滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析

旨在克隆滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因GrDXS,并进行表达分析。以滇龙胆转录组为基础,采用RTPCR技术从滇龙胆幼叶克隆GrDXS基因,并进行原核表达和组织特异性表达分析。滇龙胆GrDXS基因(登录号:KJ624995)全长2145bp,编码714个氨基酸;GrDXS蛋白相对分子质量76.75kD,pI为6.93;属于DXS家族成员,可能定位于叶绿体;主要由α-螺旋和无规则卷曲构成;具有DXS蛋白的4类保守结构域:焦磷酸硫胺素结合折叠域(IPR029061,69-425、366-555、87-268、315-407、407-558)、类转酮酶嘧啶结合结构域(IPR005475,394-559、394-555)、转酮酶C端/丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结构域II(IPR009014,568-704,572-704)、转酮酶C端结构域(IPR005476,573-696)和1个转酮酶结合位点(IPR020826,500-516);与长春花CrDXS蛋白亲缘关系最近;GrDXS基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为100kD,与预期蛋白大小一致;GrDXS基因主要在叶中表达。     

茶树1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因CsDXS1的克隆与表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是MEP萜类合成途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成过程中发挥重要的作用。以福鼎大白茶为实验材料,在课题组前期转录组数据的基础上,运用RT-PCR技术克隆了茶树Cs DXS1基因的完整开放阅读框(ORF)。该ORF长度为2 154 bp,编码717个氨基酸。生物信息学分析结果表明,茶树Cs DXS1蛋白与其他植物的同源蛋白相似性高达85%-90%,属于DXS基因家族的I类基因,该蛋白是不稳定的亲水蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,有15个可信度高的磷酸化位点,具有典型的转酮醇酶亚家族功能域。利用实时荧光定量PCR对Cs DXS1基因在茶树不同组织和不同激素处理下的表达谱进行检测,结果显示:不同组织中,Cs DXS1基因的表达水平在第三叶中最高,嫩叶中的表达量显著高于茎和老叶,表达水平从高到低依次为第三叶第四叶第二叶第一叶嫩茎老茎老叶。在不同激素处理中,Cs DXS1的表达量受到不同程度的诱导,且表达量峰值的出现时间存在差异。Cs DXS1在IAA和ABA激素处理下的表达量峰值最高(4 h),均为对照的1.5倍,在Me JA处理下表达量峰值最低(24 h),仅为对照的1.1倍。     

冬凌草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆与表达分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,DXS)是植物萜类代谢通路中2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的第一个关键酶,在植物萜类物质的生物合成中发挥重要的作用.为了研究该基因在冬凌草二萜类成分合成中的作用,该研究在冬凌草转录组测序结果的基础上设计一对特异性引物,采用RT-PCR方法得到冬凌草IrDXS基因cDNA全长序列,并对其蛋白进行理化性质分析、信号肽预测、亚细胞定位预测、蛋白质二级结构、三级结构预测分析及跨膜域分析等生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR的方法检测IrDXS基因在冬凌草不同部位中的表达情况.结果表明:从冬凌草叶片中分离得到了一条编码DXS的全长基因,通过生物信息学软件分析发现,该基因编码全长2169 bp,编码722个氨基酸,分子量为77.7 kD.多序列比对发现该基因编码的蛋白和其他植物中已知的DXS蛋白序列具有较高的同源性,N端均包含了一段质体转运肽序列,并均具有一个保守的焦磷酸硫胺素结构域和与吡啶结合相关的DRAG结构域.序列进化树分析显示,IrDXS基因属于植物DXS2家族.DXS基因在冬凌草根中表达量最高、愈伤组织中最低.该研究首次获得了IrDXS基因的全长cDNA序列,并揭示了其在不同组织中的表达差异,为后续的深入研究IrDXS基因在冬凌草二萜类成分合成途径中的功能奠定了基础.     

