溶藻细菌筛选及溶藻活性物质对铜绿微囊藻生理活性的影响

从太湖水华水体中分离纯化细菌, 再将细菌的LB液体和固体斜面纯培养物分别收集后感染铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)细胞, 从中筛选出7株具有溶藻活性的细菌, 并对其中一株溶藻细菌THW7的溶藻方式及溶藻活性物质对铜绿微囊藻生理活性的影响进行了初步研究。结果表明: 仅采用细菌的LB液体纯培养物进行溶藻细菌筛选会存在误筛或高估溶藻效率的风险, 而采用细菌的固体斜面纯培养物进行筛选则可避免以上风险; 溶藻细菌THW7通过分泌胞外活性物质的方式间接溶藻; 在THW7无菌滤液胁迫下, 铜绿微囊藻的生长受到显著抑制(P<0.01), 10d溶藻效率可达94.38%, 光合系统活性也显著降低(P<0.01), MDA含量积累, SOD、POD、CAT活性整体呈现先升高后降低的趋势且显著高于对照组(P<0.01)。推测菌株THW7分泌的溶藻活性物质可能作用于铜绿微囊藻细胞的光合系统Ⅱ, 阻碍电子传递, 抑制其光合作用过程, 并对藻细胞产生氧化损伤, 破坏藻细胞细胞膜的完整性, 从而实现溶藻作用。     

一株溶藻细菌对海洋原甲藻的溶藻效应

从深圳大鹏湾南澳赤潮爆发海域的表层海水中分离得到1株对海洋原甲藻(Prorocentrum micans)具有溶藻活性的海洋细菌,菌株编号为N10。利用液相感染法研究了该溶藻细菌的溶藻效果和溶藻作用方式。结果表明,菌株N10能使藻细胞失去运动活性,并膨胀变形,细胞膜内物质聚集于一端,藻细胞最终破裂死亡。菌悬液接种到藻液中的量越大,初始细菌密度越高,其溶藻效果越强。菌悬液以1∶10的体积比接种到藻液中时,藻细胞在24 h的死亡率为83%,至72 h全部溶解死亡;体积比为1∶20的藻细胞在24 h的死亡率为71%,之后藻细胞密度略有波动,120 h时死亡率达77%;而体积比为1∶100的藻细胞密度在前24 h有所下降,死亡率达39%,之后藻细胞密度又开始明显上升;对照组的藻细胞密度均呈明显上升趋势。菌悬液过滤液和高温加热处理后的菌悬液过滤液对海洋原甲藻均无溶藻活性,表明菌株N10的溶藻方式为直接溶藻。通过16S rRNA序列分析并与GenBank数据进行同源性检索,并结合细菌形态及生理生化特征,菌株N10隶属于黄杆菌科(Flavobacteriaceae)中的Muricauda sp.。     

一株溶藻细菌NP23的初步分离鉴别及其溶藻作用研究

从水体中分离得到一株具有溶藻能力的细菌,命名为NP23。经形态特征、生理生化鉴定和16S rDNA序列分析表明,该菌株属于肠杆菌属(Enterobacter)。研究了该菌株对湖泊中优势藻的溶藻效果,初步探讨了其溶藻方式及溶藻物质。结果表明,该菌株对小球藻、惠氏微囊藻、栅藻和蛋白核小球藻具有一定的去除效果,叶绿素a的去除率分别为64.1%、53.1%、87.2%和84.4%,而且在10-108CFU/mL菌浓度范围内,藻的去除率与菌液的浓度成正相关;该菌株对小球藻、栅藻和蛋白核小球藻是间接溶藻,对惠氏微囊藻是直接溶藻;该菌株对栅藻的溶藻物质是蛋白类物质,对蛋白核小球藻的溶藻因子是菌体胞外分泌的具有热稳定性的非蛋白类物质。     

