银染增强的纳米金标记探针对微量核酸的检测

本研究利用银染增强的纳米金技术建立了一种简单快速的核酸定量方法.该方法基于纳米金与烷巯基修饰的寡核苷酸分子共价键合作用,将纳米微粒报告基团标记在与靶核酸一端序列互补的寡核苷酸上,同时生物素化修饰另一端互补序列.靶核酸与两段寡核苷酸探针杂交后,借亲和素固定在酶标板孔内,通过纳米金催化的银染放大效应产生高灵敏的识别信号,适时记录其吸光度值从而实现核酸分子的定量.该检测方法检测单链核酸分子的灵敏度达0.1 fM,双链分子为10 fM.     

植物病毒检测芯片的杂交条件优化

利用芯片点样仪将5种侵染马铃薯的病毒/类病毒(苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒-卫星病毒、马铃薯病毒Y、马铃薯块茎纺锤状类病毒)的保守区寡核苷酸(Oligonucleotide,oligo)探针和PCR探针点样于玻片,并以植物18S rRNA作为内参照制成基因芯片。研究探针浓度、杂交时间、杂交温度以及点样液对芯片杂交的影响,并验证优化后病毒检测芯片的特异性。结果表明,寡核苷酸探针浓度介于5-20 ?mol/L之间对杂交信号强度影响不大,PCR探针浓度与杂交信号强度间呈线性关系;在45℃杂交4 h时,芯片的杂交信号最强,且该条件下进行杂交对两种探针芯片的影响趋势一致;点样液中以DMSO的杂交效果最好。经过整体条件优化后的两种探针芯片在杂交检测上具有较高的特异性,适于检测植物病毒。     

纳米金标记-逐步银染法快速检测金黄色葡萄球菌

将纳米金探针应用于目的核酸的检测,具有与PCR相当的灵敏度和特异性.本研究建立了一种可以在微孔板上快速检测金黄色葡萄球菌的纳米金标记-逐步银染法.该方法利用已包被链霉亲和素的微孔板,将PCR扩增的金黄色葡萄球菌nuc基因与生物素探针、纳米金探针形成的三明治杂交结构锚定其上,然后在低温下逐步银染显色,通过酶标仪检测放大的银染信号.这种纳米金标记-逐步银染法可以在显著降低非特异性背景信号的同时放大银染信号,检测金黄色葡萄球菌nuc基因的灵敏度为1 pmol/L,比常温一步银染法的灵敏度提高约102倍. 51例临床标本的检测结果与PCR法一致,与培养生化鉴定法的检测结果之间无显著性差异(P >0.05). 综上所述,本研究成功构建了金黄色葡萄球菌的纳米金标记-逐步银染法,在病原微生物的快速检测领域表现出广阔的发展潜力.     

应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片

本实验建立了一种应用金标链霉亲和素探针的目视化高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型(HerpesSimplexVirus-2,HSV-2)的基因芯片。该芯片以HSV-2DNA聚合酶的高保守区为靶序列,设计HSV-2特异性引物和探针,通过PCR反应使扩增产物标记上生物素;氨基修饰的探针固定在活化的玻片上,与生物素标记的扩增产物杂交;利用生物素与链酶亲和素高亲合力的特性,加入纳米金标记的链酶亲和素后形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统;银染反应后,达到目视化检测HSV-2效果。该HSV-2检测基因芯片能目视化检测出100fmol/L的HSV-2扩增产物,具有灵敏度高,低成本的特点,通过临床标本验证表明该芯片具有较高的准确性。     

应用纳米金探针检测HSV-2的目视化基因芯片

本实验建立了一种应用金标链霉亲和素探针的目视化高灵敏度检测单纯疱疹病毒2型(Herpes Simplex Virus-2, HSV-2)的基因芯片.该芯片以HSV-2 DNA 聚合酶的高保守区为靶序列,设计HSV-2特异性引物和探针,通过PCR反应使扩增产物标记上生物素;氨基修饰的探针固定在活化的玻片上,与生物素标记的扩增产物杂交;利用生物素与链酶亲和素高亲合力的特性,加入纳米金标记的链酶亲和素后形成生物素-链酶亲和素-纳米金生物反应放大系统;银染反应后,达到目视化检测HSV-2效果.该HSV-2检测基因芯片能目视化检测出100fmol/L的HSV-2扩增产物,具有灵敏度高,低成本的特点,通过临床标本验证表明该芯片具有较高的准确性.     

