木犀草素预处理对H_2O_2诱导大鼠心肌H9C2细胞损伤的保护机制研究

为了探讨木犀草素能否通过再灌注损伤挽救激酶(Reperfusion injury salvage kinase,RISK)细胞信号通路发挥抗心肌氧化应激损伤保护作用,本实验分别用1、50、100、150μmol/L的木犀草素预处理大鼠心肌来源的H9c2细胞,再使用650μmol/L的H_2O_2制作氧化应激损伤模型。利用MTT法(四甲基偶氮唑盐比色法)检测细胞存活率,然后用最适浓度的木犀草素预处理H9c2细胞并利用激光共聚焦显微镜技术检测线粒体膜电位,Western blot检测P-ERK1/2、P-Akt、P-GSK-3β以及凋亡相关蛋白细胞色素C。最后我们发现不同浓度的木犀草素预处理均能提高细胞存活率,其中在100μmol/L时达到最佳效应。与H_2O_2组相比,100μmol/L的木犀草素预处理可以使TMRE(四甲基罗丹明乙酯)强度降低程度明显减轻,对抗H_2O_2引起的细胞氧化损伤。同时木犀草素预处理可以降低细胞色素C表达,使P-GSK-3β、P-Akt、P-ERK1/2表达升高,渥曼青霉素(PI3K抑制剂)和PD98059(ERK1/2抑制剂)可以阻断这种作用。因此我们认为木犀草素预处理可以减轻H_2O_2引起的氧化应激损伤,这一作用可能是通过RISK信号通路增加P-GSK-3β表达,抑制m PTP开放实现的。     

H9c2心肌细胞多巴胺受体的表达

为明确H9c2心肌细胞是否能够表达多巴胺受体（dopamine receptor,DR）,应用RT-PCR和Westernblot-ting分别检测H9c2心肌细胞和SD成年雌鼠左心室心肌组织中,DR的两种亚型,D1DR和D4DR的表达.结果发现,H9c2心肌细胞可在mRNA和蛋白水平上表达出与SD大鼠心肌组织相同的产物.这说明能以H9c2心肌细胞为研究材料,进一步深入研究心肌D1DR和D4DR基因的表达调控机制以及心肌DR的功能.     

通平养心方对高糖诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用机制研究

观察通平养心方对高糖诱导的H9c2细胞损伤的保护作用机制。高糖造成细胞损伤模型;MTT法检测细胞存活率;激光扫描共聚焦显微镜成像法,检测线粒体特异性荧光染料四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester,TMRE),观察细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的变化,证明通平养心方是否通过抑制线粒体通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)的开放而发挥心肌线粒体的保护作用;Western-blot检测p-JNK、p-GSK-3β。结果发现,通平养心方和JNK抑制剂均能阻断高糖造成的H9c2心肌细胞损伤;0.1μg/m L通平养心方预处理10 min,细胞存活率升高、TMRE荧光减弱程度降低,p-JNK表达下降,p-GSK-3β表达升高。表明通平养心方能够通过线粒体保护途径对抗高糖诱导的H9c2细胞损伤,机制可能是通过JNK通路促进其下游因子GSK-3β磷酸化,从而抑制m PTP的开放实现的。     

