多糖抑瘤率、淋巴道转移抑制率、淋巴结石蜡切片HE染色观察肿瘤细胞侵袭情况和采用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α的含量。结果:软骨多糖具有明显的抑瘤作用,抑瘤率达61.9%;淋巴结转移抑制率为22.2%;通过比较模型组和给药组瘤细胞转移部位淋巴结的HE染色,发现给药组转移情况明显低于模型组;ELISA检测表明给药组血清中TNF-α的含量明显低于模型组(P<0.05)。结论:软骨多糖一定程度上能够抑制肝癌细胞Hca=F向周围淋巴结转移,为开发治疗恶性肿瘤的药物提供了选择。     

应用基因表达谱芯片从不同转移能力的 乳腺癌细胞中筛选转移相关基因

人乳腺癌细胞系 MCF-7 及其转移亚克隆 LM-MCF-7 为肿瘤转移分子机制的研究提供了细胞模型 . 应用基因芯片技术比较两种具有不同转移能力细胞系基因表达谱的差异,寻找乳腺癌转移相关基因 . 提取两种细胞总 RNA ,分别用 Cy5-dCTP 、 Cy3-dCTP 标记 LM-MCF-7 和 MCF-7 的 cDNA ,并与含有 21 329 个基因的芯片进行杂交并扫描,利用 GenePix Pro 4.0 图像分析软件处理数据判断基因是否在两个细胞中存在表达差异 . 经互换荧光标记物重复两次实验,共筛选出差异表达基因 67 个,其中 41 个在 LM-MCF-7 细胞中表达上调, 26 个在 LM-MCF-7 细胞中表达下调 . 应用实时定量 RT-PCR 对 7 个表达差异明显的基因进行了验证 . 生物信息学分析结果提示,上述发现的差异基因编码产物与细胞内信号转导、转录调节、应激反应、新陈代谢、发育、细胞运动、细胞凋亡和细胞粘连等功能有关 . 据文献报道,这些差异表达的基因中有 35 个与肿瘤有关,其中 9 个与乳腺癌转移有关, 6 个可能参与肿瘤浸润和转移过程 . 根据基因芯片检测的结果,从功能上对 LM-MCF-7 细胞和 MCF-7 细胞与细胞凋亡的关系进行了研究,发现具有高转移倾向的 LM-MCF-7 细胞与 MCF-7 细胞相比,抗凋亡能力较强 . 上述与肿瘤转移相关基因在肿瘤转移中的作用及其分子机理有待深入研究 .     

抗原负载DCs诱导的CIK细胞对B16黑色素瘤抑制作用的形态学观察

目的:探讨抗原负载树突状细胞(dentritic cells,DCs)诱导的CIK(cytokine induced killer)细胞对B16黑色素瘤的抑瘤作用。方法:分离、培养DC和CIK细胞,取部分DC进行肿瘤抗原负载,将其与CIK细胞按1:10的比例共培养3d,即为抗原负载的DC-CIK。建立B16黑色素瘤小鼠模型,分别于瘤周围皮下注射经Brdu标记的CIK、DC-CIK、抗原负载DC-CIK。按注射细胞进行分组,测量注射前后各组小鼠的瘤体积,计算抑瘤率,比较其抑瘤作用。应用免疫组化方法和透射电镜观察抗原负载DC-CIK细胞在皮肤中的分布及杀伤肿瘤细胞的形态学表现。结果:抗原负载DC诱导的CIK(细胞组抑瘤率(86.57%)高于CIK细胞组(33.34%,P<0.05)和DC-CIK细胞组(61.08%,P<0.05);光镜下抗原负载DC-CIK细胞主要分布在皮下组织,癌组织周围,特别是癌巢周边。透射电镜下抗原负载DC-CIK细胞体积大,核有切迹,细胞质内细胞器丰富,粗面内质网扩张。细胞表面有突起,与肿瘤细胞密切接触。大量肿瘤细胞凋亡、坏死。结论:CIK细胞经抗原负载DC诱导后抑瘤作用明显强于单纯CIK细胞和DC-CIK细胞。     

肿瘤转移抑制基因nm23研究的新进展

肿瘤转移抑制基因ｎｍ２３在不同转移潜能的癌细胞中多为低表达,在ｎｍ２３的两种亚型中,ｎｍ２３－Ｈ１可能在转移抑制中起着更重要的作用。ｎｍ２３蛋白可能 是通过与ＮＤＰＫ一致或相似的途径调节肿瘤的转移抑制,对ｎｍ２３的研究是近年肿瘤转移换制研究的热点,本文就其新近进展作一综述。