盘状结构域受体2胞外区的可溶性表达、纯化和功能鉴定

盘状结构域受体2（discoidin domain receptor 2,DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酷氨酸激酶,其配体为纤维性胶原,胶原对DDR2的活化上调细胞中基质金属蛋白酶1（MMP－1）的表达。为研究DDR2在类风温性关节炎(rteumatoid arthritis,RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用,尝试了在大肠杆菌中表达一段DDR2胞外区（命名DB）,并进行了可溶性部分的纯化和功能鉴定,以备将来用作DDR2的特异性阻断剂。获得了一株表达GST－DB融合蛋白的大肠杆菌克隆;其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的13％;经GST融合蛋白特异性亲和珠纯化后,获得了纯度约86.1%的可溶性GST－DB融合蛋白;竞争结合抑制实验显示,GST－DB具有阻断Ⅱ型胶原和细胞表面天然DDR2受体结合的功能;细胞实验表明,GST－DB有抑制Ⅱ型胶原刺激下的类风湿性关节炎滑膜细胞和NIH3T3细胞分泌MMP－1的作用。以上结果提示,表达的融保蛋白GST－DB具有抑制天然DDR2功能的作用;DDR2在滑膜细胞和NIH3T3细胞中介导Ⅱ型胶原刺激下的MMP－1的分泌。     

DDR2胞外区的可溶性表达、纯化和功能检测

盘状结构域受体2（discoidin domain receptor2,DDR2)一种受体型酷氨酸蛋白激酶,其配体为纤维型胶原。胶原诱导的DDR2磷酸化可上调细胞基质金属蛋白酶1的过表达。DDR2在人体内广泛分布并与肿瘤的转移相关。为进一步研究DDR2在肿瘤转移中的作用和DDR2在细胞内的信号通路,对DDR2的胞外区进行了原核融合表达并纯化可溶性部分,获得纯度约85%的纯化蛋白,竞争结合抑制实验证明,纯化的融合蛋白可以特异性阻断Ⅱ型胶原与天然DDR2受体的结合。     

蛋白酪氨酸激酶在类风湿性关节炎滑膜细胞中的表达和功能

克隆类风湿性关节炎（RA）滑膜细胞（FLS）中的蛋白酪氨酸激酶（PTKs）,并研究它们在RA滑膜细胞异常增殖和侵软骨中的作用。根据巳知的PTKs氨基酸序列保守区设计简并引物,采用3'快速末端扩增法（3'RACE)扩增滑膜细胞中PTKs cDNAs的3'末端,将所得序列与Genebank中序列进行比较,以鉴定其是否为巳知的PTKs或与PTKs同源的新序列,然后通过RNA点杂交方法分别观察这些PTKs在RA和骨性关节炎（OA）病人滑膜细胞中的表达水平。结果表明,从RA FLS中克隆到6种巳知PTKs的cDNAs片段,分别为血小板衍生生长因子受体A（PDGFRA）、胰岛素生长因子-1受体（IGF1R）、含discoidin结构域的受体型酪氨酸激酶（DDR2）、Lyn、Janus激酶1（JAK1）和TYK2。RNA点杂交结果显示,在4个RA病人和2个OA病人的滑膜细胞中,PDGFRA、IGF-1R和DDR2在RA滑膜细胞中的表达水平高于OA滑膜细胞,其它几处激酶在两种细胞中的表达水平相同。说明RI滑膜细胞中至少表达PDGFR、IGF1R、Lyn、DDR2、JAK1和TYK2等6种PTKs,其中PDGFRA、IGF1R和DDR2可能与RA滑膜细胞的过度增殖和对软骨的侵蚀性相关。     

Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族的研究进展

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases ,RTKs)为一类细胞表面跨膜蛋白,在介导细胞外信号向胞内传导过程中起重要作用.目前已发现约60种RTKs,按照受体与配体特征将其分为20个亚家族,其中Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族由三个成员组成:Tyro3 (又名Rse, Sky, Brt, Dtk, Etk2或Tif)[1-3]、Axl (又名Ufo,Ark或Tyro7)[4-6]和Mer (又名Nyk ,Eyk或Tyro12)[1,7-9].其分子均由胞外区、胞内区和跨膜区三部分组成,为单次跨膜蛋白,在人或动物的多种组织中广泛表达.它们具有共同的配体:Gas6和Protein S.Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族在调节细胞的增殖与分化中起着重要作用,然而其确切的功能和作用机理尚不清楚.目前该领域的研究越来越受到人们的重视,并正取得较大的进展.本文旨在综述Tyro3受体酪氨酸激酶亚家族及其配体的发现、特征及最新的研究进展,为从事该领域研究的工作者提供参考资料.     

