人胚胎干细胞在3种培养体系中的生长

人胚胎干细胞(human embryonic stem cells.hESCs)的培养一直是干细胞研究的重要内容.用本实验室独立建系的两株hESCs,建立3种不同的培养体系:小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)做饲养层,永生化人成纤维细胞(immortalized human adult fibroblasts,HAFi)做饲养层,无饲养层条件培养基培养体系(condition medium,CM),观察在3种培养体系中,干细胞的增殖和分化情况.发现3种培养体系中的hESCs都可以表达一致的生物学特性,但也有不同之处,相对于CM干细胞在MEFs和HAFi饲养层体系的分化率低,增殖快;但MEFs来源于鼠类是异源细胞,HAFi虽不舍鼠源性成分却繁殖很慢;无饲养层的体系便于操作,无外源细胞存在.实验所得出的结果可以引导研究人员针对于临床、科研不同的需要,选择最适合的培养体系.     

人胚胎干细胞培养建系及其应用

简要概述了自1998年首次建立hES细胞系以来近6－7年国内外的现况、分离培养建系、鉴定标准和冻存技术发展、定向诱导分化及其应用等方面的研究进展。     

人胚胎干细胞建系的研究现状与存在的问题

人胚胎干细胞系的建立,对人类胚胎发生和人类发育生物学研究、人类新基因的发现和功能研究以及基因治疗、细胞和组织的移植治疗等领域的突破性进展具有重大意义;回顾了人胚胎干细胞建系研究的历程,就建系的几种方案、路线、意义和可行性进行了探讨;详细系统地说明了迄今为止建立人胚胎干细胞系所需要的饲养层类型、培养基组成、添加细胞因子种类及其作用;分析了建立和维持人胚胎干细胞系所需消化酶的种类及其作用以及目前常用的几种传代方法;从若干方面总结了人胚胎干细胞系的鉴定方法,并对建立和维持人胚胎干细胞系中存在的若干问题进行了剖析,提出了目前急待解决的问题。     

人类胚胎干细胞系H9培养和分化中细胞异质性的发现

目的:在人类胚胎干细胞系H9培养和分化过程中探讨该细胞系的异质性。方法:对人类胚胎干细胞系H9进行体外未分化培养和诱导分化,鉴定其多潜能性和分化状态;在诱导其向拟胚体细胞的分化过程中,检测多潜能相关基因及分化特异基因的表达情况。结果:发现多潜能相关基因(Oct4、SOX2和Nanog)和种系特异性基因(Cdx2、Bachurary、SOX1、Fgf5和AFP)并不限于分别在未分化细胞和分化细胞中表达。结论:提示H9细胞系在培养过程中的非基因异质性现象,为进一步认识胚胎干细胞的自我更新和多潜能性提供了有意义的参考。     

人胚胎干细胞培养体系的研究进展

人胚胎干细胞具有广泛的研究前景,建立一个理想的人胚胎干细胞培养系统是利用它的前提.较详细地对目前关于人胚胎干细胞培养体系的研究进展、一些细胞因子对人胚胎干细胞的作用和影响以及体外长期培养对人胚胎干细胞核型的影响进行了综述.     

人孤雌胚胎干细胞在人包皮成纤维细胞饲养层上的生长状态

人孤雌胚胎干细胞(human parthenogenetic embryonic stem cells,hPESCs)体外培养常需饲养层的支持以保持干细胞特性.通过原代培养获得人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblasts,hFFs)并将其制备成饲养层,使hPESCs在hFFs上进行体外培养及传代.倒置显微镜下观察hPESCs的生长状态,采用碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)检测、核型分析和体内分化实验研究hPESCs的生物学特性及分化潜能,以探索hFFs能否长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.经原代培养成功获得了hFFs,通过形态学观察和免疫细胞化学染色鉴定符合成纤维细胞的生物学特性;在hFFs上生长的hPESCs克隆形态规则,不易分化;已成功在体外培养20余代,hPESCs仍能够保持基本生物学特性和正常核型,在裸鼠体内可形成含有3个胚层组织成分的畸胎瘤.作为人源性饲养层,hFFs可长期支持hPESCs的生长并维持其未分化状态.     

Human neural progenitor cells derived from embryonic stem cells in feeder-free cultures