芽孢杆菌产溶藻活性物质的环境稳定性研究

目的:探讨芽孢杆菌产溶藻活性物质对酸碱度、温度、反复冻融等的耐受性,获得其最佳运输、贮存和使用条件。方法:在链状亚历山大藻的藻液中添加经不同条件处理的活性物质,显微计数获得藻细胞变化曲线。结果:获得的溶藻活性物质的活性在20~60℃范围内稳定,碱性条件下(p H9)活性降低,反复冻融15次后溶藻率仍大于90%,4℃冰箱中保存6个月溶藻率为90%左右。结论:芽孢杆菌产的溶藻活性物质具有较好的热稳定性和耐酸性,反复冻融多次对其影响较小,适合较长时间贮存。     

一株中肋骨条藻特异溶藻菌的分离鉴定及溶藻特性

【背景】赤潮频发引起严重的海洋生态学问题,不仅直接影响到海洋生态系统稳定、海洋生物资源可持续利用和水产养殖业等海洋产业的健康发展,而且对人类健康也构成了严重威胁。高效的溶藻细菌是生物法防控赤潮的有效工具之一。【目的】分离得到对中肋骨条藻具有高效溶藻效果的溶藻细菌,并对其进行分子鉴定,研究该菌株的溶藻机理以及溶藻菌所分泌溶藻物质的特性。【方法】采用2216E平板稀释涂布法分离纯化细菌,测定16S rRNA基因序列以鉴定细菌种类,利用显微镜计数溶藻菌处理后的目标藻种计算溶藻率,通过扫描电镜观察溶藻菌对中肋骨条藻的溶藻过程,利用常规生理生化方法研究溶藻菌溶藻物质的特征,并通过透析袋截留法研究溶藻物质分子量大小。【结果】分离得到一株中肋骨条藻高效溶藻菌FDHY-CJ,该菌株属于交替单胞菌属(Alteromonas sp. FDHY-CJ)。该菌株72 h处理赤潮藻结果显示,对中肋骨条藻溶藻率为95.45%,对于其他常见赤潮藻溶藻率低于40%。溶藻菌FDHY-CJ通过胞外分泌物溶藻;溶藻物质的溶藻特性不受反复冻融的影响,但对酸碱性及温度较为敏感;扫描电镜观察结果显示该溶藻菌的溶藻物质直接溶解中肋骨条藻的细胞壁,致使硅质壳打开、内容物流出,达到溶藻的效果;溶藻活性物质具有被乙醇和乙酸乙酯沉淀的特性。【结论】溶藻菌FDHY-CJ对中肋骨条藻具有特异溶藻作用,对其他常见赤潮溶藻效果不明显;该细菌溶藻方式为通过分泌物间接溶藻,溶藻物质属于蛋白类,大小在3.5?10 kD之间。     

滇池中溶藻细菌的分离鉴定及其溶藻效应

【背景】藻类水华或赤潮在世界范围内频发,带来各种危害,亟需找到有效途径控制水华或赤潮。溶藻细菌具有杀死藻类控制藻类生物量的能力,可以作为防治水华和赤潮的有效工具。【目的】分离并鉴定滇池中的铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)及其溶藻细菌,对溶藻菌作用于铜绿微囊藻的溶藻效应进行研究,初步了解其溶藻特性与溶藻机制。【方法】采用LB平板稀释涂布,再经多次划线分离纯化细菌,测定16SrRNA基因序列以鉴定细菌种类;采用毛细管分离的方法分离铜绿微囊藻,并测定其cpcBA基因序列以鉴定蓝藻种类;采用热乙醇法提取叶绿素a,从而计算溶藻效率;基于过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)探究藻细胞在溶藻菌处理下的抗氧化系统响应。【结果】共分离获得11株微囊藻和17株针对铜绿微囊藻的高效溶藻菌。选取其中一株生长速度最快的铜绿微囊藻DCM4和一株溶藻效果最好的溶藻菌Sp37 (Bacillus siamensis)进行后续研究。Sp37对DCM4的4 d溶藻率达到92.4%±1.5%,且对微囊藻属的水华微囊藻(M. flos-aquae)和惠氏微囊藻(M.wesenbergii)均有溶藻效果,而对绿藻没有溶藻效果。Sp37的原菌液和无菌滤液对DCM4的4d溶藻率分别为86.8%±4.3%和81.1%±2.2%,两者没有显著差异(P0.05)。Sp37菌体对DCM4的溶藻率为25.4%±7.3%。Sp37无菌滤液经不同温度和pH处理之后的溶藻率与未经处理的无菌滤液的溶藻率无明显差异。Sp37无菌滤液处理藻细胞会使藻细胞的CAT、GSH和MDA含量发生变化。【结论】菌株Sp37对铜绿微囊藻DCM4具有高效的溶藻作用,而且对微囊藻属具有一定的溶藻特异性。Sp37是通过分泌胞外物质间接溶藻,且溶藻物质具有热稳定性和酸碱稳定性。Sp37无菌滤液处理藻细胞会触发藻细胞抗氧化系统,并且会损伤藻细胞膜。Sp37无菌滤液很可能是通过对藻细胞造成氧化胁迫,最终导致藻细胞死亡的。     

