新型冠状病毒SARS-CoV-2检测技术的研究进展

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)具有较强的传播能力,已证实可人传人,无症状携带者也可传播.快速、准确诊断新型冠状病毒对控制疫情爆发尤为重要.论文基于国内外的相关研究进展,就新型冠状病毒的荧光PCR、等温扩增、基于Cas酶技术、免疫法四大类检测技术进行了详细的分析与梳理,以期为新型冠状病毒及其他流行性病毒诊断及防控提供借鉴和思路.     

用于临床新型冠状病毒核酸检测的分子诊断新技术

目前新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)在全球仍呈现大流行趋势,该病潜伏期长、传染性强,给全世界人民的健康安全带来严重威胁。新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus2, SARS-CoV-2)核酸检测作为COVID-19确诊的重要依据之一,在疫情防控工作中发挥了巨大的作用。截至2020年8月17日,国家药品监督管理局已应急批准15个新型冠状病毒核酸检测试剂盒,其中10个试剂盒是以逆转录-实时荧光定量PCR (RT-qPCR)为主要技术原理,其余试剂盒分别采用了不同于RT-qPCR的5种分子诊断技术。本文对上述检测试剂盒所使用的技术原理、反应时间、优缺点等方面进行了介绍,以期为COVID-19及类似传染病的快速筛查、确诊、防控提供更多的方案思路。     

2020年湖北省襄阳市601份冷冻食品新冠肺炎病毒检测结果分析

自新冠疫情暴发以来,食品或其包装袋不断被检测出新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸阳性,均与冷冻生鲜相关。为评估SARS-CoV-2污染冷冻食品的风险,本研究采集湖北省襄阳市各大商超、批发市场和餐饮企业的601批次冷冻食品进行新型冠状病毒核酸检测,分析国内外不同品种和不同经营场所的冷冻食品的新型冠状病毒核酸检测结果。结果显示,该601批次的冷冻食品的新型冠状病毒核酸检测结果全部为阴性。本研究提示,襄阳市的冷冻食品被SARS-CoV-2污染的风险较低,其作为SARS-CoV-2传染源的可能性较小。     

数字PCR在新型冠状病毒检测中的应用前景

2020年,由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）导致的新型冠状肺炎（COVID-19）疫情在世界各国大规模爆发,导致全球公共卫生安全受到巨大影响。目前广泛采用的荧光定量PCR（RT-PCR）在检测SARS-CoV-2方面存在可能出现“假阴性”结果、需多次取样、重复检测等缺点,亟需建立一种灵敏度更高、样本用量少、操作简单的检测技术,以快速、准确、高效的筛选出新型冠状肺炎患者。数字PCR为新兴痕量核酸分子技术,具有灵敏度高、耐受性强、可绝对定量等优点,在病毒检测领域中广泛应用。介绍了SARS-CoV-2病原学特征和荧光PCR检测SARS-CoV-2目前存在的主要问题,并对数字PCR在SARS-CoV-2检测中的应用前景进行了具体阐述,以期为后续开发更高效的检测试剂盒、提高检测准确性提供方案。     

基于微流控芯片的等温扩增技术北大核心CSCD

基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的核酸扩增技术是分子诊断领域的金标准,然而PCR往往包含多个反应温度,涉及长时间的循环升降温过程,且需要在复杂热循环仪中完成,这些都限制了其在现场即时检测(point-of-care testing,POCT)中的应用。与传统PCR相比,等温扩增依靠恒定反应温度,反应时间短,检测装置简单,能够提供更加方便、快捷的核酸检测。基于微流控技术的等温扩增检测,通过兼顾微流控与等温扩增两者的优势,能够为POCT分子诊断提供更具竞争力的平台。例如,在新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情防控中,多种形式的POCT等温扩增检测展示了其独特优势。文中首先归纳总结了典型的等温扩增技术及其检测方法,然后对不同类型的等温扩增微流控系统进行了分类总结与分析(如功能定位、结构组成、流体控制、系统特点等),最后总结了等温扩增微流控系统在新冠病毒(SARS-CoV-2)等不同病原体检测领域中的应用,并对等温扩增与CRISPR基因编辑等其他新型技术的相互结合进行了介绍与展望。     

一种基于荧光qPCR检测新型冠状病毒核酸的优化反应体系的建立及相关测试

为实时并快速地检出SARS-CoV-2冠状病毒RNA,对基于荧光定量聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction,PCR)的反应体系进行了优化。结果表明,按照本实验提供的方法操作后,检测SARS-CoV-2冠状病毒所用的RNA样本的最小浓度稀释度可调至1/10000(初始值设为10ng/μL)。且用于检测COVID-19临床阳性样本所测得循环值(Cycle threshold,Ct)均低于35或40。其灵敏性测试结果也表明该方法的敏感性较好。同时在同等条件下,与目前市场上的COVID-19试剂盒的检测结果基本一致,并且检测循环数缩短2个单位。因此,本实验所建立的体系适用于前期临床诊断的筛查工作,为在医学上实现快速诊断提供了工具。     

