乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是我国常见病及多发病。ＨＢＶ难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍。目前虽然基因重组ＨＢＶ表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)疫苗预防ＨＢＶ感染取得了较好的效果 ,但基因重组ＨＢｓＡｇ疫苗主要能诱导特异性体液免疫 ,不能刺激机体的细胞免疫应答。近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应 ,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗 ,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2 ] 。为了探讨应用ＨＢＶ基因疫苗预防ＨＢＶ感染的可能性 ,本文构建了ＨＢＶ全Ｓ基因和ＨＢｓＡｇ基因疫苗 ,观察和比…     

乙型肝炎病毒变异与宿主免疫应答的研究进展

分子生物学与免疫学的新进展使乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的研究发生了革命的变化。由突变ＨＢＶ所致不同类型的感染是由宿主免疫系统,干扰素（ＩＦＮ）的反应和病毒基因型之间的复杂相互作用所致。本文从病毒变异与宿主免疫应答两方面综述了近年来ＨＢＶ分子生物学研究中的新进展。     

干扰素刺激基因表达对Peg-IFN抗乙型肝炎病毒免疫应答的影响

为了揭示干扰素刺激基因(interferon-stimulated gene, ISG)表达的改变对乙型肝炎病毒感染治疗效果的影响,本研究检测了干扰素刺激基因STAT1、MX和SOCS3在慢性乙型肝炎患者的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)和肝脏样品中的表达情况。结果显示,采用聚乙二醇干扰素(Peg-IFN)治疗后,Peg-IFN应答者的PBMC和肝组织中的STAT1和MX表达水平显著升高,而非应答者的SOCS3表达显著升高。在应答者的活组织检查中,Peg-IFN治疗24 h后细胞核中磷酸化STAT1的染色比例显著增加,而非应答者在治疗前肝细胞核染色比例较高,治疗后染色比例显著减少。此外,治疗前非应答者的肝SOCS3表达水平显著高于应答者,并且随着IFN的治疗SOCS3表达继续增加。本研究表明,STAT1和MX是Peg-IFN抗病毒免疫应答的正向调节因子,而SOCS3 (JAK/STAT途径的负调节因子)激活干扰素刺激基因的负调控,并抑制Peg-IFN的免疫应答。     

人乙型肝炎病毒前表面抗原preS基因的克隆与序列分析

从杭州、兰州两地各一例乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原阳性血清中提取病毒DNA,采取PCR技术扩增出前表面抗原(preS)基因片段,重组到质粒载体上,对该基因进行了全序列测定[GenBank索取号CpreS-HZAF325674;preS-LZAF325675].克隆的HBVpreS基因杭州分离物(preS-HZ)和兰州分离物(preS-LZ)全长522个核苷酸,编码174个氨基酸.preS-HZ与已发表的HBVadr亚型上海分离物[8]、北京分离物[9]、日本分离物[5]、HBVadw亚型[10]和ayw亚型[11]preS基因的核苷酸序列同源性分别为96.7%、96.2%、97.3%、88.7%和84.1%,氨基酸序列同源性分别为96.0%、94.9%、97.1%、85.1%和85.4%;preS-LZ与相应序列的核苷酸序列同源性分别为96.4%、96.2%、96.9%、88.7%、83.7%,氨基酸序列同源性分别为94.9%、94.9%、96.0%、85.1%、84.1%.分子进化分析(DNASTAR,1999)表明,克隆的两例HBVpreS基因属于adr亚型.preS-LZ与preS-HZ之间有两个核苷酸变异(对应两个氨基酸变异),相对于以上报道的序列二者含有四个特异的氨基酸突变位点.在免疫保护区内二者具有较好的保守性,可用于表达乙肝重组亚单位疫苗.     

磷脂爬行酶1对干扰素抑制乙型肝炎病毒(HBV)作用的影响

研究磷脂爬行酶1(Phospholipid scramblase 1,PLSCR1)对干扰素抑制HBV作用的影响。设计合成PLSCR1特异性小干扰RNA(siRNA),以完全随机序列的阴性小干扰(NCsiRNA)作为对照,转染HepG2细胞,于转染48h后分别检测PLSCR1mRNA和蛋白水平表达量的变化,筛选出对PLSCR1具有沉默作用的siRNA;将HepG2细胞分为正常对照组和干扰素处理组,将1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因真核细胞表达载体HBV1.3质粒分别与PLSCR1siRNA或NCsiRNA共同转染HepG2细胞或干扰素处理的HepG2细胞,转染48h后检测各组细胞中PLSCR1mRNA表达量及培养液上清中HBsAg表达水平。PLSCR1特异性小干扰RNA siRNA911转染后能够显著抑制HepG2细胞中PLSCR1基因在mRNA和蛋白水平的表达;与HepG2细胞对照组比较,干扰素处理组细胞转染HBV1.3质粒、NCsiRNA+HBV1.3质粒后,细胞培养液中HBsAg表达水平均显著降低(P0.05);而PLSCR1siRNA与HBV1.3共转染IFN处理的HepG2细胞组与共转染HepG2细胞组相比较,细胞培养液中HBsAg的表达水平没有显著差异。提示抑制PLSCR1的siRNA可抑制干扰素的抗HBV活性,提示PLSCR1在干扰素抑制HBV复制中具有重要作用。     

