ELP[I]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

【目的】使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein, ELP) ELP[I]50作为非色谱纯化标签, 分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx), 并研究聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)对ELP[I]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition, Tt)的影响。【方法】人工合成Trx基因, 将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[I]50标签下游, 转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达。融合蛋白表达后, 采用可逆相变循环(Inverse transition cycling, ITC)分离纯化, 并检测不同浓度PEG时的Tt值。【结果】成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[I]50-Trx, 检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时, Tt为28.6 °C; 而当PEG的浓度为5%、10%、15%、20%时, Tt分别降至22.3 °C、15.9 °C、6 °C、0 °C。【结论】ELP[I]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势, 而PEG能降低蛋白的Tt值, 进一步增强分离纯化效果, 扩大使用范围, 可望应用于分离纯化多种重组蛋白。     

聚乙二醇对ELP[I]40相变温度的影响

目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响.方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt.结果:在ELP[I]40终浓度为25 μmol/L时,PEG浓度为5％,10％,15％,20％,25％时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃.结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化.     

类弹性蛋白标签在重组蛋白分离纯化中的应用

类弹性蛋白(elastin-like polypeptide,ELP)是一种非常有前途的重组蛋白分离纯化标签.这种人工合成的蛋白质多肽是由五肽重复序列单元(VPGXG)串联组成,具有温度诱导的可逆相变特性.ELP与目的蛋白融合后,赋予重组蛋白相类似的可逆相变性质.多次可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)之后,就可以从蛋白溶液混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白,再经特异性酶切或者改变环境条件引发内含肽发生自我剪切去除ELP标签,从而得到单一的目的蛋白,实现简单快速分离纯化重组蛋白.目前,该技术已成功应用于原核大肠杆菌和植物表达系统中.大肠杆菌表达ELP-绿色荧光融合蛋白的最高产量可达1.6 g/L.这种非色谱分离纯化重组蛋白的方法具有技术简单、操作快速、成本低、易于扩大等优点.重点从该技术的原理、技术路线以及发展方向进行综述.     

无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定.方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21( DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定.结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95％;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的rhTrx具有生物学活性.结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据.     

硫氧还蛋白抗体柱的制备

目的:探索硫氧还蛋白(Trx)抗体柱对Trx融合蛋白纯化的可行性。方法与结果:对含有Trx基因的质粒表达载体pTrxFus进行改造,在Trx读框之后加入6×His序列,并在大肠杆菌中表达C端带有6×His标签的Trx,经Ni2+柱亲和纯化后制备多克隆抗体;把经蛋白A纯化后的抗体偶联在溴化氰活化的琼脂糖凝胶上,制成Trx抗体柱;用此抗体柱纯化与Trx融合表达的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI),SDS-PAGE结果显示获得了纯度较高的Trx-CpTI。结论:用Trx抗体制成的免疫亲和层析柱可以有效纯化Trx融合蛋白。     

硫氧还蛋白相互作用蛋白在糖尿病及其并发症中的作用

硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)又称维生素D₃上调蛋白1,因其能够与硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)结合并抑制其活性和表达而得名。本文概述了TXNIP的发现与结构,及其自身通过发挥调节糖脂代谢的作用进而影响糖尿病前期的发生发展。并在此基础上总结了TXNIP参与糖尿病发生发展的2条主要途径:TXNIP通过拮抗Trx的抗凋亡作用来激发细胞凋亡信号导致胰岛细胞凋亡;TXNIP过表达促使胰岛细胞磷酸化,进而使抑癌相关蛋白质表达增加,最终引起胰岛细胞衰老。进一步重点阐述了TXNIP在糖尿病心肌病、糖尿病肾病、糖尿病性视网膜病等糖尿病并发症中的作用:TXNIP能通过各种间接途径干预信号通路,进一步参与氧化应激、细胞凋亡、激活炎症、细胞自噬及糖脂代谢等生理生化过程。TXNIP具有极其重要的生物学功能,深入了解TXNIP在糖尿病及其并发症中的影响机制,对糖尿病及其并发症的治疗具有重要意义。最后对TXNIP的研究进行了展望,未来可进一步着手研究TXNIP基因是如何与其他基因或危险因素协同作用,进而共同参与糖尿病及其并发症的发生发展,且TXNIP单个基因甲基化尚不能全面揭示糖尿病及其并发症发生的分子机制,这些后续的深入研究,将为在糖尿病及其并发症的诊断与治疗中作为靶标分子的应用奠定基础。     

