含有Rubisco小亚基启动子和转运肽序列的通路克隆入门载体的构建和应用

Gateway(通路克隆)技术是最近开发出来的一种分子克隆技术,其特点是操作简单、省时高效,已经成功应用于很多基因表达载体的构建.然而,现有的通路克隆植物表达载体不包含任何将表达蛋白定位到叶绿体中的序列.将通路克隆入门质粒载体pENTR-2B的XmnⅠ位点改造成HindⅢ位点,产生入门载体pENTR*-2B,然后将番茄1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基3C的启动子(PrbcS)及其转运肽序列(*T)和绿色荧光蛋白(GFP)报告基因亚克隆到pENTR*-2B中,构建通路克隆入门载体pENTR*-PrbcS-*T-GFP.实验结果证实,用pENTR*-PrbcS-*T-GFP和通路克隆的植物表达载体进行LR反应,构建GFP的光诱导型植物表达载体,可以成功地将表达的GFP定位到转基因植物的叶绿体中.利用β-葡糖苷酸酶(GUS)报告基因替代该入门载体中的GFP基因做试验也得到相似的结果.这说明用目的基因替换该入门载体中的GFP可以构建目的基因的入门载体,然后用通路克隆技术可以快速构建其光诱导型植物表达载体,将表达的目的蛋白定位到转基因植物或组织细胞的叶绿体中.     

含gfp植物转基因表达载体的构建及在矮牵牛转基因不定根中的高效表达

利用pBIN19、pGFP和pCHS质粒, 成功构建了CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达载体pBIN-35S-GFP, 并导入野生型发根农杆菌K599。矮牵牛的转化实验表明, 矮牵牛离体叶片被发根农杆菌K599(带pBIN-35S-GFP质粒)感染生根率达45%。对诱导的不定根基因组DNA的PCR检测表明, 不定根基因组中含有发根农杆菌K599 Ri质粒中的rolB基因和外源gfp基因;转基因不定根在蓝色光激发下能发出强烈的绿色荧光, 表明构建的转基因载体pBIN-35S-GFP能实现gfp基因的高效表达。该载体在CaMV 35S启动子的两端各有一个多克隆位点, 可以方便地进行启动子替换, 用于研究不同启动子的功能。此外, 该载体在gfp基因的5'端含有多克隆位点, 在3'端含有EcoRⅠ和BsmⅠ两个单一酶切位点, 可以方便地在5'端连接上目标基因, 表达含GFP的融合蛋白, 进行目标基因编码蛋白的亚细胞定位; 也可以方便地切除gfp基因, 连上需要的目的基因进行转化。     

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

生物信息学分析表明, 模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4 000多种蛋白质, 目前只分离得到1 000多种, 其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5'端长178 bp的DNA片段, 与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察, GFP只在叶绿体中特异表达。实验结果表明, AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。     

拟南芥中一个未知功能蛋白的叶绿体亚细胞定位研究

生物信息学分析表明,模式植物拟南芥叶绿体中含有大约4000多种蛋白质,目前只分离得到1000多种,其他预测的叶绿体蛋白的实验验证对叶绿体功能研究有重要意义。本文对一个预测的叶绿体未知功能蛋白AT5G48790进行了亚细胞定位研究。我们克隆了该基因5端长178bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白（GFP）基因构建重组载体pMON530-cTP-GFP。转基因植株通过激光共聚焦显微镜观察,GFP只在叶绿体中特异表达。实验结果表明,AT5G48790的确为叶绿体蛋白。本实验方法也可用于其他预测的蛋白质的实验验证。     

绿色荧光蛋白基因（G卯）在抗虫转基因植物研究中的应用

用合成的crylAc基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)构成融合蛋白基因,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光;经抗虫试验、PCR、Southern blot和Western blot等检测,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统,简化了抗虫转基因植物筛选程序,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速Gateway克隆系统

Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用Gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点“core attL”的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入pMD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到pMD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。     

拟南芥未知功能基因At3g61870编码蛋白的叶绿体定位研究

利用反向遗传学研究方法对1个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At3g61870编码蛋白进行了亚细胞定位研究.通过克隆At3g61870基因5′端长229 bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-CP-TP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥.转基因植株的叶肉细胞经激光共聚焦显微镜观察,叶绿素自发荧光与GFP荧光共定位于叶绿体中.结果表明,未知功能基因At3g61870编码的蛋白质为叶绿体蛋白质.     