硫化氢通过调控SIRT1抑制阿霉素诱导的H9c2细胞损伤

目的探讨硫化氢（H₂S）对阿霉素（DOX）诱导的H9c2细胞损伤的影响及其作用机制。 方法H₂S对DOX心肌毒性保护作用的实验分组为：对照组（Control组）,5?μmol/?L DOX处理组（A组）,5?μmol/L DOX和400?μmol/L NaHS共同处理组（B组）,400?μmol/L NaHS单独处理组（C组）,5?μmol/L DOX、400?μmol/L NaHS和15?μmol/L Sirtinol共同处理组（D组）,15?μmol/L Sirtinol单独处理组（E组）。SIRT1是否参与H₂S抗DOX心肌毒性作用机制的实验分组为：对照组（Control组）,5?μmol/L DOX处理组（F组）,5?μmol/L DOX和400?μmol/L NaHS共同处理组（G组）,5?μmol/L DOX、400?μmol/L NaHS和15?μmol/L Sirtinol共同处理组（H组）,15?μmol/L Sirtinol单独处理组（I组）。使用MTT法检测细胞活力;Elisa法检测细胞MDA以及SOD水平;DCFH-?DA荧光探针法检测ROS水平;采用Western Blot法检测SIRT1蛋白表达。使用单因素方差分析法进行统计学分析。 结果NaHS预处理可抑制DOX导致的H9c2细胞活力下降：Control组,A组、B组、C组细胞活力分别为100﹪、（54.58±1.58）﹪、（85.05±4.31）﹪、（100.22±4.46）﹪ （F = 134.9,P < 0.001）。NaHS预处理可减弱DOX引起的H9c2细胞ROS、MDA水平的增加以及SOD水平的降低：Control组的ROS、MDA和SOD水平分别是100﹪、（34.18±1.56） μmol/g、（53.69±1.44） U/?mg;A组的ROS、MDA和SOD水平分别是（174.90±12.65）﹪、（72.65±2.66） μmol/g、（31.80±2.05） U/?mg;B组的ROS、MDA和SOD水平分别是（126.08±6.25）﹪、（44.59±1.92） μmol/g、（48.06±1.56） U/mg;C组的ROS、MDA和SOD水平分别是（91.86±1.66）﹪、（32.93±1.56）?μmol/?g、（55.93±1.58）?U/?mg （F?= 83.26,P < 0.001;F = 271.4,P < 0.001;F = 127.0,P < 0.001）。F组（6、12、24?h）H9c2细胞SIRT1蛋白表达水平分别是（0.45±0.03）、（0.27±0.02）、（0.25±0.03）,较Control组（1.00±0.00）降低（F = 611.1,P < 0.001）。本研究还发现,NaHS预处理H9c2细胞能阻止DOX引起的SIRT1蛋白表达下调：Control组、F组、G组、H组的SIRT1蛋白表达水平分别是（1.00±0.00）、（0.31±0.03）、（0.60±0.04）、（1.09±0.09）（F = 123.4,P?2S对DOX诱导的H9c2细胞活力降低的抑制作用：Control组,F组、G组、H组、I组细胞活力分别为100﹪、（54.58±1.58）﹪、（85.37±3.62）﹪、（71.11±2.11）﹪、（97.53±1.45）﹪ （F = 238.2,P < 0.001）。Sirtinol预处理可明显逆转H₂S对DOX导致的H9c2细胞ROS和MDA含量增加及SOD水平降低的抑制作用：Control组的ROS、MDA和SOD水平分别是100﹪、（35.84±2.22）μmol/?g、（53.03±3.16） U/mg;F组的ROS、MDA和SOD水平分别是（184.6±11.33）﹪、（74.78±5.30）μmol/g、（29.26±0.85）U/mg;G组的ROS、MDA和SOD水平分别是（126.5±7.57）﹪、（41.95±3.43）μmol/g、（52.61±2.26）U/mg;H组的ROS、MDA和SOD水平分别是（174.7±5.50）﹪、（67.69±1.52） μmol/g、（35.33±1.95） U/mg,I组的ROS、MDA和SOD水平分别是（98.03±2.86）﹪、（37.66±2.49）μmol/g、51.14 U/mg（F = 112.0,P < 0.001;F = 93.73,P < 0.001;F = 84.92,P < 0.001）。 结论H₂S通过调控SIRT1抑制DOX诱导的H9c2细胞损伤。     

高糖通过诱导自噬障碍促进心肌细胞H9c2凋亡

目的探讨自噬对高糖（HG）诱导的心肌细胞H9c2凋亡的影响。 方法MTT法检测H9c2细胞活力;hoechst33258染色法检测凋亡细胞;Western Blot检测H9c2细胞促凋亡蛋白Bax和自噬相关蛋白（Beclin-1和P62）的表达。各组的OD值和蛋白条带灰度值均采用析因设计的方差分析,各组间差异用单因素ANOVA分析。 结果HG能诱导H9c2细胞活力降低：12、24、48 mmol/L的HG细胞活力分别为Control组（100%）的[（79.5±2.23）%]（t = 3.143,P = 0.043）、[（54.6±3.08）%]（t = 12.425,P = 0.000）和[（37.2±2.59）%]（t = 13.761,P = 0.000）;与Control组（100%）比较,甘露醇等渗对照组的细胞活力值为[（101.0±1.27）%]（t = 0.012,P = 0.094）。HG诱导H9c2细胞hoechst33258阳性细胞增加,且能诱导促凋亡蛋白Bax表达增加：与Control组比较,12、24、48 mmol/L的HG处理组凋亡蛋白Bax/β-actin灰度值分别为（1.29±0.25,t = 2.32,P = 0.045）、（1.42±0.23,t = 10.247,P = 0.000）和（1.81±0.29,t = 16.324,P = 0.000）。HG诱导自噬障碍：与Control组比较,自噬相关蛋白Beclin-1/β-actin灰度值分别为（0.82±0.16,t = 4.243,P = 0.032）、（0.78±0.19,t = 11.341,P = 0.000）和（0.62±0.11,t = 13.455,P = 0.000）,P62蛋白/β-actin蛋白灰度值分别为（1.29±0.25,t = 4.442,P = 0.014）、（1.42±0.23,t = 13.341,P = 0.000）和（1.81±0.29,t = 15.851,P = 0.000）。自噬诱导剂雷帕霉素可逆转HG诱导的hoechst33258阳性细胞增加,且逆转HG诱导的Bax表达升高：与control组比较,HG组、HG和雷帕霉素共处理组、雷帕霉素组的Bax/β-actin灰度值分别为（1.51±0.31,t = 14.342,P = 0.000）、（1.42±0.23,t = 9.621,P = 0.004）和（1.81±0.12,t = 0.172,P = 0.124）。 结论HG可促进心肌细胞H9c2凋亡,且能诱导自噬障碍,自噬诱导剂的运用逆转了HG对H9c2细胞的凋亡作用,表明自噬障碍是HG诱导H9c2细胞凋亡的重要机制。     

