人白细胞介素-2功能性受体在小鼠细胞可重建

白细胞介素-2(IL-2)与其受体相互作用,可促进已活化的T 细胞生长,但只当IL-2与高亲和性受体结合才能释放与生长相关的传导信号。作者从正常人用合成的寡聚核苷酸探针筛选出编码IL-2受体特异的基因克隆。筛选出的数个阳性克隆中,P~(IL-2R)-6克隆经分析发现能编码成人T 细胞白血病细胞表达的IL-2受体的全部序列。作者为了使IL-2受体cDNA 在哺乳细胞中稳定表达,构建了一个P~(SVIL-2R)-3质粒,并     

人胚胎干细胞高效分化为巨核细胞模型的建立

人胚胎干细胞具有无限增殖潜能,且能够分化为包括巨核细胞在内的大多数的成熟血细胞。因此,为解决临床治疗血小板来源不足而建立一种由人胚胎干细胞高效分化获得成熟巨核细胞的分化模型具有重要应用前景。该文利用人胚胎干细胞与m AGM-S3基质细胞系共培养进行早期造血前体细胞的定向分化,并在分化第14 d获得大量"卵石样"造血前体细胞(CD43+细胞、CD45+细胞)。将"卵石样"造血前体细胞分离后,用无血清培养基分阶段添加SCF、TPO、IL-6、IL-3、FLt-3、IL-11等细胞因子进行巨核细胞定向诱导分化。结果显示,在分化的第3 d,CD41a+细胞比例可高达48.5%,CD42b+细胞比例可高达30.0%。对分化第6 d的细胞进行Wright-Giemsa染色,可见形态典型的巨核细胞。综上所述,该研究初步建立了一种人胚胎干细胞高效分化为巨核细胞的模型,为体外获得大量巨核细胞奠定了基础。     

NF-κB和存活蛋白抑制药物诱导的倍体化与衰老巨核细胞的死亡

目的:筛选诱导巨核细胞倍体化药物,研究倍体化细胞的抗死亡机制,探索促进倍体化细胞死亡的用药方法。方法:采用不同药物处理巨核细胞白血病细胞系Dami细胞,检测细胞倍性、衰老、死亡及相关分子的变化。结果:Nocodazole、SP600125与SU6668可阻断Dami细胞增殖,诱导倍体化,促进细胞衰老,短期诱导不影响细胞活力。分子水平表明,抗凋亡分子存活蛋白表达上调,衰老相关分泌表型调控因子NF-κB(p65)活性降低。持续的药物诱导可致细胞死亡。结论:诱导巨核细胞倍体化抑制恶性增殖,促进细胞衰老发生,存活蛋白与NF-κB(p65)共同抑制倍体化和衰老细胞的死亡,而持续的药物诱导可促进细胞死亡,可作为急性巨核细胞白血病的治疗策略。     

人白细胞介素2受体(IL-2R)cDNA在哺乳类细胞中表达的初步研究

按DNA-磷酸钙共沉淀法将人白细胞介素2受体(IL-2R)cDNA转染小鼠成纤维细胞L929,经RNA点渍杂交分析、荧光标记IL-2染色和抗Tac(人IL-2受体α链)特异性玫瑰花环试验,均证明转入的IL-2R cDNA在L929细胞中表达,其产物具有结合IL-2和抗Tac抗体的能力。本文还报道了T细胞白血病Jukat细胞和Molt-4等细胞系异常表达IL-2R的结果,并对此作了分析和讨论。     

DC 与CIK细胞治疗难治复发急性髓细胞白血病的近期临床观察

目的：评估自体DC与CIK 细胞治疗难治复发急性髓细胞白血病的近期疗效与安全性。方法：给予20 例难治复发急性髓细 胞白血病患者树突状细胞(DC)与细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗,20 例难治复发的应用同样化疗方案的急性髓细胞白血病 患者做为对照组;治疗后4 周观察两组患者临床疗效和生存质量(KPS)评分,DC 与CIK 细胞治疗前和治疗后1 周检测T细胞亚 群(CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD3+CD56+)和细胞因子(IL-12、IL-2、IL-7、IFN-酌及TNF-琢)水平的变化。结果：①DC 与CIK 细胞 治疗组有效率和KPS评分明显高于对照组(P<0.05),所有患者的不良反应轻微,均可耐受。②DC 与CIK 细胞治疗后1 周,患者T 细胞亚群百分比和细胞因子含量较治疗前均明显升高,其中CD3+、CD3+CD56+及IL-12、IL-7 明显升高(P<0.05)。结论：DC与CIK 细胞免疫治疗难治复发急性髓细胞白血病安全有效。     