TAM受体的生物学功能

TAM受体是最新的一个受体酪氨酸激酶(Recepter tyrosine kinases,RTKs)亚家族,包括三个成员:Tyro3、Axl和Mer。它们结构相似,具有共同的配体Gas6和Protein S。TAM受体广泛表达于哺乳动物的多种组织中,在神经、免疫、造血、生殖等系统发挥重要的生物学功能,可以调节多种细胞的存活、增殖与分化。对其功能及作用机理的研究近年来取得了较大进展,并受到广泛的重视。本文旨在概述TAM受体的研究进展,着重介绍其生物学功能的作用机理,特别是其介导的信号通路。     

表皮生长因子受体酪氨酸激酶的克隆表达和酶抑制剂筛选模型的构建

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）属受体酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TK）家族,其胞内的酪氨酸激酶在细胞信号转导通路中具有十分重要的作用。许多肿瘤的发生、发展都与EGFR胞内酪氨酸激酶的异常表达密切相关。因此,EGFR胞内酪氨酸激酶的抑制剂有可能成为治疗肿瘤的有效药物。从人脐静脉内皮细胞（HUVEC）提取总RNA,采用RT-PCR获得EGFR酪氨酸激酶催化域的编码基因。将其克隆至载体pET-30a,在E．coliBL21（DE3）中进行了成功表达,采用Ni-NTA亲和层析对其进行了纯化。通过对酶的活性的测定,证明重组EGFR酪氨酸激酶蛋白具有利用ATP催化底物发生磷酸化反应的激酶活性。以该重组激酶为靶位构建了酶抑制剂筛选模型,拟对微生物代谢产物进行筛选。     

c—Fms的分子结构与细胞内信号传导

ｃ－Ｆｍｓ是原癌基因ｆｍｓ的产物,是酪氨酸激酶受体家族成员之一,与单细胞／巨噬细胞的增殖,分化及其活性相关。ｃ－Ｆｍｓ胞外区含有５个Ｉｇ样结构域,胞内区具有酪氨酸激酶活性,是具有单一高亲和力受体分子。Ｍ－ＣＳＦ与ｃ－Ｆｍｇ Ｉｇ样结构域的Ｄ１,Ｄ２和Ｄ３结合,引起Ｄ４构象变化,受体二聚化而导致胞内区酪氨酸激酶的变化。     

种新的蛋白酪氨酸磷酸酶基因的克隆、定位和组织表达谱研究

从人胎肝cDNA文库分离出一长度为5248bp的cDNA克隆,该基因包含26个外显子和25个内含子,染色体定位于在某些肿瘤细胞中易缺失的3p21.1-21.33.其可读框编码1636个氨基酸,该蛋白属于蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)家族,其C端有一个典型的PTP结构域,N端含有约800氨基酸残基的BRO1样结构域及随后2个可能的SH3结构域结合位点,在这两个结构域之间及C末端还各有一个脯氨酸富集区.Northern杂交和点杂交分析显示,该基因以大约5.4kb的单一转录物广泛表达于人体各种组织,而且在人部分肿瘤细胞中高表达.结果提示,人源PTP-TD14是一个新的蛋白酪氨酸磷酸酶。 Abstract:A human cDNA of 5248bp encoding a novel protein tyrosine phosphatase PTP-TD14(1636aa) has been isolated from fetal liver.The gene is located at chromosome 3p21.3,an area frequently deleted in many types of cancer,and composed of at least 26 exons and 25 introns.The phosphatase has unique features in its domain structure:a tyrosine phosphatase domain,a C-terminal PEST motif,two SH3-binding motifs,two proline-rich region and an N-terminal domain similar to yeast BRO1 (a yeast protein that is involved in the mitogen-activated protein kinase signaling pathway).Northern blot and dot blot hybridizations indicate that it is expressed ubiquitously in human 50 tissues and 7 cancer cell lines.Thus,it is a novel protein tyrosine phosphatase gene located on 3p21.3.     