乙型肝炎病毒疫苗免疫不应答群体中蛋白质组表达差异性的初步研究

以往研究显示,人群中约有10%无法通过接种乙型肝炎病毒(HBV)疫苗而产生保护性水平的应答。为研究HBV疫苗免疫后不应答发生的机制,本研究对108例经正常免疫程序(大连汉信产HBV疫苗,10μg/支,共接种3针)后不同应答水平人群的血浆蛋白质组差异进行分析,将其分为无应答(抗体效价检测结果为阴性)组和高应答(抗体效价约1 000mIU/ml)组。用多重亲和去除系统(MARS)亲和柱去除14种高丰度蛋白后,采用双向荧光差异电泳(2D-DIGE)与基质辅助激光解析电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)相结合的方法,鉴定获得11种差异表达蛋白质。在这些差异表达蛋白质中,α1微球蛋白、激肽原1的表达在无应答人群中较高应答人群上调,而α1抗胰凝乳蛋白酶、维生素D结合蛋白、afamin、抗凝血酶Ⅲ和玻连蛋白表达下调。其中,α1抗胰凝乳蛋白酶、激肽原1和α1微球蛋白的差异性表达进一步得到酶联免疫吸附试验(ELISA)或蛋白免疫印迹法验证。以上蛋白质的表达情况与HBV疫苗免疫应答状况相关,可能成为检测HBV疫苗免疫应答水平的分子标记,为进一步研究免疫不应答机制奠定基础。     

佐剂CpG-ODN与重组HBsAg疫苗联合免疫乙型肝炎病毒转基因小鼠的免疫应答研究

目的 以CpG-ODN为佐剂与重组HBsAg(rHBsAg)疫苗合用,研究其对乙型肝炎病毒转基因(HBV Tg)小鼠模型的免疫应答效果.方法 40只HBV Tg小鼠随机分为4组,每组小鼠分别注射rHBsAg疫苗(单用rHBsAg组)、rHBsAg疫苗+CpG-ODN(试验组)、rIFNα-2b(IFN组)、生理盐水(对照组).经多次免疫HBV转基因小鼠,于免疫前、后不同时间采血,动态观察各组小鼠血清中HBsAg量、抗-HBs阳性率和HBV DNA的变化,检测肝组织中HBsAg的表达.检测免疫小鼠的外周血T淋巴细胞亚群和白细胞介素2(IL-2)、IL-12(p70)以及γ干扰素(IFN-γ)的含量,分别检测免疫小鼠的脾细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤功能并计算各组小鼠肝组织活性指数(HAI).结果 rHBsAg组和rHBsAg+CpG组在免疫小鼠后2周100%诱导抗-HBs;rHBsAg+CpG组能显著降低血清中的HBsAg量或使HBsAg转阴,rHBsAg+CpG组肝组织中HBsAg的表达量与血清中一样降低,并降低血清中HBV DNA的拷贝数.rHBsAg组的CD3+、CD4+、CD8+细胞在T细胞中所占百分比,IL-2、IL-12(p70)和IFN-γ的含量以及淋巴细胞特异性增殖和杀伤效应均明显高于对照组(P＜0.05).rHBsAg+CpG组与rHBsAg组比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞应答(P＜0.05),且以Th1型细胞免疫应答为主.在rHBsAg+CpG组肝组织中出现大量淋巴细胞,肝脏的HAI在4个组中最高.结论 CpG-ODN作为佐剂可以增强重组HBsAg疫苗诱导HBV转基因小鼠产生抗病毒免疫应答,重组HBsAg疫苗辅以CpG ODN可作为免疫治疗慢性HBV感染的可行性途经.     