藏红花素抗心肌细胞低氧损伤作用及其机制研究

目的:探讨藏红花素(Crocin)对低氧心肌细胞的保护作用以及低氧诱导因子-1(HIF-1)和脯氨酰羟化酶(PHDs)的调控机制。方法:采用氯化钴(CoCl2)方法建立心肌细胞低氧损伤实验模型。应用Western blot方法检测心肌细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、诱导型NO合酶(iNOS)以及PHD1、2、3蛋白表达的变化。结果:与CoCl2低氧组比较,Crocin可显著提高低氧心肌细胞活力。Crocin可进一步促使心肌细胞HIF-1α、及其下游靶基因VEGF、iNOS蛋白表达增强。Crocin可促使心肌细胞PHD2蛋白表达明显增加,PHD3蛋白表达则明显减少。结论:Crocin对低氧心肌细胞具有明显的保护作用,其作用机制与Crocin激活HIF-1介导的低氧反应通路有关,PHDs参与了该反应的病理生理调控过程。     

氯化钴对H9c2 心肌细胞新基因Mipu1 表达的影响

目的:研究氯化钴(CoCl2)对大鼠胚胎心脏来源的H9c2心肌细胞中新基因Mipu1表达的影响。方法:利用不同浓度的CoCl2(0、100、200、300、400、500μmol/L)处理H9c2细胞9h,及200μmol/L CoCl2处理H9c2细胞不同的时间(0、6、9、12、24h)后,用RT-PCR和Western Blot分别观察H9c2细胞Mipu1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:CoCl2可以诱导H9c2细胞中Mipu1 mRNA和蛋白表达升高,200μM CoCl2处理组的Mipu1的表达水平高于100μM CoCl2处理组,但是更高浓度的CoCl2(>200μM)不能使Mipu1的表达进一步升高。随着CoCl2作用时间的延长,Mipu1的表达逐步升高,在12h达到高峰,但是在24h后下降。结论:CoCl2能够促进H9c2细胞新基因Mipu1的表达,并且具有一定的剂量和时间依赖性。     

氯化钴对H9c2心肌细胞新基因Mipu1表达的影响

目的：研究氯化钴（CoCl2）对大鼠胚胎心脏来源的H9c2心肌细胞中新基因Mipu1表达的影响。方法：利用不同浓度的CoCl2（0、100、200、300、400、500μmol/L）处理H9c2细胞9h,及200μmol/L CoCl2处理H9c2细胞不同的时间（0、6、9、12、24h）后,用RT-PCR和Western Blot分别观察H9c2细胞Mipu1 mRNA和蛋白的表达情况。结果：CoCl2可以诱导H9c2细胞中Mipu1 mRNA和蛋白表达升高,200μM CoCl2处理组的Mipu1的表达水平高于100μM CoCl2处理组,但是更高浓度的CoCl2（〉200μM）不能使Mipu1的表达进一步升高。随着CoCl2作用时间的延长,Mipu1的表达逐步升高,在12h达到高峰,但是在24h后下降。结论：CoCl2能够促进H9c2细胞新基因Mipu1的表达,并且具有一定的剂量和时间依赖性。     

熊去氧胆酸对阿霉素诱导的H9c2心肌细胞的影响及机制研究

目的:探讨熊去氧胆酸(UDCA)对阿霉素(DOX)诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响及机制.方法:体外培养H9c2细胞,1 μMDOX和不同浓度UDCA处理H9c2,CCK-8法测定细胞活力;实时定量聚合酶链反应检测心肌细胞凋亡分子Bax及炎症因子IL-1β、IL-6的表达;Western blotting检测UDCA对...     