Derivation of human neural progenitors (hNP) from human embryonic stem (hES) cells in culture has been reported with the use of feeder cells or conditioned media. This introduces undefined components into the system, limiting the ability to precisely investigate the requirement for factors that control the process. Also, the use of feeder cells of non-human origin introduces the potential for zoonotic transmission, limiting its clinical usefulness. Here we report a feeder-free system to produce hNP from hES cells and test the effects of various media components involved in the process. Five protocols using defined media components were compared for efficiency of hNP generation. Based on this analysis, we discuss the role of basic fibroblast growth factor (FGF2), N2 supplement, non-essential amino acids (NEAA), and knock-out serum replacement (KSR) on the process of hNP generation. All protocols led to down-regulation of Oct4/POU5F1 expression (from 90.5% to <3%), and up-regulation of neural progenitor markers to varying degrees. Media with N2 but not KSR and NEAA produced cultures with significantly higher (p<0.05) expression of the neural progenitor marker Musashi 1 (MSI1). Approximately 89% of these cells were Nestin (NES)+ after 3 weeks, but they did not proliferate. In contrast, differentiation media supplemented with KSR and NEAA produced fewer NES+ (75%) cells, but these cells were proliferative, and by five passages the culture consisted of >97% NES+ cells. This suggests that KSR and NEAA supplements did not enhance early differentiation but did promote proliferating of hNP cell cultures. This resulted in an efficient, robust, repeatable differentiation system suitable for generating large populations of hNP cells. This will facilitate further study of molecular and biochemical mechanisms in early human neural differentiation and potentially produce uniform neuronal cells for therapeutic uses without concern of zoonotic transmission from feeder layers.     

从植入前遗传学诊断异常的胚胎中分离人胚胎干细胞系

在体外受精过程中,通过胚胎植入前遗传性诊断（PGD）对有遗传风险患者的胚胎进行植入前活检和遗传学分析,选择无遗传性疾病的胚胎植入子宫,而PGD诊断异常的胚胎则会被丢弃。本研究尝试将PGD异常胚胎用于分离人胚胎干细胞,以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系。利用荧光原位杂交技术对第3-5天胚胎进行PGD检测,结果异常的胚胎进一步用于分离获取胚胎干细胞系,然后对h ES细胞系进行核型及干细胞表面标记、多能性基因表达、端粒酶活性以及分化能力等特征性鉴定。总共从13个PGD异常胚胎中分离获得8个人胚胎干细胞系,建系效率为61.5%,其中1个核型正常,5个核型异常。说明利用PGD异常胚胎可以获得携带遗传缺陷的人胚胎干细胞系,不仅为评估PGD技术临床结论的准确性提供了一种新方法,更重要的是为研究各种遗传性疾病的发病机理提供了有效的细胞模型。     

不同人胚胎干细胞系向限定性内胚层分化能力存在差异

研究不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力是否存在差异,并尝试寻找造成差异的原因.基于已建立的人胚胎干细胞库资源和限定性内胚层定向诱导分化体系,流式检测诱导分化3天后10株细胞系Sox17的阳性比率发现其值在60%到80%之间波动,而SSEA4的阳性比率在人胚胎干细胞系中不存在明显差异.基因表达谱结果显示像Sox17,Foxa2等内胚层标记在这些细胞之间不存在显著的差异,而像MEG3和SNORD114-3在差异细胞系之间和同株细胞早晚期代数之间存在表达差异.结果提示不同的人胚胎干细胞系向限定性内胚层细胞分化能力存在着差异,推测这些差异可能与MEG3和SNORD114-3的差异表达相关.     

一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法

目的 :利用Fugene 6基因转染试剂建立一种简便高效的人胚胎干细胞转染方法 ,并建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白 (enhancedgreenfluorescentprotein ,EGFP)报告基因的人胚胎干细胞系 ,为人胚胎干细胞研究提供一个非常有用的细胞模型。方法 :通过Fugene 6基因转染试剂成功地将EGFP基因转入无饲养层培养的人胚胎干细胞中 ,嘌呤霉素筛选得到稳定表达EGFP的克隆 ;利用倒置荧光显微镜和流式细胞仪检测EGFP在人胚胎干细胞中的表达情况。结果 :EGFP瞬时转染效率为 30 %～ 40 % ,稳定转染效率约 1/10^4～5,且稳定转染的人胚胎干细胞均表达EGFP。结论 :Fugene 6是一种良好的基因转染试剂 ,它可以有效地将外源基因转入人胚胎干细胞中 ,为人胚胎干细胞的转基因研究提供新的实验手段。     

无饲养层培养人胚胎干细胞方法的建立

人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hES细胞)是当前医学研究的热点之一．然而hES细胞培养条件苛刻,通常需要采用鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEFs)饲养层来维持其未分化状态,成为目前hES细胞研究的瓶颈之一、本实验成功地将hES细胞接种在细胞外基质包被的六孔板上培养,传代20次后细胞仍然保持良好的未分化状态,各种hES细胞生物学特性(如表面标志物SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-8l,OCT-4,碱性磷酸酶及体内外分化潜能等)均无改变;其冻存、复苏效果与生长在饲养层上的hES细胞无明显差异．因此,该无饲养层培养体系可以用于培养hES细胞,并为hES细胞转基因研究及大规模培养打下良好的基础．     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．     