一株赤潮藻溶藻菌的筛选鉴定及溶藻特性分析

为缓解赤潮微藻对海洋生态环境的危害性问题,从潮间带泥样中筛选溶藻菌进行生物学特征分析,通过稀释涂布平板法及平板划线分离法从浙江舟山桃花岛潮间带泥样分离筛选菌株,以中肋骨条藻(Skeletonema costatum)及东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)为受试对象,通过丙酮法提取、测定叶绿素含量变化从中筛选高效抑制赤潮微藻生长的菌株。经形态学观察、生理生化特征检测及16S rDNA序列分析比对初步确定菌株的分类地位。通过不同pH、发酵时间、添加比例等单因素实验,对菌株溶藻特性和溶藻活性物质特性进行研究。从潮间带泥样中共获得43株菌,以菌株2-1-2抑制效果最佳,经鉴定属于芽孢杆菌属,初步命名为Bacillus sp. 2-1-2。溶藻菌Bacillus sp. 2-1-2以胞外分泌溶藻物质的方式进行间接溶藻,最适生长pH为7.0±1.0,菌液最佳发酵时间2—4d、最佳添加比例20%;溶藻活性物质耐热性好,对酸碱耐受性佳,但不耐强酸,在pH=10、80℃处理后溶藻率分别可达(90.57±0.43)%和(89.52±0.96)%。对赤潮藻细胞ROS水平与MDA含量...     

溶藻放线菌AN02的筛选及其培养条件的优化

探讨了开发利用土壤放线菌资源来进行水华防治的新途径。从土壤中分离到13株具有溶藻活性的放线菌菌株,经过进一步筛选得到AN02菌株,其胞外代谢产物对铜绿微囊藻具有较好的抑杀作用。研究了不同培养条件对AN02溶藻活性的影响,结果发现pH为7.5,28℃,培养6 d时的溶藻效果最好。此外,较强烈的振荡和充分的溶氧也有利于提高溶藻效果。     