以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建

目的:构建以木糖异构酶基因xylA为筛选标记的无抗生素标记Gateway系统植物表达载体。方法:克隆大肠杆菌木糖异构酶基因xylA并用其替换植物表达载体pCAMBIA1301中的hpt基因,利用载体中的多克隆位点将Gateway Binary Vector(pH7WG2D)中酶切位点XbaⅠ和HindⅢ之间包括P35S、T35S、attR1、attR2和CmR-ccdB的片段重组入表达载体pCAMBIA1301中,构建表达载体pCAMBIA1301-xylA-GW,利用含有津田芜菁HY5基因片段的BP反应产物与载体进行LR反应,获得含有目的基因的植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5,并导入根癌农杆菌LBA4404中。结果:抗生素筛选及酶切和PCR鉴定表明成功构建了以xylA为筛选标记的无抗生素标记植物表达载体pCAMBIA1301-xylA-HY5。结论:利用木糖异构酶基因xylA结合Gateway克隆技术构建无抗生素标记植物表达载体,可简化、方便植物转基因表达载体构建。     

T载体介导的基于attL核心区LR反应的简化快速Gateway克隆系统（英文）

Gateway克隆技术已得到广泛的应用。该技术先通过BP反应将目标片段连到带有完整attL特异识别位点的入门载体,然后与终载体通过LR反应得到表达载体。Gateway克隆方法与传统的酶切连接方法相比有快速简单等优点。但是,BP和LR酶都非常昂贵。本研究首先对3个常用Gateway载体的atts特异位点序列比对发现,attL序列核心交换位点"core attL"的21~22 bp长的碱基是保守和必要的。由此,设计含有core-attL序列的引物,通过PCR克隆得到DNA片段并连入p MD18-T载体,然后进行LR反应,可成功得到目标表达载体,并在保守的位点上正确重组。本研究还对其中一个带有绿色荧光蛋白基因的表达载体转化至烟草,能够正常表达该蛋白质。结果表明,通过将含有attL核心位点基因片段连接到p MD18-T载体上,可以省略BP反应而将目标片段连接到终载体上,节约了反应时间和成本。     

转录因子DREB1A基因的克隆与Gateway克隆技术构建植物表达载体

目的:研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用,并探讨利用Gateway克隆技术构建植物表达载体的方法。方法:根据GenBank中登录的DREB1A基因的全长mRNA序列设计引物,克隆了拟南芥的转录因子DREBIA基因。根据Gateway克隆技术的要求,设计含有attB接头的引物,利用高保真的PlatinumpfxDNA聚合酶,通过PCR方法在克隆基因的两端加上B序列。通过BP反应将包含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP的donor载体上以产生Entry克隆,通过LR反应将已经重组入Entry载体的DREB1A基因再克隆到pH2GW7双元载体。结果:对重组载体pH2GW7-DREB1A的鉴定结果表明成功构建了DREB1A基因的植物表达载体。结论:利用Gateway克隆技术构建植物表达载体简便易行,该结果为遗传转化研究奠定了基础。     

A组轮状病毒VP5*和VP8*的表达和免疫学性质研究

轮状病毒是引起婴幼儿腹泻的主要病原,VP4是RV重要的抗原蛋白,在早期病毒与细胞黏附过程中发挥重要作用,包括受体结合和细胞渗透。在细胞黏附过程中,VP4易被切割成VP5*和VP8*两个片段并以此增强病毒感染性。为了深入研究VP5*和VP8*的免疫学性质,进一步评价其应用前景,本研究从TB-Chen株RV基因组中编码VP4蛋白基因上克隆了VP5*和VP8*开放读码框核苷酸序列,构建了表达质粒,在原核大肠杆菌系统中重组表达了VP5*和VP8*蛋白,进一步分析了它们的免疫学性质。结果显示,VP5*和VP8*可在E.coli中高效表达,重组蛋白VP5* (rVP5*)和VP8* (rVP8*)可诱导免疫豚鼠产生特异性血清抗体,这些抗体可特异性识别自身蛋白（rVP5*或rVP8*）,可识别来自的TB-Chen株重组VP4蛋白,并可识别SA11和Wa感染的MA104细胞中合成的病毒VP4蛋白。这些结果表明,rVP5*和rVP8*蛋白具有较高的免疫原性,抗rVP5*和抗rVP8*的抗体具有高度特异性和交叉反应性。     

Analysis of HLA DR2&;DQ6 (DRB1*1501, DQA1*0102, DQB1*0602) Haplotypes in Iranian Patients with Multiple Sclerosis