1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)及其编码基因

萜类物质是广泛分布于生物界的一类天然产物,也是重要生命物质。萜类物质通过甲羟戊酸(MVA)途径和2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成,古细菌、真菌和动物及人的萜类物质主要通过MVA途径合成,而多数真细菌(即通常而言的细菌)则利用MEP途径。植物同时拥有两种途径但分别定位于细胞质和质体。1-脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)是MEP途径的第一个酶,也是该途径的关键调控位点。现从DXS在MEP途径中的作用、DXS结构、亚细胞定位和酶活性、编码基因及突变体等方面对DXS进行全面阐述。拟南芥DXS基因插入突变体cla1-1发生白化,DXS基因表达与类胡萝卜素等萜类物质积累密切相关,在转基因生物体中过度表达DXS可促进萜类物质合成。植物DXS具有典型的质体转运肽序列,决定了DXS的质体定位。完备的DXS活性分析体系为DXS抑制剂开发筛选等研究奠定良好基础。DXS由一至多个基因编码,随生物种类而异,根据同源性,植物DXS基因可分成两类。DXS基因家族不同成员具有不同的表达模式,但通常有一个成员在多种组织中广泛表达。     

香鳞毛蕨 1 脱氧 D 木酮糖 5 磷酸合酶基因的克隆及表达分析

1 脱氧 D 木酮糖 5 磷酸合酶(DXS)是甲基 D 赤藓醇 4 磷酸(MEP)途径中控制影响植物萜类化合物合成的第一个限速酶。该研究对香鳞毛蕨(Dryopteris fragrans)DfDXS基因进行序列特征及生物信息学分析,并通过qRT PCR技术分析其在外源激素、干旱、盐胁迫、高温及低温处理下的表达模式,旨在探究DfDXS基因在香鳞毛蕨萜类生物合成及抗逆机制中的作用,为进一步解析香鳞毛蕨抗逆分子机制奠定基础。结果显示：(1) DfDXS1基因全长2 139 bp,编码712个氨基酸,而DfDXS2全长2 160 bp,编码719个氨基酸;结构域分析显示,其具有典型的转酮醇酶保守域,包含焦磷酸硫胺素结合位点和转酮醇酶结构域;DfDXS氨基酸序列与江南卷柏(Selaginella moellendorffii)和银杏(Ginkgo biloba)的DXS等关系较近。(2)水杨酸(SA)处理下,DfDXS基因的相对表达量先升高后降低;脱落酸(ABA)抑制DfDXS的表达;DfDXS1/2在茉莉酸甲酯(MeJA)处理下相对表达水平均显著高于对照;乙烯利(Eth)抑制DfDXS的表达,但DfDXS1处理3 h时表达水平显著高于对照。(3)聚乙二醇(PEG)、高温和低温均诱导DfDXS1上调表达。研究推测,香鳞毛蕨DXS基因在萜类物质合成与逆境胁迫机制中发挥着重要的作用。     

滇牡丹1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因的克隆及功能分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS),作为MEP途径的第一个关键酶,在植物萜类合成中起着重要作用。为了克隆得到滇牡丹DXS基因,我们根据滇牡丹根皮转录组数据分析结果,首先获得滇牡丹DXS基因片段。之后根据获得的该片段设计特异引物,再利用RACE和RT-PCR技术从滇牡丹根皮中获得完整的DXS基因(Pd DXS)。Pd DXS基因全长为3 137 bp,全长基因中含有一个长度为2 151 bp的开放阅读框(ORF),该开放阅读框编码了717个氨基酸,根据开放阅读框序列推导所得蛋白序列绘制分子进化树,分子进化树将该基因推断所得蛋白与葡萄DXS蛋白聚为一类,因此,两者的DXS蛋白有较高相似性。经过氨基酸序列比对后,推断滇牡丹DXS具有叶绿体转运肽,二磷酸硫胺结合位点以及转酮醇酶结构域。半定量RT-PCR结果显示Pd DXS在根、茎、叶、花芽及花瓣中均有表达。本研究为确定滇牡丹中DXS的基因功能以及揭示滇牡丹中萜类化合物的生物合成提供了理论基础。     

植物萜类合成酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的分子结构特征与功能预测分析

采用生物信息学的方法和工具对已在GenBank上注册的拟南芥、玉米、岩蔷薇、水稻、黄花蒿、亚麻等植物的萜类合成酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的核酸及氨基酸序列进行分析,并对其组成成分、转运肽、跨膜拓朴结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二级及三级结构、分子系统进化关系等进行预测和推断。结果表明：该类酶基因的全长包括5′、3′非翻译区和一个开放阅读框,无跨膜结构域,是一个具转运肽的亲水性蛋白,包括两个功能DXR结合motif及两个功能NADPH结合motif,α-螺旋和不规则卷曲是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和β-折叠散布于整个蛋白质中,蛋白质的功能域在空间结构上折叠成“V”形,“V”形的两臂由N-端与C-端构成,“V”形的底部,是N 端臂与C-端臂的结合域。     