含乙型肝炎病毒S-PreS1 基因的DNA疫苗与蛋白颗粒疫苗联合免疫可增强免疫应答

为研制新型有效的HBV治疗性疫苗,构建了含PreS1与S融合基因的HBV DNA疫苗,即pVRC-HBSS1 (PreS1 21–47 aa融合在S抗原1–223的羧基端),并制备了CHO表达相同结构的蛋白颗粒亚单位疫苗HBSS1。在Balb/C小鼠中采用不同的DNA免疫方式 (即肌肉注射、皮内注射加电转) 初免3次,蛋白颗粒亚单位疫苗 (不同佐剂) 肌肉注射加强免疫1次,然后我们分析比较了各组疫苗所引起的免疫应答特点。抗体检测结果表明：皮内注射结合电转初免组产生的PreS1与 S特异性抗体水平皆高于肌肉直接注射组。进一步还发现DNA疫苗与蛋白颗粒亚单位疫苗两种疫苗联合应用后S抗原特异的细胞免疫应答 (IFN-γ ELISpot分析) 明显高于DNA疫苗或蛋白颗粒亚单位单独应用,其中皮内注射+电转结合蛋白颗粒亚单位疫苗联合免疫组可产生最强的细胞免疫应答。这些研究为新型HBV 治疗性疫苗的优化设计与合理应用提供了依据。     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国常见病及多发病.HBV难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍.目前虽然基因重组HBV表面抗原(HBsAg)疫苗预防HBV感染取得了较好的效果,但基因重组HBsAg疫苗主要能诱导特异性体液免疫,不能刺激机体的细胞免疫应答.近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2].为了探讨应用HBV基因疫苗预防HBV感染的可能性,本文构建了HBV全S基因和HBsAg基因疫苗,观察和比较了这两种疫苗经肌肉注射接种到Balb/C小鼠体内后的细胞及体液免疫功能的变化.     

人乙型肝炎病毒前表面抗原(preS)基因的突变及其在家蚕细胞中影响表达的研究

为探讨人乙型肝炎病毒 (HBV)前表面抗原 (preS)基因的表达调控机理 ,以实现高效表达 ,利用PCR方法在克隆的 preS基因的第 2、3位密码子引入同义突变 ,消除存在于 5 '端编码区保守的反向重复序列 ,将 preS基因及其突变形式 (MpreS)分别重组到转移载体 pBM0 30 ,获得 pBM preS和pBM MpreS。将 pBM preS和 pBM MpreS分别与野生型家蚕核型多角体病毒 (BmNPV)DNA共转染家蚕培养细胞 (BmN) ,经空斑筛选和杂交证实 ,分别获得重组病毒rBmNPV preS和rBmNPV MpreS。RNA点杂交和ELISA结果表明 :虽然在rBmNPV preS和rBmNPV MpreS感染的BmN细胞内都转录了 preS基因 ,但仅后者表达出 preS蛋白 ,提示preS基因的表达与基因内部起始区的反向重复序列密切相关。     

乙戊型肝炎病毒重叠感染的研究进展

戊型肝炎(简称"戊肝")是发展中国家发病率最高的急性病毒性肝炎,疾病负担较重,近年来发达国家也出现越来越多散发的本土病例。我国慢性乙型肝炎(简称"慢乙肝")人群基数大,慢乙肝患者重叠感染戊肝病毒之后,可加重患者病情,增加肝硬化、肝衰竭以及死亡的发生风险。本文拟对乙型肝炎病毒重叠感染戊肝病毒的流行病学特征、临床特征及预防措施进行综述。     

乙型肝炎病毒

序:DNA重组技术已经从根本上改变了乙肝病毒的病毒学。病毒基因的组合,转录和复制已基本明了;肝细胞癌中的整合HBV序列结构已被描述。通过重组DNA技术生产新疫苗正继续发展。     

诱导免疫应答的肿瘤抗原

肿瘤抗原可以诱导机体的免疫应答,是肿瘤的免疫治疗中多肽疫苗的分子基础,近十年来发展起来的肿瘤疫苗筛选方法,利用肿瘤抗原特异性T细胞或抗体识别肿瘤抗原,为临床肿瘤免疫治疗提供了大量备选抗原分子。文中总结了肿瘤抗原的种类,及迄今几乎所有被证明的含有T细胞识别表位的抗原分子及其血清学反应性,为临床肿瘤疫苗的选择提供了依据。     

乙型肝炎病毒重组腺病毒载体疫苗的免疫研究进展

以人类腺病毒（Ａｄ）为表达载体发展多价展组口服活疫苗,尤其在乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）疫苗研制上成效显著,表达ＨＢｃＡｇ,ＨＢｅＡｇ和ＨＢｓＡｇ的重组人类Ａｄ７型（ｄ７）活载体疫苗在实验动物免疫上取得良好效果。在重组Ａｄ活载体疫苗研制方面是一项重大进展,表达ＨＢｓＡｇ的重组Ａｄ７活载体口服疫苗已有人体初次免疫试验的报道。     