一种新的人胚胎干细胞无饲养层培养方法的建立

目的:以转染碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞株(FLSC)培养人胚胎干细胞(hESC),寻找更加安全、有效的体外培养扩增方法。方法:通过ELISA方法定量检测转基因的人FLSC条件培养基中bFGF的分泌量;以商业化的mTeSR1无血清无饲养层培养基、常规小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基,以及转染bFGF的人FLSC条件培养基(bFGF/FLSC-CM)分别培养扩增H9细胞。通过观察hESC形态、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR,检测hESC全能性标志物的表达。结果:ELISA方法检测bFGF/FLSC-CM中bFGF因子的分泌量为(770.09±17.28)pg/mL,而MEF-CM中bFGF因子的分泌量为(55.59±0.61)pg/mL,两者存在显著差异(P0.01);在3种培养体系下,免疫荧光检测hESC全能性标志Oct-4、Tra-1-81抗体的表达均呈阳性,流式检测细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)抗体阳性细胞的比例均在99%左右;RT-PCR检测到hESC特异的转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的表达。结论:以转染bFGF的人FLSC条件培养基可以有效扩增hESC,可为临床应用提供一种安全、高效、低成本的无饲养层培养方法。     

人胚胎干细胞和分化细胞差别基因的筛选

人类胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)在增殖过程中如何保持未分化状态是干细胞生物学的核心问题之一,已有的LIF通路、Oct-4因子及Nanog基因的作用还不能对这一问题做出全面的解释。为进一步了解维持hESC未分化状态的机制,采用自行建立培养的hESC及分化的hESC细胞克隆(differentiated hESC,dhESC),应用抑制消减杂交(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)结合反向cDNA斑点杂交技术,筛选出在hESC高表达、在dhESC中低表达或不表达的表达序列标签(Expressed Sequence Tag,EST)共105个。通过与GenBank比较,显示其中76个EST代表61个已知基因,18个EST代表15个假想基因,另有11个属于未知EST。选取其中8个克隆进行半定量RT-PCR分析,证实其中7个克隆在hESC中高表达,在dhESC中低表达或不表达。结果表明,hESC分化前后涉及多个基因的差异表达,对这些在hESC中高表达、在dhESC中低表达或不表达基因的进一步功能研究为阐明维持hESC未分化状态的机制提供了基础。     

MicroRNAs与胚胎干细胞研究

MicroRNAs(miRNAs)是一种大小约20～25个碱基的非编码小分子RNA,一般通过特异性抑制靶蛋白翻译或降解靶基因mRNA发挥负调控基因表达的作用.胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)是从植入前早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞中分离得到并能在体外长期培养的高度未分化的多能细胞系,在揭示胚胎早期发育机理、药物筛选、临床再生医学等领域具有广泛的应用前景.最近研究发现miRNAs在ES细胞自我更新和分化过程中均发挥着重要的调控作用,但具体调控机制尚未完全阐明.进一步深入研究miRNAs在ES细胞中的作用,全面了解ES细胞自我更新和定向分化的机制是实现ES细胞广阔临床应用前景的基础.     

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production,Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.     

胚胎干细胞移植治疗糖尿病的研究进展

糖尿病是一种严重的免疫缺陷性疾病,目前的治疗方法很难从根本上治愈。近年来的研究表明,通过诱导胚胎干细胞定向分化为胰岛β细胞,并进行移植治疗糖尿病,是一种有希望的根治方案。本文就利用胚胎干细胞移植治疗糖尿病的最新进展作一综述。     

定向诱导小鼠ES细胞向心肌细胞的分化

为了提高体外诱导ES细胞向心肌细胞分化的效率 ,对以往的诱导方法加以改进 ,采用直接悬浮培养和 0 8%DMSO诱导 ,建立了简便、高效的定向诱导ES细胞向心肌细胞分化的体系 .诱导第 9d起可见自发性、有节律跳动的类胚体出现 ,第 14d达到高峰 ,约有 70 %的拟胚体产生跳动 .用RT PCR的方法在跳动的拟胚体中检测到心肌细胞特异性标志物的表达 ,采用免疫荧光染色的方法在蛋白水平检测到心肌特异的α辅肌动蛋白 (α actinin)的表达 ,并可见清晰肌小节 ,表明在改进的体外诱导条件下ES细胞可分化为成熟的心肌细胞 .     

胚胎干细胞起源的探讨

目前胚胎干细胞(ESCs)建系的取材来源包括桑椹胚的卵裂球、囊胚的内细胞团(ICM)、上胚层细胞和原始生殖细胞(PGCs),甚至从新生鼠睾丸细胞也分离得到类ES样细胞系。这就提出了一个问题,什么是ESCs最接近的体内细胞来源。传统观念常常把ESCs等同于ICM细胞,也有学者认为ESCs更象上胚层细胞,而在已知的分子标记基因方面,ESCs所具有的特征更接近体内早期生殖细胞。不清楚ESCs最接近的体内细胞来源,可能是制约许多品系小鼠和大多哺乳类动物建系成功率提高的原因之一。ESCs系与EG细胞系的分离条件不同表明,加强对ESCs多能性维持基因调控研究具有重要意义。本文从ESCs的经典概念及其发展,早期胚胎细胞和生殖细胞发育规律,早期胚胎细胞、早期生殖细胞和ESCs的关系等方面进行综合分析,认为ESCs可能有多种接近的体内细胞来源。进一步应通过对ESCs建系不同的取材细胞和不同品系的ESCs间进行比较研究,以便弄清ESCs的来源和转化机制,为提高不同物种ESCs建系效率提供理论支持。