HrIL-6在大肠杆菌中的高效表达及其纯化复性的研究

白细胞介素6(IL-6)具有调节免疫应答、急性期反应和造血功能的作用。研究结果表明,IL-6可能成为治疗血小板减少症最有效的药物。IL-6还具有防止恶性肿瘤转移、抑制乳腺癌细胞克隆生长和促进髓样白血病细胞分化等抗肿瘤活性。基因工程IL-6的大量生产将进一步满足基础研究和临床应用的需要。 我们采用本院基础所构建的IL-6工程菌:E.     

血小板第四因子保护造血前体细胞及其作用机制的研究

我们曾报道血小板第四因子(PF4)是巨核细胞形成的有效的抑制因子,它可以保护干细胞免遭5-FU的毒性作用。本研究中试比较PF4和TGF-β1对人脐带血CD34~ 来源的MK的作用。PF4(5μg/ml)和TGF-β1(1ng/ml)在半固态凝块培养和悬浮培养中明显抑制人脐带血CD34~ 来源的MK的生长。用PF4处理的CD34~ 细胞在撤去PF4后仍能再生成集落,说明PF4的抑制作用的可逆性的。相反,用TGF-β1预处理的CD34~ 细胞撤去TGF-β后再培养,却不能再生成集落。然而,悬浮培养中经PF4预处理的CD34~ 细胞,可大大增加SCF结合细胞和CD34抗原阳性细胞的数量。与未经PF4预处理的细胞相比,PF4预处理的细胞和CD34抗原阳性细胞的数量。与未经PF4预处理的细胞相比,PF4预处理的细胞显示有较大的使5-FU处理的细胞形成MK集落的潜力。在小鼠体内实验中,用PF4(5μg/kg)间隔6h注射两次之后,再注射一次5-FU(150mg/kg),结果,在骨髓细胞培养中,HPP-CFC和CFU-MK大大增加。在指数生长的人红白血病细胞(HEL)中,添加PF4后,流式细胞显示细胞周期延长,S期的细胞数增加。与PF4不同,TGF-β将细胞阻止在G1期。这些结果显示PF4和TGF-β1抑制脐带血CD34~ 来源的MK生长的作用机制不同。PF4不同于TGF-β,它阻止细胞在S期,可逆性抑制细胞生长,保护干细胞和巨核细胞祖细胞免遭5-FU的毒性作用。     

IL-3和羟基脲协同诱导K562细胞凋亡

本文应用流式细胞分选仪和电子显微镜研究了IL-3和羟基脲对人红白血病细胞株(K562细胞)凋亡的影响.结果显示IL-3和羟基脲分别诱导K562细胞,不能引起细胞凋亡;而IL-3和羟基脲协同诱导K562细胞,可以引起细胞凋亡.用流式细胞仪检测到IL-3和羟基脲协同诱导K562细胞后,DNA含量低于二倍体的细胞数达31.90%,并产生明显的凋亡小峰.同时,IL-3和羟基脲协同诱导K562细胞,可抑制细胞周期中的S期,阻止细胞从S期进入G2/M期,使细胞周期延长,对K562细胞的生长和增殖具有抑制作用.在电镜下可观察到IL-3和羟基脲协同诱导的K562细胞,出现典型的凋亡细胞形态,细胞核内染色质浓缩、凝聚,紧靠在核膜边沿,形成新月形或环状的染色质结构,产生凋亡小体.提示IL-3和羟基脲具有协同效应,IL-3可提高K562细胞对羟基脲的敏感性,并可协同羟基脲诱导K562细胞凋亡.     