硫氧还蛋白在凋亡途径中的作用机制

硫氧还蛋白（Trx）是体内广泛存在的氧化还原蛋白,其家族中两种重要的硫氧还蛋白：硫氧还蛋白1（thioredoxin1,Trx1）和硫氧还蛋白2（thioredoxin2,Trx2）都含有保守的-Cys-Gly-Pro-Cys-还原序列。由于Trx具有调节细胞生长增殖和抗凋亡的作用,因此Trx在凋亡途径中的作用机制就成为了对抗肿瘤的研究热点。     

连接肽对融合蛋白ELP[I]_(30)-linker-eGFP相变的影响

研究G4S和Poly N连接肽对融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP相变的影响.将编码两种不同连接肽G4S和Poly N的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)基因克隆到pET28-ELP[I]30表达载体中,在宿主菌E.coli BLR(DE3)中经IPTG诱导表达ELP[I]30-linker-eGFP,通过可逆相变循环(inverse transition cycling,ITC)及镍柱亲和层析纯化ELP[I]30-linker-eGFP蛋白.结果显示,成功构建、表达具有活性的两种连接肽的融合蛋白ELP[I]30-linker-eGFP,连接肽G4S使融合蛋白产生不可逆相变,而Poly N不影响融合蛋白可逆相变,该研究对类弹性蛋白标签的应用具有指导意义.     

人硫氧还蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对内毒素血症小鼠的保护作用

为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现 ,TRX蛋白可明显促进去细胞因子诱导的NFS 6 0细胞增殖和撤血清后MCF 7细胞的增殖 ,并发现外源性TRX可明显对小鼠内毒素血症起保护作用 .     

酵母菌类金属硫蛋白的分离、纯化及性质鉴定

经过对酵母菌的金属抗性试验和培养条件试验,确定了高产类金属硫蛋白的酿酒酵母菌株Cu-21(Saccharomyces cerevisiae Cu-21)及其最佳培养条件。对该菌株的菌体蛋白进行SephadexG-100、DEAE－52结合的两次柱分离纯化,获得了类金属硫蛋白的三个亚型,蛋白性质鉴定结果表明含三个亚型、分子量小、富含半脱氨酸和金属元素,具有典型的巯基吸收特性。     

应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达

为了观察硫氧还蛋白（ＴｒｘＡ）促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用,我们从质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）上克隆了ｔｒｘＡ基因,构建了ＴｒｘＡ表达质粒ｐＴ－ＴｒｘＡ。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化Ｅ．ｃｏｌｉ并同时获得表达。结果表明,共表达ＴｒｘＡ可以明显促进外源蛋白,如甲状旁腺激素相关蛋白（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨｒＰ受体（ＰＴＨｒＰ－Ｒ）的血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的可溶性表达。说明共表达     

酵母菌类金属硫蛋白的分离、纯化及性质鉴定

经过对酵母菌的金属抗性试验和培养条件试验,确定了高产类金属硫蛋白的酿酒酵母菌株Cu-21（Saccharomyces cerevisiae Cu-21）及其最佳培养条件。对该菌株的菌体蛋白进行SephadexG-100、DEAE-52结合的两次柱分离纯化,获得了类金属硫蛋白的三个亚型,蛋白性质鉴定结果表明含三个亚型、分子量小、富含半胱氨酸和金属元素,具有典型的巯基吸收特性。     

硫氧还蛋白的结构及在生物抗氧化中的功能

硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)是广泛存在于原核与真核生物体内的氧化还原调节蛋白。Trx通过对目标蛋白质进行还原,从而调节机体的氧化还原平衡。Trx与硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)及NADPH共同组成硫氧还蛋白系统参与众多生理过程。细胞中的活性氧是导致生物氧化胁迫的一个主要方面。Trx可以通过对细胞内被氧化的二硫键的还原来修复机体的氧化损伤,并通过这种方式防止机体衰老。同时,Trx系统可以与其它氧化还原系统如谷胱甘肽(GSH)系统协调配合,并消除体内过多的活性氧。     

NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶C在植物质体中的作用

硫氧还蛋白的氧化还原调节作用在生物界中普遍存在。它能够还原目标蛋白的二硫键,而自身的活性位点则被氧化。因此,对于新的催化循环,则需要由相应的还原酶将其再次还原成活性形式。硫氧还蛋白对维持高等植物的光合效率同样具有重要意义。叶绿体中的硫氧还蛋白分别由铁氧还蛋白依赖性硫氧还蛋白还原酶和NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶C(NTRC)两种酶还原。NTRC的本质是一种黄素蛋白,除了具有还原酶活性外,还整合了一个硫氧还蛋白结构域,在叶绿体和淀粉体的氧化还原调节中处于核心地位。这种特殊的双功能酶在卡尔文-本森循环、氧化戊糖磷酸途径、抗过氧化、四吡咯代谢、ATP和淀粉合成、生长素和光周期调控中扮演了多重角色。本综述总结了NTRC的生理功能,并讨论了该蛋白质对植物质体氧化还原稳态的调节机制。     

酵母菌类金属硫蛋白的分离、纯化及性质鉴定*

经过对酵母菌的金属抗性试验和培养条件试验,确定了高产类金属硫蛋白的酿酒酵母菌株Cu-21（Saccharomyces cerevisiae Cu-21）及其最佳培养条件。对该菌株的菌体蛋白进行SephadexG-100、DEAE-52结合的两次柱分离纯化,获得了类金属硫蛋白的三个亚型,蛋白性质鉴定结果表明含三个亚型、分子量小、富含半胱氨酸和金属元素,具有典型的巯基吸收特性。     

重组人硫氧还蛋白工程菌生物学特性稳定性的检测

[目的]观察和检测重组人硫氧还蛋白工程菌BL21/pET-22b(+)-rhTrx生物学特性的稳定性.[方法]工程菌连续传代50代,通过对每10代进行质粒性状、蛋白表达水平、透射电镜观察、革兰氏染色及各项生化检查,全面检测工程菌可能影响生产性能的生物学特性稳定性.[结果]各代工程菌提取的质粒经双酶切后均可见315 bp的目的基因片段;各代工程菌中Trx蛋白的表达量均为菌体总蛋白的20％左右;透射电镜观察呈现典型的大肠杆菌特性;革兰染色显示为阴性杆菌;各项生化检测结果与原始菌种无显著差异.[结论]该菌种生物学特性稳定,可作为生产用菌种.     

亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His6-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。     

硫氧还蛋白结合蛋白-2在糖和脂代谢中的作用

硫氧还蛋白结合蛋白-2(thioredoxin binding protein-2,TBP-2)属于硫氧还蛋白结合蛋白家族成员,与还原型硫氧还蛋白结合,抑制其还原活性。在生物体内,TBP-2不但参与细胞内的氧化还原调节,还具有调节细胞生长繁殖和促进细胞凋亡的作用。TBP-2在葡萄糖和脂肪代谢中的作用被广泛研究。TBP-2高表达时,胰岛细胞凋亡,与糖尿病发生相关;而TBP-2缺失,与高脂血症发病有关。本文综述了TBP-2在糖脂代谢中的作用。     

硫氧还蛋白系统在COPD抗氧化中的作用研究进展

硫氧还蛋白系统是由硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)、硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,TrxR)和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)组成的多功能小分子蛋白系统,广泛表达的硫氧还蛋白作为蛋白质二硫键的还原酶,它参与很多生理过程,并发挥重要生物学功能,包括调节机体的氧化还原反应、抑制细胞凋亡、调节转录因子DNA结合活性以及免疫应答等,其中一重要作用是参与调节细胞氧化还原状态以对抗氧化应激。因此在一些炎症性疾病如慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫综合征、肺间质疾病、哮喘、肺结节病等的发生发展中扮演重要角色,本文对硫氧还蛋白系统在慢性阻塞性肺疾病中的抗氧化作用作一综述。     

硫氧还蛋白系统在COPD抗氧化中的作用研究进展

硫氧还蛋白系统是由硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）,硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductase,TrxR）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH）组成的多功能小分子蛋白系统,广泛表达的硫氧还蛋白作为蛋白质二硫键的还原酶,它参与很多生理过程,并发挥重要生物学功能,包括调节机体的氧化还原反应、抑制细胞凋亡、调节转录因子DNA结合活性以及免疫应答等,其中一重要作用是参与调节细胞氧化还原状态以对抗氧化应激。因此在一些炎症性疾病如慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫综合征、肺间质疾病、哮喘、肺结节病等的发生发展中扮演重要角色,本文对硫氧还蛋白系统在慢性阻塞性肺疾病中的抗氧化作用作一综述。