溶藻细菌BS03(Microbulbifer sp.)对塔玛亚历山大藻生长及抗氧化系统的影响

【目的】研究溶藻细菌BS03(Microbulbifer sp.)胁迫下塔玛亚历山大藻细胞光合作用、抗氧化酶系统和半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)变化,探讨溶藻细菌BS03对塔玛亚历山大藻的溶藻机制。【方法】通过0.5%、1.0%、1.5%、2.0%不同终浓度BS03上清液处理藻细胞后12、24、36、48h取样,测定溶藻过程藻细胞光合色素、叶绿素荧光效率、抗氧化酶系统、Caspase酶活性变化。【结果】(1)BS03上清液处理藻细胞后,藻细胞叶绿素a含量和叶绿素荧光Fv/Fm比值随BS03上清液处理时间延长和浓度的增加呈逐渐下降趋势;低浓度处理组藻细胞类胡萝卜素含量上升到一峰值,高于对照组后逐渐回落,而高浓度处理组类胡萝素含量呈下降趋势,低于对照组;(2)藻细胞抗氧化酶保护系统(SOD和CAT)活性随着BS03上清液处理浓度增加而升高,但随着处理时间的延长呈现先上升后下降趋势。藻细胞膜脂过氧化产物MDA积累量随着BS03上清液处理时间延长和处理浓度的增加而显著提高;(3)处理组藻细胞Caspase-3活性显著高于对照组,呈现出类似程序性死亡特征。【结论】BS03的抑藻机理可能是通过抑制藻细胞光合作用,降低抗氧化酶活性、加大膜脂过氧化起到对塔玛亚历山大藻的溶解作用,并呈现出类程序性死亡特征。     

芽孢杆菌dhs-330-021对链状亚历山大藻的溶藻机理研究

目的:本实验室通过转座突变技术获得了一株高产表面活性物质的芽孢杆菌dhs-330-021,研究其对链状亚历山大藻的抑制效果,及其溶藻作用方式。方法:在链状亚历山大藻的培养液中添加dhs-330-021的发酵液等,间隔一定时间计数获得藻细胞的数量。结果:菌株dhs-330-021培养后期的发酵液溶藻效果好于培养前期和中期;在一定浓度范围内,dhs-330-021的发酵液对不同生长期的链状亚历山大藻均有溶藻效果,其中对延滞期和稳定期效果最好;菌株的发酵液和无菌上清液的溶藻效果明显,而菌悬液溶藻效果较差。结论:菌株dhs-330-021能显著抑制链状亚历山大藻的生长,其溶藻方式属于间接溶藻。     

一株嗜盐杆菌对中肋骨条藻的溶藻作用机理研究

藻华是一种全球性的生态灾害, 利用海洋溶藻菌治理藻华是藻华治理领域的一个研究热点。文章旨在揭示一株嗜盐杆菌对中肋骨条藻的溶藻作用机理, 对溶藻作用下中肋骨条藻细胞形态结构进行了观察, 并测定了相关的生理参数, 同时研究了溶藻作用对藻细胞光合作用的影响并比较了与氮代谢、抗氧化系统相关酶活性的变化。结果表明, 溶藻作用使得中肋骨条藻细胞链状结构发生断裂, 细胞多以单细胞形态存在且单细胞长度显著增加, 最终细胞原生质体在细胞一端形成泡状后逐渐膨胀破裂。同时, 溶藻作用下中肋骨条藻细胞内总蛋白质含量、叶绿素a含量、总氮含量、Fv/Fm、Y(II)以及与氮代谢相关的硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶的活性均显著降低, 而与抗氧化系统相关的丙二醛含量、超氧化物歧化酶、过氧化物酶的活性显著上升。溶藻物质显著抑制了中肋骨条藻对氮的吸收利用, 细胞的正常代谢活动受阻, 最终影响到细胞的繁殖分裂。同时细胞内活性氧的增加可能改变了细胞膜的通透性, 大量胞外物质透过细胞膜进入细胞内而使细胞膨胀破裂死亡。     

溶藻细菌FS1的溶藻效果与机制初探

近年来,由水体富营养化引发的蓝藻水华频繁暴发,对水体生态系统平衡产生了重大影响,给人类健康也带来严重威胁。生物法除藻具有高效性、环境友好等优点,因此,如果能获得具有较高溶藻效率的溶藻细菌,选择生物法除藻更为理想。从菏泽一富营养化池塘分离得到1株溶藻细菌FS1,经16S rDNA测序分析鉴定为芽胞杆菌属。实验以铜绿微囊藻为研究对象,采用血球计数板法计算反应前后藻细胞的浓度,对不同生长阶段溶藻细菌FS1的溶藻效果进行了探究。停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的除藻率分别为7.1%、24.3%、57.0%和45.5%,结果表明,处于稳定期的FS1对铜绿微囊藻的去除效果最佳。细菌溶藻方式的研究结果表明,溶藻细菌是通过分泌溶藻物质间接溶解藻细胞。     