MLL-NRIP3融合基因诱发白血病的生物学特性研究

白血病是起源于造血干祖细胞的恶性增殖性肿瘤,是儿童时期最常见的恶性肿瘤,在成人恶性肿瘤中的发生比例也在逐渐上升,严重危害着人类健康与生存.MLL重排白血病(简称MLL-r)是其中一类具有独特生物学行为的白血病,MLL融合蛋白是影响预后的不良因素之一.MLL融合基因MLL-NRIP3(简称NRIP3)是近年来发现的新型MLL-r.有文献报道运用MLL-NRIP3融合基因可以建立白血病小鼠(Musmusculus)模型,并在白血病小鼠模型上研究其关联基因的敲降或过表达对白血病进程的影响,但未对其本身生物学特性进行单独研究.为了更加充分认识这一新的白血病类型,本研究将检测这类白血病的基本生物学表型,包括移植白血病细胞后受体小鼠生存期;白血病细胞迁移能力和黏附能力;白血病干细胞(LSCs)的比例、数目与功能;细胞周期和细胞凋亡等,并验证白血病复发、难治的关键细胞LSCs的表面标志是否同样适用于MLL-NRIP3白血病细胞.结果显示,与研究较为成熟的MLL-AF9(简称AF9)相比,MLL-NRIP3受体小鼠生存期较MLL-AF9延长,白血病细胞的迁移能力较MLL-AF9弱,黏附能力反较MLL-AF9强,而两者在细胞周期和细胞凋亡方面的生物学特性基本一致.体外克隆形成实验和极限稀释实验提示MLL-NRIP3白血病LSC数目、比例及功能较MLL-AF9白血病LSC降低.由此可得出结论:MLL-NRIP3诱发的白血病小鼠模型是低LSCs富集型MLL-r.     

IL-12诱导急性单核细胞白血病细胞分化及凋亡的机制研究

白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)具有明显的抗肿瘤作用,但其作用机制较复杂。前期形态学和功能的研究发现,IL-12可诱导单核细胞白血病细胞分化。该研究从巨噬细胞表面分化标志、细胞增殖能力、周期以及凋亡四个方面探讨了IL-12诱导急性单核细胞白血病细胞分化和凋亡的相关作用机理。结果发现,以人源性重组IL-12 p70处理的THP-1细胞,巨噬细胞表面标志CD68和CD11b的表达量明显增加并呈时间依赖性,CD68+和CD11b+阳性细胞数也显著增多;IL-12诱导分化过程中伴有THP-1细胞生长缓慢、G1期或G1/S期细胞周期阻滞现象;IL-12处理后的THP-1细胞凋亡率也明显增加,以早期凋亡细胞为主,并伴有抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调及促凋亡蛋白Fas表达增加。上述实验结果提示,IL-12对于急性单核细胞白血病可通过诱导肿瘤细胞向成熟巨噬细胞分化,抑制细胞增殖以及增加细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。     

BMP9对人肺腺癌A549细胞侵袭、迁移的影响及机制的研究

BMP9属于TGF-β超家族的成员,参与多种细胞的增殖、分化、凋亡、侵袭、转移过程。以人肺腺癌细胞A549作为目的细胞,采用腺病毒体外感染方式,外源性高表达BMP9。RTPCR及Western blot检测重组细胞中BMP9的表达,通过细胞划痕实验、Transwell侵袭实验检测AdBMP9细胞侵袭及迁移改变,RT-PCR及Western blot检测感染BMP9腺病毒后IL-6的mRNA和蛋白表达;Western blot检测PI3K/Akt信号通路中总Akt和磷酸化Akt蛋白的表达。结果显示:与对照组细胞相比,感染BMP9腺病毒后,A549中BMP9 mRNA和蛋白表达明显升高;实验组划痕愈合率由对照的(85.4±2.1)%与(86.5±3.4)%上升至(97.4±2.6)%(P0.05);实验组穿膜细胞数由对照的(115.5±13.1)个与(123.3±14.9)个上升至(224.3±24.6)个(P0.05);与对照组细胞相比,AdBMP9组IL-6的表达上调,磷酸化Akt蛋白表达上调。该研究表明,BMP9可能通过上调IL-6的表达,激活PI3K/Akt信号通路,促进人肺腺癌A549的侵袭、迁移。     

p~(53)基因在U 937细胞生长和分化过程中的调节作用

本文报道了p~(53)基因对人白血病细胞系U 937细胞生长和分化的调节作用。重组人GM-CSF(rhGM-CSF)可诱导U 937细胞向成熟巨噬细胞分化,这反映在分化后的细胞表达有巨噬细胞许多表型特征和功能活性。在这一分化过程中同时伴随着p~(53)基因的表达增加和U 937细胞生长受抑。进一步,用反义脱氧寡聚核苷酸抑制试验特异性地抑制p~(53)基因表达,结果发现p~(53)反义脱氧寡聚核苷酸可以明显抑制rhGM-CSF诱导U 937细胞向成熟巨噬细胞分化,同时也明显解除rhGM-CSF介导细胞分化过程中的细胞生长抑制作用。这些结果说明p~(53)基因在U 937细胞的生长和分化过程中可能起偶联调控作用。     