低温胁迫下草菇甘油‐3‐磷酸酰基转移酶基因表达变化的研究

以草菇低温敏感型V23菌株与耐低温型VH3菌株为试验材料,将二者菌丝体置于冰浴中进行不同时间的低温胁迫处理。首先提取RNA,反转录为cDNA,然后构建含有微管蛋白(tubulin,TUB)基因片段和甘油‐3‐磷酸酰基转移酶(glycerol‐3‐phosphate acyltransferase,GPAT)基因片段的质粒,最终对GPAT基因在低温胁迫不同处理时间下的表达进行定量。结果表明,耐低温型的VH3菌株,在低温处理2h时,GPAT基因相对表达量上升,4h,表达量下降,6h上升,之后逐渐下降。低温敏感型V23菌株,在低温处理2h时,表达量下降,4h,表达量上升,此后逐渐下降;除低温处理4h外,V23菌株的GPAT基因表达量始终低于VH3菌株,初步推测GPAT基因的高表达与草菇的耐低温能力相关。     

盐胁迫诱导盐穗木Rev1、Rev3基因的表达分析

根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,参考盐穗木HcRev1、HcRev3基因的ESTs序列设计荧光定量PCR特异性引物,建立检测盐穗木Revs基因相对表达量的荧光定量PCR方法,分析Rev1和Rev3基因在盐穗木不同浓度盐胁迫处理不同时间的转录水平。结果表明,HcRev1、HcRev3基因具有相似的表达模式,在100 mmol·L^-1 NaCl低盐胁迫下表达稳定,在300、500、700 mmol·L^-1 NaCl胁迫下,随胁迫浓度增高、胁迫时间延长,表达量升高。其中HcRev1在700 mmol·L^-1 NaCl胁迫14 d后达到峰值,是对照组的4.63倍。HcRev3基因在300 mmol·L^-1 NaCl胁迫14 d时,表达量迅速升高,是对照组的15.55倍,表达差异极显著。研究结果说明HcRev1、HcRev3基因都受盐胁迫诱导表达,提示HcRev1、HcRev3基因虽然表达量存在差异,但在盐胁迫过程中参与了DNA损伤修复。研究有助于阐明Rev1、Rev3基因在DNA损伤修复和植物耐盐性间的调控功能作用。     

25-O-乙酰升麻醇-3-0-β-D-木糖苷对HepG2细胞基因表达的影响

研究环菠萝蜜烷三萜化合物25-0-乙酰升麻醇-3-0-β-D-木糖苷对肿瘤细胞HepG2基因表达的影响,探讨其细胞毒作用机制。利用人低密度cDNA microarray研究细胞基因表达的改变,发现9个表达改变基因,6个下调,3个上调。结论表明25—O-乙酰升麻醇-3—0-β-D-木糖苷对HepG2细胞的细胞毒性与MAPK等信号传导途径相关。     

决明GRAS基因家族全基因组鉴定及其在盐和干旱胁迫条件下的表达分析

目的: 基于决明(Senna tora L.)全基因组数据,对GRAS家族成员、理化性质、基因结构、进化关系以及胁迫条件下的表达模式进行鉴定和分析。方法: 将决明基因组蛋白数据与拟南芥GRAS成员进行比对,分别利用TBtools、MEGA-X、CLUSTALW、MEME等生物信息学软件和工具,对决明GRAS基因家族成员进行分析。利用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)检测干旱和盐胁迫条件下决明根中GRAS基因的表达情况。结果: 50个StGRAS分为9个亚家族,不均等地分布在13条染色体上。结构分析表明,StGRAS34和StGRAS12分别与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)结瘤信号蛋白NSP1和NSP2高度同源。StGRAS的启动子区域多含有与胁迫响应、激素调节等相关的响应元件。qRT-PCR结果表明,在盐胁迫条件下,StGRAS表达具有明显差异;在干旱胁迫条件下,绝大多数检测基因能够快速响应,表达显著升高;两种胁迫条件下,StGRAS28和StGRAS29表达趋势互补,具有协同调控关系。结论: GRAS基因家族能够广泛参与胁迫响应,其中StGRAS28与StGRAS29可能共同参与介导决明根的盐与干旱胁迫应答,StGRAS34和StGRAS12分别作为决明共生结瘤的NSP1和NSP2,可能与增强结瘤因子信号诱导相关,这为进一步挖掘和研究GRAS基因在决明响应胁迫和共生固氮过程所发挥的作用提供了基础。     