基于生态风险评估探究溶藻细菌2-4的抑藻特性

[目的]基于生态安全评估,探索溶藻细菌及其分泌物的抑藻效果与机制。[方法]分离获得溶藻细菌2-4 (Pseudomonassp.),通过正交试验和动力学模型研究了菌株2-4及其分泌物的抑藻特性,并通过急性毒性试验对菌株2-4及其分泌物进行生态风险评估。[结果]菌株2-4在最优条件下接种体积比(V/V)为15%时对铜绿微囊藻的4 d抑制率达92.81%,抑藻反应符合一级动力学模型(t_1/2=126 h)。菌株2-4具有抑藻多样性,首次报道了假单胞菌对斜生四链藻、蛋白核小球藻和丝藻的抑藻效果。菌株2-4分泌的抑藻活性物质分子量小于500 Da,不耐高温和强酸强碱。急性毒性试验结果显示,高于1.5%的菌液对大型溞有毒,高于2%的菌株分泌物对大型溞和稀有鮈鲫有毒,但对明亮发光杆菌无毒。较安全的使用范围内,菌株2-4 (V/V=1.5%)及其分泌物(V/V=10%)对藻华湖泊水样的叶绿素a去除率为4.83%–42.94%和30.62%–68.69%。[结论]本研究客观分析了假单胞菌2-4及其分泌物在生态安全使用范围内的实际抑藻效果,明晰了溶藻细菌生态毒性与抑藻效率的关系,为生物控藻实践提供理论参考。     

溶藻细菌杀藻物质的研究进展*

溶藻细菌作为防治有害藻类水华的一种可能微生物,已引起了众多科研人员的关注。大多数溶藻细菌分泌的生物活性杀藻物质对宿主藻类具有强烈的杀灭作用。首先讨论了细菌活性杀藻物质的生态作用,重点阐述了目前已经报道的细菌杀藻物质的种类及其提取和分离方法,最后对细菌杀藻物质的进一步研究提出几点看法。     

西藏林芝土壤放线菌抗肿瘤活性菌的筛选及鉴定

【目的】筛选并鉴定西藏林芝八一镇土壤中产生抗肿瘤活性物质的放线菌。【方法】用平板稀释法分离放线菌, 用MTT法和纸碟法对放线菌发酵产物进行体外抗肿瘤与抑菌活性检测, 并用多相分类技术对抗肿瘤活性菌株进行鉴定。【结果】共分离出29株放线菌, 得到6个抑制体外肿瘤细胞增殖的活性菌株(20.7%), 同时它们也具有抑菌活性, 其中4株菌的检测样品对Hela细胞的抑制率达80%以上。多相分类研究表明, 6个活性菌株分别隶属于链霉菌属(Streptomyces)的3个已知物种的变种。【结论】林芝八一镇土壤放线菌中蕴藏抗肿瘤活性链霉菌, 是一个潜在的抗肿瘤药用微生物资源。     

一种快速检测分离溶藻细菌方法的初探

传统的细菌培养基对铜绿微囊藻具有毒性作用。会大大影响溶藻细菌的筛选效率和准确性。通过基本培养基各成分对铜绿微囊藻DS的作用研究发现,培养基中的葡萄糖成分对藻有抑制作用,并且这种抑制作用与培养基中的葡萄糖浓度密切相关,当培养基中葡萄糖的浓度在0．1～0．4g/L时,藻细胞生长受到抑制,当用柠檬酸三钠取代葡萄糖后,铜绿微囊藻在改良后的培养基中生长正常,与对照组相比无显著性差异(P＜0．05)。用改良的培养基富集水样中的溶藻微生物,并用此培养液直接感染宿主藻,一周内即可初步快速检测是否含有溶藻细菌。此种方法既排除了培养基的干扰因素,又迅速增加了溶藻细菌的生物量,并可大量收集细菌分泌的胞外物质,为溶藻细菌尤其以分泌物质溶藻的细菌的初步筛选提供了一条快捷、有效的途径。     