Multiple sclerosis (MS) is prototype of inflammatory demyelinating disease of the central nervous system .The etiology of MS remains unclear, but according to current data the disease develops in genetically susceptible individuals and may require additional environmental triggers. The human leukocyte antigen (HLA) class II alleles (DRB1*1501, DQA1*0102, DQB1*0602) may have the strongest genetic effect in MS. In this study, the role of these alleles were investigated in 183 Iranian patients with multiple sclerosis and compared with 100 healthy individuals. HLA typing for DRB1*1501, DQA1*0102, DQB1*0602 was performed by polymerase chain reaction (PCR) amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) method. The results show that, HLA DR B1*1501 was significantly more frequent among MS patients (46% vs. 20%, PV = 0.0006) but DQA1*0102 haplotype was negatively associated with MS (30% vs. 50%, PV = 0.0049) and no significant association was found with DQB1*0602 and MS patients in comparison with control group (24% and 30%, PV = 0.43). No significant correlation was observed among these alleles with sex, type of disease; initial symptoms, expanded disability status scale (EDSS), as well as age at onset and familial MS. This study therefore indicates that there is no association of above HLA haplotypes with clinical presentation, disease duration, and disability in Iranian patients with MS which is in line with other previous studies in different ethnic groups.     

用PCR-SSP方法检测中国恒河猴Mamu-DRB*W101和Mamu-DRB*W201基因

利用序列特异引物聚合酶链反应(polymerase chain reactionsequence-specific primers,PCR-SSP)方法扩增中国恒河猴的主要组织相容性复合体II类基因Mamu-DRB*W101、-DRB*W201,初步了解中国恒河猴中Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因的阳性率。采集中国恒河猴静脉血,用DNA提取试剂盒提取全血DNA,分别用Mamu-DRB*W101、-DRB*W201特异引物PCR扩增Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因的第二外显子区域,并对扩增出的阳性条带进行测序,与已知序列对比验证序列是否正确。共检测了来自136只中国恒河猴的样本,PCR检测出Mamu-DRB*W101阳性个体10只,Mamu-DRB*W201阳性个体也是10只,其阳性个体所占比率均为7.35%。测序结果表明,PCR扩增产物的核苷酸序列与基因库中的序列完全一致。本研究表明中国恒河猴中存在Mamu-DRB*W101、-DRB*W201基因阳性个体,为中国恒河猴在AIDS研究中的应用及进一步分析中国恒河猴MHC II类基因提供了基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24 供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8 T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

Cisplatin adducts of d(CCTCTG*G*TCTCC).d(GGAGACCAGAGG) in aqueous solution by vibrational circular dichroism spectroscopy

The vibrational circular dichroism (VCD) and IR absorption spectra of a dodecamer d(CCTCTGGTCTCC).d(GGAGACCAGAGG) coordinated with cisplatin are distinct compared to those of the dodecamer without cisplatin. Although the intensity of PO(2)/deoxyribose absorptions (1150-850 cm(-1)) increases noticeably relative to those of the carbonyl and ring deformations of the bases (1750-1500 cm(-1)), the VCD spectra differ to a much greater extent. Overlapping positive and negative bands can be assigned relatively easily to individual vibrational modes. The effect of platination on the dodecamer duplex is expressed most prominently in VCD arising solely from the vibrations of the guanines bound to the platinum atom. The effect on the VCD features of other bases leads to minute wavenumber shifts at most. These observations are in agreement with previous NMR and X-ray experiments on the same oligonucleotide. The assignment of the absorption and VCD bands strongly resembles those of the octamer duplex d(CCTGGTCC).d(GGACCAGG) when coordinated with platinum. The spectra of the dodecamer did not indicate any isomerization of the complex with time, as is clearly the case for the octamer.     

应用HRM技术对CYP2C19*2和CYP2C19*3进行双重SNP分型

氯吡格雷是一种广泛用于预防静脉血栓形成的抗血小板药物。研究表明, 携带有CYP2C19基因功能缺失型等位基因CYP2C19*2、CYP2C19*3的病人, 其体内代谢氯吡格雷成为其活性形式的能力降低, 导致氯吡格雷抑制血小板聚集功能减弱。文章旨在建立一种利用高分辨率熔解曲线分析(High-resolution melting curve analysis,HRM)技术在闭合单管中同时对CYP2C19*2、CYP2C19*3两个多态性位点进行简便、准确分型的方法。本实验针对两个SNP位点分别设计特异性的HRM引物, 并在两个位点引物的5′端分别加上富含AT和GC的序列, 保证两个位点的扩增产物熔解峰无重叠。利用HRM技术, 快速、灵敏地对64例随机DNA样本的CYP2C19*2 、CYP2C19*3两个多态性位点进行了基因分型, 且HRM方法的分型结果与测序验证结果完全一致。因此, 利用HRM技术可以实现在闭合单管中简便、准确地对CYP2C19*2 、CYP2C19*3两个多态性位点同时进行基因分型。该方法有望应用于临床, 指导氯吡格雷的个体化用药。     