不同花期‘西伯利亚’百合花瓣单萜合成途径转录组分析（英文）

以‘西伯利亚’百合(Lilium‘Siberia’)花蕾期、半开期、盛开期、衰败期的花瓣为材料,利用RNA-seq技术对其转录组进行高通量测序,分析单萜合成途径中差异表达的基因并阐明其分子机制。结果显示,‘西伯利亚’百合通过转录组测序分析共得到56.28 Gb clean base,223.40 Mb clean reads和124 233个unigene,其中35 749个基因得到注释。萜骨架合成途径中的基因表达水平在不同花期表现出显著差异。其中,甲基赤藓糖醇磷酸(MEP)中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、4-羟基-3-甲丁-2-烯基二磷酸合成酶(HDS)、4-羟基-3-甲丁-2烯基二磷酸还原酶(HDR)、牻牛儿基二磷酸合成酶(GPS)基因的表达水平随花期变化呈先升高后降低的趋势。罗勒烯合成酶(OCS)基因表现出相似变化规律,在盛开期表达量最高。甲羟戊酸(MVA)途径中的3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)的基因表达同样出现先升高后降低的趋势。单萜合成下游的分支途径中,茄尼基二磷酸合成酶(SDS)、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合成酶(GGDR)基因的表达则出现相反的趋势,在盛开期的表达量最低。研究结果表明MEP途径中的关键基因可随花期变化规律性的表达,以调控单萜的生物合成,在盛开期有较高释放量,且盛开期MVA途径的活化以及泛醌和萜醌代谢支路基因的低表达也促进了单萜的生物合成。     

Physiological and ecological responses to drought and heat stresses in Osmanthus fragrans ‘Boyejingui’

为了探讨植物对干旱、高温及协同胁迫的响应, 该研究以木犀(Osmanthus fragrans) ‘波叶金桂’为材料, 采用盆栽质量控水法模拟干旱胁迫(对照、轻度、中度和重度)和高温胁迫, 利用动态顶空气体循环吸附法和热脱附-气相色谱-质谱(TDS-GC-MS)联用技术对其挥发性有机化合物(VOCs)进行测定; 同时测定其非结构性碳(NSC)含量及次生代谢酶活性。结果表明: 干旱胁迫对‘波叶金桂’叶片NSC组分含量影响不显著; 可溶性糖和淀粉含量在高温胁迫下显著降低, 在协同胁迫后持续性下降, 重度协同胁迫下, 葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉分别比对照降低47.7%、46.4%、34.4%和38.2%。干旱胁迫和协同胁迫下3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶(DXR)活性表现出先上升后下降, 而脂氧合酶(LOX)活性表现出持续性上升趋势; 高温胁迫后, HMGR、DXR和LOX活性显著高于对照。干旱胁迫下萜烯类VOCs释放量表现出先上升后下降趋势, 中度干旱胁迫和高温胁迫下分别比对照高37.9%和32.3%; 协同胁迫下萜烯类释放量逐渐降低, 干旱、高温和协同胁迫诱导醛类释放量明显增加。上述结果表明: 干旱胁迫条件下, ‘波叶金桂’通过NSC进行自我渗透调节, 同时合成大量萜烯类化合物来提高抗旱性; ‘波叶金桂’调控萜烯类化合物合成以及绿叶挥发物(GLVs)的释放抵御高温胁迫; 协同胁迫下萜烯类化合物的合成途径受阻, ‘波叶金桂’提高GLVs合成与释放量抵御协同胁迫; 中度和重度协同胁迫导致‘波叶金桂’细胞膜严重受损, 自我调节能力降低。     