三株溶藻细菌胞外溶藻活性物质若干分离特性的研究

为了探索新分离到的3株溶藻细菌胞外溶藻活性物质的分离特性, 选择了对水华鱼腥藻生长无抑制作用的淀粉培养基培养溶藻细菌。采用透析、乙醇沉淀、有机溶剂萃取、活性炭吸附与解吸等方法对其分离特性进行了研究。溶藻细菌L7的溶藻活性物质的分子量小于3.5 kD, 溶藻细菌L8、L18的溶藻活性物质的分子量在3.5 kD~7 kD之间; 3株溶藻细菌的胞外溶藻活性物质不能用乙醇沉淀法完全分离; 3株溶藻细菌的溶藻活性物质具较好的亲水性和较强的极性, 且都不能被活性炭吸附。     

三株溶藻细菌胞外溶藻活性物质若干分离特性的研究

为了探索新分离到的3株溶藻细菌胞外溶藻活性物质的分离特性,选择了对水华鱼腥藻生长无抑制作用的淀粉培养基培养溶藻细菌.采用透析、乙醇沉淀、有机溶剂萃取、活性炭吸附与解吸等方法对其分离特性进行了研究.溶藻细菌L7的溶藻活性物质的分子量小于3.5 kD,溶藻细菌L8、L18的溶藻活性物质的分子量在3.5 kD～7 kD之间;3株溶藻细菌的胞外溶藻活性物质不能用乙醇沉淀法完全分离;3株溶藻细菌的溶藻活性物质具较好的亲水性和较强的极性,且都不能被活性炭吸附.     

醋酸钙不动杆菌的分离鉴定及溶藻特性

淡水微囊藻水华不仅造成水体动植物缺氧死亡,而且释放藻毒素,影响人类和其它动物的健康。利用液体感染技术,从河南省平顶山市白龟山水库分离一株能够溶解铜绿微囊藻PCC 7806的溶藻菌,命名为溶藻菌5,16S r DNA核苷酸序列测序证实该菌株为醋酸钙不动杆菌。它具有一定的溶藻特异性,只溶解PCC 7806,对FACHB-930和斜生栅藻没有影响,能够促进衣藻和红球藻的生长。最佳溶藻体积比为1∶1。溶藻菌5的菌体和无细胞培养物均具有相同的溶藻效果。显微观察藻细胞被溶解的黄化液显示细菌并未附着在藻细胞周围,也无菌胶膜形成。表明溶藻菌5可能通过释放杀藻物质和与藻竞争营养物质两种机制溶解藻细胞。     

一种快速检测分离溶藻细菌方法的初探

传统的细菌培养基对铜绿微囊藻具有毒性作用。会大大影响溶藻细菌的筛选效率和准确性。通过基本培养基各成分对铜绿微囊藻DS的作用研究发现,培养基中的葡萄糖成分对藻有抑制作用,并且这种抑制作用与培养基中的葡萄糖浓度密切相关,当培养基中葡萄糖的浓度在0．1～0．4g/L时,藻细胞生长受到抑制,当用柠檬酸三钠取代葡萄糖后,铜绿微囊藻在改良后的培养基中生长正常,与对照组相比无显著性差异(P＜0．05)。用改良的培养基富集水样中的溶藻微生物,并用此培养液直接感染宿主藻,一周内即可初步快速检测是否含有溶藻细菌。此种方法既排除了培养基的干扰因素,又迅速增加了溶藻细菌的生物量,并可大量收集细菌分泌的胞外物质,为溶藻细菌尤其以分泌物质溶藻的细菌的初步筛选提供了一条快捷、有效的途径。