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)SAM结构域对激酶结构域的脂质体结合能力与激酶活性的调控研究

促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph receptor) 是受体酪氨酸激酶(RTK)家族中最大的亚家族,其介导的双向信号传导对细胞的形态、黏附、运动、增殖、生存及分化都有重要的调控作用。EphA2是Eph受体家族中一个被广泛研究的重要亚型,在白内障和乳腺癌等病理发生过程中发挥了重要作用。既往研究发现:EphA2受体的激酶结构域可结合细胞膜,其激酶活性受磷脂膜的调控,但是相邻的SAM结构域对激酶结构域与脂膜的相互作用以及激酶活性的影响尚不清楚。在此项研究中,通过与磷酸酶PTP1B1-301活性片段共表达的方式,表达、纯化了EphA2受体的胞内段激酶-SAM串联结构域,通过比较胞内段激酶-SAM串联结构域与单独激酶结构域的脂质体结合能力,以及测定对应的激酶活性,发现:EphA2受体胞内段的SAM结构域使其激酶结构域与脂质体(4 mg/mL)的结合能力增强约6倍(P＜0.001);磷酸化后的EphA2胞内段激酶-SAM串联结构域结合脂质体(4 mg/mL)的能力比非磷酸化的胞内段激酶-SAM串联结构域提高2.5倍(P＜0.05);而结合脂质体后,激酶结构域的激酶活性也被进一步提高,从而形成正反馈。综上所述,本研究的发现提示:EphA2胞内段的酪氨酸激酶结构域与相邻的SAM结构域可形成一个完整的结构功能单位,其激酶活性和脂质体结合能力与单独的激酶结构域相比都形成了明显的差异,我们的这一发现对进一步理解Eph受体家族其他亚型的激酶结构域的活性调控提供了参考与思路。     

十字孢碱对宫颈癌细胞中Btk表达的影响

目的探讨十字孢碱对宫颈癌细胞生长及酪氨酸激酶Btk（tyrosine kinase）基因和蛋白表达的影响。方法用不同浓度的十字孢碱处理宫颈癌HeLa细胞24h,采用MTT比色法分析IC50。用不同浓度十字孢碱处理HeLa细胞24h,Real—time PCR检测酪氨酸激酶BtkmRNA表达的变化,Western印迹检测酪氨酸激酶Btk蛋白表达的变化。结果随着十字孢碱浓度及处理时间的增加,宫颈癌HeLa细胞生长抑制率升高;随着十字孢碱剂量的增加,酪氨酸激酶BtkmRNA及蛋白的表达水平逐渐减少。结论十字孢碱可呈剂量依赖性抑制HeLa细胞的生长,呈浓度依赖性减少酪氨酸激酶BtkmRNA及蛋白的表达。     

接头蛋白c-Crk的结构和功能

接头蛋白c-CrK是原癌基因c-CrK表达的产物,参与了受体酪氨酸激酶和整合蛋白等多种分子的信号转导。C-CrK是最初发现于禽类病毒中的v-CrK在组织细胞中的同源物,通过mRNA选择性剪接产生两种形式的蛋白质c-CrKI和c-CrKⅡ,在各种组织中广泛表达。C-CrK分子在N端包含有一个SH2结构域,在C端两个SH3结构域。CrKL是CrK家族的另一个成员,但由不同的基因编码,其结构与c-CrKII十分相似。C-CrK蛋白质本身不具备任何酶活性,它通过SH2和SH3结构域连接蛋白质,使得不能直接相互作用的信号分子发生相互作用。c-CrK II的SH2结构域可以与含有磷酸化酪氨酸YXXP模体的蛋白质结合,如桩蛋白(paxillin)、Cas、c-Cbl和自身磷酸化的酪氨酸蛋白激酶受体等。SH3结构域与蛋白质中富含脯氨酸的PXLPXK模体结合,如C3G和DOCKl80等信号分子。由于c-CrK能够同众多的蛋白质信号分子结合,使得c-CrK广泛参与细胞内不同信号途径的信号转导。     