COVID-19确诊病例居住环境病毒检测结果分析及防控探讨

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)传播速度快、感染范围广,其感染方式主要是聚集性感染,感染途径主要是呼吸道飞沫和接触传播。了解环境中,特别是COVID-19确诊病人生活环境中的病毒存在情况,是做好环境消毒,阻断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)传播的重要步骤,对COVID-19防控具有重要意义。本研究旨在探讨COVID-19患者生活环境中SARS-CoV-2的存在情况,从SARS-CoV-2存在的空间部位、病毒核酸含量、消毒效果等方面对SARS-CoV-2的相关特点做出初步研究,为制定有效的SARS-CoV-2防控措施提供科学依据。本研究以COVID-19病例治疗前的3个家庭居住环境和治疗出院后隔离期间的2个宾馆居住环境中采集的样本为研究材料,采用RT-PCR方法检测样本中的SARS-CoV-2核酸并进行比较分析。结果显示,首次从3个家庭环境中采样48份,RTPCR检测SARS-CoV-2核酸阳性5份(10.42%),3个家庭的环境样本中均有阳性样本检出。首次采样48h后在家庭3进行第二次采样16份,SARS-CoV-2核酸检测阳性2份(12.5%),检测Ct值比首次升高。家庭3消毒后24h采集的16份样本SARS-CoV-2核酸检测均为阴性,并且两处宾馆环境采集的24份样本SARS-CoV-2核酸检测也均为阴性。本研究提示,COVID-19病例的生活环境中可以检出SARS-CoV-2,病毒存在区域、存在物品、病毒核酸含量均有差异;对外环境进行消毒可以达到消毒目的,能够起到阻断SARS-CoV-2传播的防控效果。     

新型冠状病毒纳米PCR快速检测方法的建立

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染可导致致命性肺炎,且极具传染性。自2019年年末在我国出现以来,已在全球蔓延。为了建立一种灵敏、快速检测SARS-CoV-2的分子检测方法,本研究使用金纳米颗粒配合普通PCR检测方法,针对SARS-CoV-2核衣壳蛋白建立了SARS-CoV-2 NanoPCR新型分子检测方法。特异性结果显示,该方法对猪流行性腹泻病毒、牛冠状病毒、犬冠状病毒、水貂冠状病毒、猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应,表明该方法的特异性良好。敏感性结果显示,该方法的最低检测量为3.69×10⁴拷贝/μL,高于普通PCR最低检测量10倍,表明该方法的敏感性良好。使用建立的方法对3份临床样品进行检测,该方法与普通PCR方法结果一致,10倍稀释样品后,NanoPCR相比较普通PCR条带仍然具有较高辨识度。综上,本研究建立的灵敏、特异的NanoPCR方法可以对临床样品进行快速诊断和鉴定。     

新型冠状病毒肺炎感染病例中鼻咽拭子与咽拭子标本的病毒核酸检验结果分析

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)主要通过飞沫和密切接触传播,传染性强,目前在全球蔓延,给人的身体健康及世界公共卫生安全造成了严重的损害。病毒核酸检验是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病例确诊的金标准。本研究分别采集武汉江夏方舱医院67例确诊为COVID-19病例的鼻咽拭子与咽拭子标本送检,进行SARS-CoV-2核酸检验。其中28例患者鼻咽拭子病毒核酸呈阳性,13例患者咽拭子病毒核酸呈阳性,26例患者鼻咽拭子与咽拭子病毒核酸均为阴性。本研究结果提示,鼻咽拭子送检标本病毒核酸检验结果优于咽拭子标本(P<0.05)。     

新型冠状病毒实验室检测方法研究进展

世界范围内流行的SARS-CoV-2已造成大批新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者,严重威胁着全人类生命健康.新型冠状病毒肺炎尚没有特效药,也没有疫苗,实验室确诊新型冠状病毒肺炎,隔离传染源,尽早治愈患者对整个疫情防控起着非常重要的作用.目前实验室检测方法有病毒分离培养、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术、CRISPR/Cas技术、测序技术、基因芯片和抗原抗体检测.本文就上述几种方法做一综述,为确诊COVID-19提供参考.     