‘波叶金桂’对干旱和高温胁迫的生理生态响应

为了探讨植物对干旱、高温及协同胁迫的响应, 该研究以木犀(Osmanthus fragrans) ‘波叶金桂’为材料, 采用盆栽质量控水法模拟干旱胁迫(对照、轻度、中度和重度)和高温胁迫, 利用动态顶空气体循环吸附法和热脱附-气相色谱-质谱(TDS-GC-MS)联用技术对其挥发性有机化合物(VOCs)进行测定; 同时测定其非结构性碳(NSC)含量及次生代谢酶活性。结果表明: 干旱胁迫对‘波叶金桂’叶片NSC组分含量影响不显著; 可溶性糖和淀粉含量在高温胁迫下显著降低, 在协同胁迫后持续性下降, 重度协同胁迫下, 葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉分别比对照降低47.7%、46.4%、34.4%和38.2%。干旱胁迫和协同胁迫下3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧木酮糖-5-磷酸还原酶(DXR)活性表现出先上升后下降, 而脂氧合酶(LOX)活性表现出持续性上升趋势; 高温胁迫后, HMGR、DXR和LOX活性显著高于对照。干旱胁迫下萜烯类VOCs释放量表现出先上升后下降趋势, 中度干旱胁迫和高温胁迫下分别比对照高37.9%和32.3%; 协同胁迫下萜烯类释放量逐渐降低, 干旱、高温和协同胁迫诱导醛类释放量明显增加。上述结果表明: 干旱胁迫条件下, ‘波叶金桂’通过NSC进行自我渗透调节, 同时合成大量萜烯类化合物来提高抗旱性; ‘波叶金桂’调控萜烯类化合物合成以及绿叶挥发物(GLVs)的释放抵御高温胁迫; 协同胁迫下萜烯类化合物的合成途径受阻, ‘波叶金桂’提高GLVs合成与释放量抵御协同胁迫; 中度和重度协同胁迫导致‘波叶金桂’细胞膜严重受损, 自我调节能力降低。     

羊草LcPIP基因遗传转化露地菊及其抗盐性鉴定

PIP是重要的水孔蛋白之一,与植物的抗逆性有关。本文用叶盘法将羊草LcPIP遗传转化露地菊火焰,通过常规PCR和GUS染色方法鉴定转基因株系,Real-time PCR检测盐胁迫下转基因和野生植株中CmPIP1和CmPIP2的相对表达量,并测定SOD、POD活性和MDA含量。结果显示,在转LcPIP基因的露地菊植株叶片中,CmPIP1和CmPIP2基因表达量均上升,是野生型植株的2倍;根部的CmPIP1与CmPIP2基因的表达量均上升,CmPIP1上升程度高于CmPIP2。在200 mmol·L~(-1) NaCl的胁迫下,野生型植株中CmPIP1基因表达量明显下降,而转基因植株中CmPIP1基因表达量在12~48 h出现明显的上升;在盐胁迫12 h后,转基因植株中CmPIP2基因表达量上升程度明显高于野生型植株。盐胁迫12 h后,转基因植株的SOD活性提高更为明显。在盐胁迫前期(0~24 h)转基因植株MDA含量增加幅度低于野生型植株;在盐胁迫后期(48~72 h)转基因露地菊POD活性出现明显上升,而野生型露地菊呈下降趋势。     

水分亏缺下玉米根系ZmPIP1亚族基因的表达

在PEG-6000胁迫条件下,以微管蛋白基因为内参基因、水通道蛋白基因ZmPIP1-1和ZmPIP1-2为检测基因,采用半定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）体系检测它们在玉米根系中的表达情况。实验结果是：胁迫条件下,ZmPIP1-1的表达量在杂交F,代‘户单4号’（抗旱）和母本‘天四’（抗旱）根系中增多,它的表达量与品种的抗旱性呈正相关,并且胁迫不同时间段它的表达量有差异;而ZmPIP1-2在3个玉米品种的不同水分处理条件下,表达量均没有明显变化。这提示,水分胁迫条件下根系中某些种类的水通道蛋白基因的表达量增多,并且与品种的抗旱性有关;而另一些水通道蛋白基因的表达不受水分亏缺的影响。     