靶向EGFR家族的抗肿瘤药物研究进展

表皮生长因子受体（EGFR,ErbB）家族在肿瘤的发生、发展中具有重要的作用。很多实体肿瘤中存在EGFR家族受体过表达或异常激活。靶向EGFR家族的抗肿瘤药物研发已经成为一个热点领域,并且成功地应用于临床。靶向EGFR家族的抗肿瘤药物可以分为单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂两大类。单克隆抗体与受体胞外区结合阻止配体．受体的结合或者阻止配体结合引起的受体活化;而小分子酪氨酸激酶抑制剂则结合于胞内激酶区,抑制激酶自磷酸化和下游信号通路激活。     

蛋白酪氨酸磷酸酶-PEST在生理调节及相关疾病中的作用

蛋白质分子中酪氨酸残基可逆性的磷酸化是细胞内信号分子传导的基本方式。两类作用相反的酶参与磷酸化的调节:蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosinekinase,PTK)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatase,PTP)。含脯氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苏氨酸(P-E-S-T)结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP-PEST)属于非受体型酪氨酸磷酸酶类,其本身能与多种蛋白质相互作用,并在细胞迁移、免疫细胞活化和胚胎发育等生理过程中发挥重要作用。本文对PTP-PEST的结构特点、生理功效、介导的信号传导途径和近年来PTP-PEST在疾病中的作用作一综述。     

FHL1的结构和功能及其与疾病的关系

FHL（four and a half LIM domain）家族是含有4 个半LIM结构域的蛋白家族,现发现该家族由5 个成员,即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5 /ACT 组成,其表达具有组织特异性.它们通过LIM结构域与某些结构蛋白、激酶、转录调控因子等多种蛋白质相互作用,对某些基因的表达、细胞分化与发育、细胞骨架形成等发挥重要调控作用.FHL1（four and a half LIM domain 1）是FHL家族中表达最广泛的成员,尤其在骨骼肌和心肌中高表达.近年研究表明其参与某些病理过程,与心血管疾病、肌肉疾病、肿瘤疾病等相关.     

一种新的蛋白酪氨酸磷酸酶基因的克隆、定位和组织表达谱研究

从人胎肝cDNA库分离出一长度为5248bp的cDNA克隆,该基因包含26个外显子和25个内含子,染色体定位于在某些肿瘤细胞中易缺失的3p21.1-21.33。其可读框编码1636个氨基酸,该蛋白属于蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）家族,其C端有一个典型的PTP结构域,N端含有约800氨基酸残基的BRO1样结构域及随后2个可能的SH3结构域结合位点,在这两个结构域之间及C末端还各有一个脯氨酸富集区。Northern杂交和点杂交分析显示,该基因以大约5.4kb的单一转录物广泛表达于人体各种组织,而且在人部分肿瘤细胞中高表达。结果提示,人源PTP－TD14是一个新的蛋白酪氨酸磷酸酶。     

GST-pull down方法鉴定Src激酶与PSD-95的直接结合

脚手架蛋白PSD-95通过募集多种蛋白质在包括缺血性脑中风在内的多种神经系统疾病中具有重要的作用。Src蛋白激酶家族是膜相关非受体酪氨酸蛋白激酶中最大的家族,该家族激酶含有与突触后致密蛋白PSD-95相结合的结构域。Src激酶是其家族中主要成员之一,在脑组织中表达丰富。脑缺血/再灌注引起缺血敏感区Src激酶活性的显著增强。之前的研究表明,Src激酶参与调节PSD-95酪氨酸磷酸化。本实验主要通过GST-pull down实验体外鉴定Src与PSD-95之间的直接结合。     