Peptide-binding motif of HLA-A*6603

The peptide motif of HLA-A*6603 was determined and compared with the available data on the peptide motifs of A*6601 and A*6602. A*6601 differs from A*6602 by two amino acids at positions 90 (Asp90Ala; outer loop) and 163 (Arg163Glu; pocket A). A*6603 differs from A*6601 and A*6602 by a single amino-acid exchange at position 70 (His70Gln; pockets A, B and C). No significant differences were found between the A*6602 and A*6603 peptide motifs suggesting that the Gln70His variation is of minor importance. However, the auxiliary anchors at position P1 of peptides bound by A*6601 (polar/acidic: Asp, Glu) and A*6602/6603 (polar/neutral: Ser) had striking differences. This finding may be best explained by the Arg163Glu substitution that results in a shift towards higher acidity in pocket A of A*6602/6603, apparently leading to the loss of preference for acidic auxiliary anchors. The similarity of A*6602 and A*6603 peptide motifs suggests low allogenicity when mismatched in stem cell transplantation. Inversely, the differences in A*6601 versus A*6602/6603 peptide motifs suggest that mismatches will have a higher allogenicity. These data will contribute to both assessing permissive mismatches in the A*66 group and weighting the impact of this individual amino-acid variation for matching and peptide binding algorithms.     

HLA-B*2736等位基因的序列分析

使用FLOW-SSO、PCR-SSP以及测序等分型技术, 发现一个与HLA-B*270401基因相关的未知基因。设计基因特异性引物单独扩增B*27基因的外显子2-5, 包括内含子2-4, 并进行双向测序, 分析与B*270401基因序列的差异。该基因的扩增产物为1 815 bp。与B*270401相比在外显子3和4共有10个碱基的改变, 从而使相应氨基酸发生错义或同义突变。碱基634 A→C (密码子130丝氨酸→精氨酸); 670 A→T (密码子142苏氨酸→丝氨酸); 683 G→T (密码子146色氨酸→亮氨酸); 698 A→T (密码子151谷氨酸→缬氨酸); 774 G→C (密码子176谷氨酸→天冬氨酸); 776 C→A (密码子177苏氨酸→赖氨酸); 781 C→G (密码子179谷氨酰胺→谷氨酸); 789 G→T (密码子181丙氨酸同义突变); 1 438 C→T (密码子206甘氨酸同义突变); 1 449 G→C (密码子210甘氨酸→丙氨酸)。在IMGT/HLA数据库中B*27组只有3个基因（B*270502 / 2706 / 2732）提交了内含子序列。该未知基因的内含子2序列与B*2706相同, 显示了与B*27组基因的同源性, 但其同源性在内含子3、4均未得到支持, 与B*27组基因相比, 内含子3的第106个碱基C→G, 碱基168缺失, 碱基179 G→A, 碱基536 G→A; 内含子4中碱基82 T→C。但其内含子3、4序列却与B*070201完全相同。该基因序列已提交GenBank, 编号为被DQ915176, 被WHO确认为HLA-B*2736等位基因。     

The potential in fluvial geomorphology of a new mineral identification technology (QEM*SEM)

The mineralogical signatures of fluvial sediments can be used to identify source areas and the degree of mixing of sediments from different fluvial and non-fluvial sources. The potential use of these signatures has not been fully realised because of uncertainties that result from mineralogical change as a result of sorting and weathering and the considerable time and expense involved in conventional optical mineral identification. A new quantitative mineral identification system QEM*SEM (Quantitative Evaluation of Materials by Scanning Electron Microscope), using an image analysis system with energy dispersive spectrometry and back scatter electron responses to identify phases, has been employed to provide rapid and economic analysis of sediments; large numbers of grains are counted with a greater statistical reliability than was previously possible.Results from a survey at the Nepean River, NSW, delineate the maximum level of flooding in an environment where clearly defined flood deposits are not evident. The results suggest the flood levels to be higher than predicted from previous studies.