纳米金标记核酸探针检测小反刍兽疫 病毒核酸的研究

试验旨在探讨利用纳米金标记寡核苷酸探针快速检测小反刍兽疫病毒核酸的方法。针对小反刍兽疫病毒N基因的高度保守区设计两条特异寡核苷酸探针,一条探针5’端修饰生物素,另一条探针3’端修饰巯基。巯基化的探针通过Au-S键连接到纳米金颗粒上。靶核酸两端分别与两条探针结合,形成"生物素化探针-靶核酸-纳米金探针"复合物,该复合物通过生物素-亲和素系统,固定在固相载体上,最后银染放大信号。通过肉眼观察法、光镜观察法、分光光度法分析银染灰度,从而间接测定靶核酸的量。初步检测PPRV核酸最低浓度达10fmol/L,所需时间约为1.5h。该方法灵敏度高、操作简单,为临床检测小反刍兽疫病毒核酸提供实验数据和技术支持。     

纳米金基因芯片结合通用PCR同时检测多个病原性真菌

基于致病性真菌rDNA基因分型技术,构建采用通用引物的一次PCK法,并结合纳米金新型基因芯片检测系统实现一次对多个临床常见致病性酵母菌的检测分析.用生物素标记的通用引物扩增各真菌DNA片段并与基因芯片杂交,然后将链酶亲和素标记的纳米金结合到杂交体上,杂交信号通过银染反应被放大形成裸眼可见的显色信息.结果表明,通用引物可扩增临床常见的真菌DNA,选用的各探针特异性强、可靠性好,芯片的最低检测值达50 fmol/L.临床样品检测结果与常规鉴定方法结果一致.该技术检测时间短、操作简单、不需要特殊设备,能部分满足临床检测的通量要求,具有很好的临床应用前景.     

基于纳米金的显色基因芯片快速检测病原微生物

为构建一种新型的比色芯片,以实现对临床常见感染病原微生物的快速、准确地检测和鉴定.采用纳米金标记巯基修饰的各待检病原微生物的特异性基因片段,与相应的以各待检靶序列的特异性寡核苷酸探针构建成的基因芯片杂交,并通过结合银染反应将杂交信号被放大形成裸眼可见的显色信息来判读检测结果.该芯片技术检测时间短,最低检测值达 100fmol/L.操作方法简单,不需要特殊设备,能部分满足临床检测的通量要求,具有很好的临床应用前景.     

基于纳米金的比色分析法在核酸检测中的应用

随着纳米技术的发展,运用纳米粒子检测核酸成为研究的热点.在众多检测方法中,基于纳米金的比色分析法操作较为简便,只需普通光学仪器甚至肉眼即可观察结果,从而表现出广阔的市场及临床应用前景.基于纳米金的比色分析法有多种,不同检测原理的方法在灵敏度和实用性上存在差异.根据纳米金是否经寡核苷酸探针修饰可将其分为基于功能化纳米金的比色分析法和基于未功能化纳米金的比色分析法,前者又分为利用纳米金颜色变化的聚集反应体系以及利用纳米金特殊氧化-还原能力的银染增强体系.     

地高辛标记探针检测重组定点突变巴曲酶蛋白宿主DNA残留量的研究

目的 建立检测重组定点突变巴曲酶原液中外源性DNA残留量的方法.方法 从重组定点突变巴曲酶酵母工程菌提取基因组DNA作为模板,制备地高辛标记探针.此探针与样品进行点样杂交,并进行显色反应.结果 3批重组定点突变巴曲酶原液中,每人份剂量的宿主DNA残留量均＜10 ng.结论 该方法检测灵敏度较好,特异性较强,可用于重组定点突变巴曲酶的检测.