血管内皮细胞生长因子受体结构与功能分析

血管内皮细胞生长因子受体（ＶＥＧＦＲ）是ＶＥＧＦ牧场划性的受体,属于酪氨酸激酶亚家庭中的一个新成员,具有特征性的胞外区和酪氨酸激酶区,因其在刺激血管内皮细胞增殖、促进新生血管生成,特别是在促进肿瘤生长及转移中的作用,已越来越成为人们研究的热点。本文概括了３种ＶＥＧＦ受体在体内的不同分布,分析了不同ＶＥＧＦ受体在碱基序列及蛋白质功能结构域的异同,并介绍了可溶性ＶＥＧＦ受体功能差异,以及在肿瘤及与血管     

p38MAPK与心肌缺血再灌注损伤

丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是广泛表达的丝氨酸/酪氨酸激酶,在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用,MAPKs有3个主要家族:ERKs,JNKs和p38MAPKs.p38信号通路是MAPK通路的一重要分支,在心肌缺血再灌注的损伤中起很重要的作用,p38MAPK信号通路与心肌缺血再灌注机制都有或多或少的联系,本文就以p38MAPK在这一病理过程的研究进展做一综述.     

水稻中水杨酸和茉莉酸特异诱导蛋白激酶基因OsSJMK1的分离和鉴定

裂原激活蛋白激酶（MAPK）级联系统负责把接受自胞外或胞内的信号进一步传递和放大而最终作用于特异的转录因子,从而启动或调控基因的表达。MAPK信号级联系统在细胞分裂、分化、生物胁迫和非生物胁迫等多种信号传递途径中起着十分重要的作用。该文以一个茉莉酸（JA）诱导的表达序列为基础,在水稻中分离到了一个裂原激活蛋白激酶基因OsSJMK1的全长cDNA。序列比较分析表明该基因编码498个氨基酸,蛋白质等电点为8．43,包括完整的MAPK家族的蛋白激酶结构域。OsSJMK1与所有物种的MAPK一样包括蛋白激酶的全部11个次级结构域,在Ⅶ和Ⅷ次级结构域间一个双磷酸化位点;该位点苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）残基之间为天冬氨酸（D）,而不是其他MAPK中常见的谷氨酸（E）、脯氨酸（P）或甘氨酸（G）。除了典型的MAPK激酶功能域外,在羧基端还有一段长约150个氨基酸残基的可能参与蛋白互作的结构域。以上这些结构特征表明OsSJMK1属于植物中第v类MAPK家族成员。蛋白激酶结构域序列比较表明OsSJMK1与报道的稻瘟病菌和机械伤害诱导的BWMK1的序列相似性高达81％,而且基因内含子和外显子的组成也非常相似,属于同一亚类,但在蛋白质序列的C端差异却很大。与BWMK1不同,OsSJMK1的表达不受伤害诱导,而受稻瘟病轻微诱导,但在JA和SA（水杨酸）处理早期表达量却迅速升高。在JA处理后1h,OsSJMK1转录水平升高到最大,而12h后回落到处理前的本底水平;在SA处理后30min转录水平就开始上升,2h达到最高值,而随后开始下降到处理前的本底水平。SA类似物BTH也能诱导OsSJMK1的表达。其他一些激素处理（如ABA）和非生物胁迫（如干旱、盐胁迫）都不对基因的表达产生任何影响,而且在植物大部分组织中的表达量都非常低。这些结果说明OsSJMK1可能特异性的参与JA和SA介导的防卫反应。     

Jak—STAT信号转导机制

许多细胞因子受体尽管缺少激酶结构域,但与配体结合后仍能诱导蛋白质的酪氨酸磷酸化。近年来的研究证明这一过程是由Ｊａｋ族蛋白质酪氨酸激酶的成员所介导的。Ｊａｋ激酶通过和受体的近膜区域的相互作用而与之缔合。配体结合引起受体聚合以及Ｊａｋ的酪氨酸磷酸化和激活,激活的Ｊａｋ又使受体和ＳＴＡＴ蛋白（信号转导物与转录激活剂）磷酸化、后直接参与基因转录的调控。本对这一新的胞内信号转导机制作一综述。