靶向巨核细胞的原发性骨髓纤维化分化治疗

原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)是一种由造血干细胞异常引起的骨髓增殖性疾病。20%的患者可能发展为急性巨核细胞白血病。在患者的骨髓和外周血中发现大量异常分化的巨核细胞和其前体细胞。诱导该类细胞分化能够缓解甚至治愈此疾病。巨核细胞的分化与转录因子GATA1、以及JAK2/STATs、Rho A/ROCK/MLC2、PI3K/AKT/m TOR、NF-κB等信号转导通路密切相关。本综述将讨论PMF患者的巨核细胞分化调控机制以及分化治疗研究进展。     

氟苯达唑对人急性髓系白血病HL-60细胞的增殖抑制作用研究

目的:研究氟苯达唑对人急性髓系白血病HL-60细胞增殖的抑制作用,明确氟苯达唑对HL-60细胞周期,凋亡发生的作用机制。方法:噻唑蓝法(MTT)检测氟苯达唑对人急性髓系白血病HL-60细胞的生长抑制作用,流式细胞术检测氟苯达唑对HL-60细胞周期,DNA片段化的影响,免疫印迹法检测Caspase, Raf, Bcl-2家族蛋白表达。结果:氟苯达唑抑制人急性髓系白血病HL-60细胞生长,HL-60细胞G2/M期增加,与阴性对照组相比,在一定的剂量和时间内,差别具有显著统计学意义;DNA片段化上升,0.25,0.5,1μM组与对照组相比差别具有显著统计学意义,促使Cleaved PARP,Cleaved-caspase 3,Cleaved-caspase 9蛋白表达量趋势增加;Bag-1和Bcl-2蛋白表达量降低;b-raf,c-raf磷酸化蛋白表达水平逐渐降低。结论:氟苯达唑通过诱导HL-60细胞阻滞于G2/M期,增加DNA片段化水平,激活Caspase, Raf, Bcl-2家族介导的凋亡相关通路抑制人急性髓系白血病HL-60细胞增殖,诱导人急性髓系白血病HL-60细胞发生凋亡而发挥抗肿瘤作用。     

人类白细胞介素-2与白细胞介素-7对体外诱导抗原肽SLYNTVAT特异性T淋巴细胞的影响

目的:优化人类白细胞介素-2(rh IL-2)与白细胞介素-7(rh IL-7)在体外诱导培养SLYNTVAT(SL9)抗原特异性T细胞时的用量。方法:分离健康人外周血PBMC作为效应细胞,培养T2(TAP缺陷T淋巴细胞)细胞并加载HIV来源抗原肽作为刺激细胞。SL9抗原肽四聚体检测不同细胞因子用量下特异性T细胞诱导频率大小。结论:rh IL-7在诱导SL9抗原特异性T细胞中起到关键促进作用,SL9特异性T淋巴细胞能够自身分泌大量rh IL-2,减少rh IL-2用量可为体外诱导培养SL9特异性T淋巴细胞提高效率。     

靶向HER2的CAR-T细胞构建与抗肿瘤活性的体外分析

CAR-T细胞疗法通过靶向识别肿瘤细胞表面抗原,特异性杀伤肿瘤细胞,近年来已经成为肿瘤免疫疗法的研究热点。通过基因工程方法构建靶向人类表皮生长因子受体2(HER2)的CAR慢病毒表达质粒,以磷酸钙沉淀辅助多质粒共转染HEK293T细胞包装,制备CAR慢病毒颗粒lenti-car,感染人外周血单核细胞获得HER2靶向的CAR-T细胞,并分析其对HER2阳性和阴性肿瘤细胞的特异性抑制效果。研究结果表明,构建的CAR-T细胞可被HER-2阳性的肿瘤细胞特异性激活,分泌大量炎症性细胞因子IFN-γ和IL-2。在同样效靶比等处理条件下,构建的HER2靶向CAR-T细胞对HER2阳性的人卵巢癌细胞株SK-OV-3的生长抑制率为(58.47±1.72)%,显著高于对照组(P0.05);而对HER2阴性的人慢性髓原白血病细胞株K562的生长抑制率为(11.74±2.37)%,与对照组无显著差异(P0.05)。进一步,在K562细胞中转染人HER2表达载体使其成为HER2阳性,则HER2靶向CAR-T细胞对其的生长抑制率上升为(30.41±7.59)%,较HER2阴性K562具有明显差异(P0.05)。研究结果表明,构建的HER2靶向的第二代CAR-T细胞可选择性地抑制高表达HER2蛋白的肿瘤细胞的生长,暗示了其对HER2阳性肿瘤进行细胞免疫治疗的临床应用前景。     