利用基因芯片分析拉米夫定治疗过程中HBV DNA的基因变异

依据乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus; HBV)聚合酶基因序列研制HBV基因芯片,此芯片可分析HBV的7个基因型、4种血清型和HBV聚合酶基因rtV173、rtL180、rtM204和rtV207位点的突变.利用此芯片对A、B两组共计45例拉米夫定治疗12个月的患者进行服药前和服药后3、6、9、12个月的动态检测,其中C基因型39例,且血清型均为adr;B基因型6例,其血清型均为adw.在完成全程检测的38例患者中,17例ALT升高的A组出现1例拉米夫定耐药变异株,而21例ALT正常的B组出现4例变异株,且所有变异株均为rtM204 V/rtL180M,其中2例野生株和变异株共存.rtM204V变异最早在服药6个月时出现,随后出现rtL180M变异.10份PCR产物测序分析表明,芯片检测结果与测序结果基本一致,仅在rtL173位点出现1例差异.进一步分析HBV DNA变异与HBV DNA含量、ALT水平和HBeAg血清转换率的相关性,初步结果表明变异株的出现与治疗过程中的DNA反弹呈正相关,而与起始HBV DNA水平、ALT值无关联.HBV基因芯片可初步用于HBV DNA 检测,可能是临床追踪评价抗病毒治疗效果的较好方法之一.     

四川省自贡市幼儿园3至5岁儿童乙型肝炎病毒感染情况及影响因素

为了解四川省自贡地区3～5岁幼儿乙型肝炎病毒(HBV)感染情况,并探索与感染有关的因素,1985年调查了1167名幼儿,其HBV总感染率为41.13％,HBsAg阳性率12.68％。幼儿的HBV感染与母亲HBsAg阳性密切相关。共检查母亲409例,38例HBsAg阳性,其幼儿HBsAg阳性率为50％(19/38),HBsAg阴性的母亲371例,其幼儿HBsAg阳性率9.97％(37/371),来自HBsAg阳性母亲的阳性子女占33.3％(19/56)。1986年随访HBV易感幼儿448例,HBV年感染率为12.95％(58/448),HBsAg年阳转率3.79％。HBV年感染率与原幼儿班级HBsAg阳性率的高低有关。     

基因枪接种乙型肝炎表面抗原促进DNA疫苗诱生的免疫应答转换

目的 为了克服基因枪接种乙型肝炎表面抗原(HBsAg)DNA疫苗诱生的免疫应答以Th2为主的缺点,在基因枪接种质粒HBsAg DNA疫苗的同时共导入或共表达乙型肝炎病毒壳(HBV core)基因作为佐剂,以促进其所诱生的HBsAg特异性的Th2型免疫应答向Tn1型转换。方法 构建可单独或共同表达HBsAg或核心抗原(HBcAg)的DNA免疫用载体pIRKS／core、pIRES／C149、pIRES／S、pIRES／S／Core和pIRES／S／C149,并在真核细胞进行表达验证。对BALB／c雌鼠进行免疫并检测小鼠免疫后的特异性体液免疫和细胞免疫指标。结果 共导入或共表达HBV core基因能增强基因枪接种HBsAg DNA疫苗诱生的Th1型免疫应答水平,包括HBsAg特异的IgG2a应答、CTL活性、IFN-γ产生能力等。结论 以HBV core基因为佐剂能促进基因枪接种HBsAg DNA疫苗诱生的Th2型免疫应答向Th1型免疫应答转换。     

HCV/HBV复合抗原基因的克隆、表达及免疫应答研究

为探讨ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合疫苗的可行性,将合成的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）复合多表位抗原基因ＰＣＸ与ＨＢｓＡｇ 基因连接成ＰＣＸＳ基因,与β－半乳糖苷酶（ＧＺ）基因融合后在大肠杆菌及减毒鼠伤寒沙门氏菌中获得表达．目的蛋白ＧＺ－ＰＣＸＳ可被抗－ＨＢｓ 及抗－ＨＣＶ 抗体所特异识别．ＧＺ－ＰＣＸＳ抗原皮下注射免疫ＩＣＲ小鼠后,诱发了较高水平的抗－ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲ／ＰＣＸＳ）口服免疫小鼠后,诱发了高水平的ＣＤ８＋ Ｔ细胞增殖反应及抗ＧＺ－ＰＣＸＳＩｇＧ反应．所有免疫小鼠均未见明显的毒副作用．该研究揭示,ＨＣＶ／ＨＢＶ 复合抗原可诱发特异性体液免疫及细胞免疫应答,而活菌苗口服可能是理想的免疫途径,为ＨＣＶ／ＨＢＶ 双价疫苗研究提供了一定的理论及实验依据．