实时荧光定量PCR检测球孢白僵菌热休克蛋白基因hsp70在几种胁迫条件下的表达

本研究运用Realtime-PCR技术,对球孢白僵菌Beauveria bassiana hsp70基因在不同胁迫条件下的表达情况进行了检测。从mRNA转录水平探讨了不同胁迫条件对球孢白僵菌hsp70基因表达的影响。结果表明:38℃高温胁迫下,30min时表达量达到最高峰,为对照样品的10.18倍。随后表达量开始下降,至180min时,其表达量降为最低,为对照样品的2.85倍;4℃低温胁迫下,2h检测到hsp70的表达量下降至最低点,为对照样品的0.25倍。随后表达量开始回升,至10h表达量始终维持在对照样品的1.4-1.5倍左右;紫外胁迫下(波长253.7nm),3min后hsp70的表达量快速上升至最高峰,为对照样品的2.33倍。随后表达量迅速下降,至60min表达量始终维持在对照样品的0.2倍左右。因此推测,hsp70基因在球孢白僵菌抵抗高温、低温和紫外三种胁迫方面都可能具有重要作用。同时研究结果也表明,球孢白僵菌hsp70基因启动子在逆境下可引导基因高效表达,因而在抗逆工程菌株构建方面可能具有重要的应用价值。     

游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成

【目的】解析Actinoplanes sp.SE50/110(简称SE50/110)中阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成机制。【方法】经过BLASTp分析,推测了Acb A、Acb B和Acb V负责阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成。首先,本研究在SE50/110中分别构建了acb A、acb B和acb V的同框缺失和回补突变株。然后,利用大肠杆菌BL21(DE3)/p Gro7分别对Acb A、Acb B和Acb V成功实现了可溶性表达。最后,以D-葡萄糖-1-磷酸为起始底物,通过体外催化反应,研究脱氧氨基糖单元的生物合成过程和相关蛋白的酶学性质。【结果】在SE50/110中分别缺失acb A、acb B和acb V基因后,相应突变株均丧失了阿卡波糖的合成能力,将acb A、acb B和acb V基因分别回补后,各菌株又恢复了阿卡波糖的合成能力,证明了它们均为阿卡波糖生物合成的必需基因。在体外酶促反应中,D-葡萄糖-1-磷酸-胸腺嘧啶转移酶Acb A催化D-葡萄糖-1-磷酸和d TTP合成d TDP-D-葡萄糖,对D-葡萄糖-1-磷酸的Km值为(0.185±0.053)mmol/L,Vmax为(2.366±0.217)μmol/(min·mg);对d TTP的Km值为(4.964±1.089)mmol/L,Vmax为(60.310±5.419)μmol/(min·mg)。d TDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶Acb B催化d TDP-D-葡萄糖转化为d TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖,Km值和Vmax分别为(0.353±0.089)mmol/L和(306.401±28.740)μmol/(min·mg)。氨基转移酶Acb V催化d TDP-4-酮基-6-脱氧-D-葡萄糖生成d TDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖,Km值和Vmax分别为(1.411±0.293)mmol/L和(3.447±0.279)μmol/(min·mg)。【结论】本研究阐明了阿卡波糖脱氧氨基糖单元的生物合成过程,为全面解析阿卡波糖生物合成途径奠定了基础。同时,测定了相关酶的动力学参数,为代谢工程改造SE50/110,提高阿卡波糖产量提供了重要的理论依据。     

苍白杆菌核糖-5-磷酸异构酶B基因的克隆及表达

[目的]将新筛选出的苍白杆菌菌株中的核糖-5-磷酸异构酶B(Rpi B)克隆到大肠杆菌中进行异源表达优化。[方法]以苍白杆菌菌株基因组为模板PCR扩增Rpi B基因,经酶切连接表达载体p ET-28a后转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,利用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达及优化,利用SDS-PAGE分析表达情况。通过LC-MS-MS验证重组酶活性。[结果]SDS-PAGE分析表明,核糖-5-磷酸酶在大肠杆菌中高效表达可溶性蛋白,分子量在19 k Da左右。优化结果表明在16℃下需要IPTG诱导20 h后蛋白表达量最多。重组粗酶液在30℃下转化L-鼠李糖为L-鼠李酮糖,转化率为19%。[结论]成功克隆并表达出来源于苍白杆菌的Rpi B酶,它对其非天然底物糖L-鼠李糖表现出了异构酶活性。