Sequential development of several RT-qPCR tests using LNA nucleotides and dual probe technology to differentiate SARS-CoV-2 from influenza A and B

Sensitive and accurate RT-qPCR tests are the primary diagnostic tools to identify SARS-CoV-2-infected patients. While many SARS-CoV-2 RT-qPCR tests are available, there are significant differences in test sensitivity, workflow (e.g. hands-on-time), gene targets and other functionalities that users must consider. Several publicly available protocols shared by reference labs and public health authorities provide useful tools for SARS-CoV-2 diagnosis, but many have shortcomings related to sensitivity and laborious workflows. Here, we describe a series of SARS-CoV-2 RT-qPCR tests that are originally based on the protocol targeting regions of the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) and envelope (E) coding genes developed by the Charité Berlin. We redesigned the primers/probes, utilized locked nucleic acid nucleotides, incorporated dual probe technology and conducted extensive optimizations of reaction conditions to enhance the sensitivity and specificity of these tests. By incorporating an RNase P internal control and developing multiplexed assays for distinguishing SARS-CoV-2 and influenza A and B, we streamlined the workflow to provide quicker results and reduced consumable costs. Some of these tests use modified enzymes enabling the formulation of a room temperature-stable master mix and lyophilized positive control, thus increasing the functionality of the test and eliminating cold chain shipping and storage. Moreover, a rapid, RNA extraction-free version enables high sensitivity detection of SARS-CoV-2 in about an hour using minimally invasive, self-collected gargle samples. These RT-qPCR assays can easily be implemented in any diagnostic laboratory and can provide a powerful tool to detect SARS-CoV-2 and the most common seasonal influenzas during the vaccination phase of the pandemic.     

重组酶介导扩增技术及其在病原微生物快速检测中的应用进展*

建立快速的病原学诊断方法对动物疫病的预防和控制、公共卫生安全等方面具有重要意义。重组酶介导扩增法(RAA)是一种新型恒温体外核酸扩增技术,在体外较低温度下就可以实现对DNA或RNA的快速扩增。RAA具有操作简便、快速、准确、节能、便捷等优点。重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶是该技术的三大核心物质,利用这三种物质可替代传统PCR的热循环解链过程。该技术将会在病原微生物检测方面发挥重要作用。对RAA技术及其在病原检测方面的应用进行了综述,以期为相关领域的研究提供参考。     

基于微流控芯片的核酸等温扩增技术研究进展

核酸等温扩增技术是一种在恒温体系内对核酸进行高效扩增的分子扩增技术,它能够在短时间内实现目的基因的指数增长.微流控芯片(microfluidic chip)技术是把研究样品制备、核酸富集、纯化和检测等多个操作步骤集成到一块“微型化”的芯片上,经自动化处理,得出实验结果,即“样品进,结果出”.将核酸等温扩增技术与微流控芯...     

等温扩增技术及其结合CRISPR在微生物快速检测中的研究进展

等温扩增技术因其对仪器依赖性低、核酸扩增高效等优势,非常适合于快速检测,已在微生物快速检测领域得到了广泛应用。本文从核酸提取、等温扩增(以环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification,RPA)为例)和产物检测角度,就近年来核酸等温扩增技术的发展及其在病原微生物核酸快速检测领域的应用进行综述,并概述了核酸等温扩增技术与CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑技术相结合的最新研究成果,为这些新兴技术的研究和未来的发展提供新思路。     

Corona Detective: a simple,scalable, and robust SARS-CoV-2 detection method based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification

Surveillance screening at scale to identify people infected by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) prior to extensive transmission is key to bringing an end to the coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic, even though vaccinations have already begun. Here we describe Corona Detective, a sensitive and rapid molecular test to detect the virus, based on loop-mediated isothermal amplification, which could be applied anywhere at low cost. Critically, the method uses freeze-dried reagents, readily shipped without cold-chain dependence. The reaction detects the viral nucleocapsid gene through a sequence-specific quenched-fluorescence readout, which avoids false positives and also allows multiplex detection with an internal control cellular RNA. Corona Detective can be used in 8-tube strips to be read with a simple open-design fluorescence detector. Other methods to use and produce Corona Detective locally in a variety of formats are possible and already openly shared. Detection specificity is ensured through inclusion of positive and negative control reactions to run in parallel with the diagnostic reactions. A simple user protocol, including sample preparation, and a bioinformatics pipeline to ensure that viral variants will still be detectable with SARS-CoV-2 primer sets complete the method. Through rapid production and distribution of Corona Detective reactions, quite inexpensive at scale, daily or weekly surveillance testing of large populations, without waiting for symptoms to develop, is anticipated, in combination with vaccination campaigns, to finally control this pandemic.