双氢青蒿素对人白血病细胞K562增殖及凋亡的影响

目的:研究双氢青蒿素对人白血病细胞增殖及凋亡的作用,探讨其对白血病的作用机制,为进一步研究提供依据。方法:体外培养K562细胞,用细胞计数法绘制生长曲线;流式细胞仪及荧光显微镜检测药物作用前后细胞凋亡作用;Western-blot测定药物作用前后线粒体、细胞浆细胞色素c的表达。结果:双氢青蒿素的浓度为1×10~(-4),1×10~(-5),1×10~(-6)l/L时,细胞生长受到显著抑制,并呈剂量依赖性;流式细胞仪检测出凋亡峰;Hoechst33342/PI双荧光染色可观察到明显的核浓缩、凝集等细胞凋亡表现;Western-blot检测1×10~(-5)mol/L药物处理细胞后线粒体细胞色素c表达水平下调1,细胞浆出现明显细胞色素c蛋白奈带。结论:双氢青蒿素能显著抑制人白血病细胞K562的生长,并诱导其凋亡,可能与线粒体途径有关。     

人白细胞介素29的cDNA克隆和序列分析

目的 :克隆人白细胞介素 2 9的cDNA ,以进一步研究其结构与功能的关系。方法 :分离人的外周血单个核细胞 ,IMDM(含PHA和IL-2 )培养过夜后 ,Poly(I:C)诱导 2 4～ 48h ,收集细胞 ,Trizol法提取细胞总RNA ,RT-PCR扩增出全长 603bp的IL-2 9cDNA ,将其与表达载体pPROEXTMHTa连接 ,转入大肠杆菌BL21(DE3) ,建立了hIL-29的cDNA克隆。结果 :测序表明克隆的cDNA与Genebank报道的人IL-29cDNA序列完全一致。结论在国内成功获得hIL-29的cDNA克隆 。     

人白血病抑制因子在昆虫细胞Sf9中的表达

人白血病抑制因子(hLIF)cDNA装入p2bac,受其多角蛋白启动子控制,并与野生型线性杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9。经ELISA和免疫印迹证实,该重组病毒感染Sf9 24h后(胞解液)和48h后(培养液),均可测得表达的hLIF,在72h时蛋白浓度可达每毫升(1×10~7细胞)4～10μg;经细胞活性观察表明,该蛋白可促进人白血病细胞U937分化,并使U937内信号分子STAT_3合成增加。结果表明,昆虫细胞表达的hLIF可分泌于培养液中且含量高。它的高表达、易纯化、强活性,有实用价值。     

c-myb基因启动子表观遗传修饰对该基因表达的影响

已有研究表明c-myb基因在白血病等癌症中发挥重要的作用,但是目前关于c-myb基因的调控机制尚不清楚。为了探究c-myb基因启动子区域表观修饰对该基因表达调控的作用,我们利用CRISPR-dCas9系统,在融合了p300和DNMT3A蛋白后,分别和靶向c-myb启动子的引导RNA (guide RNA, gRNA)共转染到小鼠急性髓系白血病M1细胞(mouse myeloid leukemia, M1)中,ChIP-qPCR结果显示dCas9-p300和dCas9-DNMT3A分别成功结合到c-myb基因启动子区域,并伴随有启动子区域组蛋白修饰H3K27乙酰化或DNA甲基化5-mC的显著增高。Western blotting及RT-qPCR结果表明d Cas9-p300使M1细胞中c-myb表达明显上调(p0.001),而d Cas9-DNMT3A使c-myb表达明显下调(p0.05)。进一步研究证明dCas9-p300可以对抗白细胞介素6 (interleukelin-6, IL-6)引起的c-myb基因表达下调。本研究结果证明c-myb基因启动子的表观遗传修饰可以影响该基因的表达,为研究白血病等癌症提供了新的治疗思路和方案。