荭草花醇提物对H_2O_2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用机制研究

研究荭草花醇提物对H9c2心肌细胞氧化损伤的保护作用机制。采用200μmol/L H_2O_2作用H9c2细胞0.5 h,建立H9c2细胞氧化损伤模型。将细胞分为正常对照组、H9c2细胞氧化损伤模型组、不同浓度荭草花醇提物(20、40、80μg/m L)预处理组。采用MTS法检测细胞存活率;生化试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量,细胞内丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力;Western blot测定cleavedcaspase-3、Bcl-2、Bax、p-AKT和AKT的表达。与模型组比较,荭草花醇提物能明显增加心肌细胞存活率,降低LDH释放量和MDA含量,提高SOD及CAT活性,并呈剂量依赖性抑制H_2O_2诱导的氧化应激损伤。荭草花醇提物下调cleaved caspase-3和Bax的蛋白水平,上调Bcl-2的表达,减少心肌细胞凋亡;增加细胞中p-AKT的表达,且这种表达可被PI3Ks抑制剂LY294002抵消。表明荭草花醇提物可减轻H_2O_2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激损伤,其机制可能与减少细胞凋亡,平衡氧化应激产物有关,且部分依赖于磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/Akt)通路。     

通平养心方对高糖诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用机制研究北大核心CSCD

观察通平养心方对高糖诱导的H9c2细胞损伤的保护作用机制。高糖造成细胞损伤模型;MTT法检测细胞存活率;激光扫描共聚焦显微镜成像法,检测线粒体特异性荧光染料四甲基罗丹明乙酯(tetramethyrhodamine ester,TMRE),观察细胞线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,△Ψm)的变化,证明通平养心方是否通过抑制线粒体通透性转移孔(mitochondrial permeability transition pore,m PTP)的开放而发挥心肌线粒体的保护作用;Western-blot检测p-JNK、p-GSK-3β。结果发现,通平养心方和JNK抑制剂均能阻断高糖造成的H9c2心肌细胞损伤;0.1μg/m L通平养心方预处理10 min,细胞存活率升高、TMRE荧光减弱程度降低,p-JNK表达下降,p-GSK-3β表达升高。表明通平养心方能够通过线粒体保护途径对抗高糖诱导的H9c2细胞损伤,机制可能是通过JNK通路促进其下游因子GSK-3β磷酸化,从而抑制m PTP的开放实现的。     

ERK1／2信号通路对黄芪苷Ⅳ抗H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤的作用

目的：研究黄芪苷Ⅳ（AST）是否通过细胞外信号调节激酶1／2（ERK1／2）通路发挥对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用。方法：用200μmoL／L的H2O2处理细胞6h,采用MTT法检测细胞存活率,建立H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤模型;比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）活性、总超氧化物歧化酶（T—SOD）和锰超氧化物歧化酶（Mn—SOD）活力以及丙二醛（MDA）含量;Western blot检测H9c2细胞ERK1／2蛋白的磷酸化水平。结果：在H2O2浓度为200μmol／L作用6h条件下,细胞存活率降低程度适中,实验结果重复性好,确定后续实验采用200μmol／L H2O2作用6h建立模型。与H2O2组比较,10mg／L及20mg／L AST均显著提高细胞存活率（P〈0．01）,使细胞培养液中LDH活性显著降低（P〈0．01）,T—SOD及Mn—SOD活力显著提高（P〈0．01）,MDA含量显著降低（P〈0．01）。10mg/L及20mg/L AST均显著增加H2O2损伤的H9c2细胞p—ERK1／2蛋白的表达（P〈0．01）,当用PD98059（ERK1／2的抑制剂）预处理后,AST的作用则被取消。结论：黄芪苷Ⅳ可以通过ERK1／2通路发挥对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用。     

木犀草素通过上调microRNA-34a-5p诱导肺癌细胞株H460凋亡的研究

探究木犀草素诱导人肺癌细胞株H460凋亡的分子机制,为其治疗肺癌提供新的科学依据。选取处于对数生长期的H460细胞株,并分为对照组和不同剂量的木犀草素组。采用CCK-8法检测木犀草素对H460细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率;PCR array检测肺癌相关基因mRNA表达;Western-blot检测p53、p21、Bax、Bcl-2表达量变化;qRT-PCR法检测microRNA-34a(miR-34a)的表达水平;本实验还检测了过表达miR-34a-5p后对H460细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。结果显示,木犀草素能有效抑制人肺癌H460细胞的增殖,并促进其凋亡,其机制可能是通过激活p53信号通路,上调miR-34a-5p,最终影响凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的表达来实现的。     

ERK1/2信号通路对黄芪苷Ⅳ抗H_2O_2诱导H9c2细胞氧化损伤的作用

目的:研究黄芪苷Ⅳ(AST)是否通过细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)通路发挥对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用。方法:用200μmol/L的H2O2处理细胞6 h,采用MTT法检测细胞存活率,建立H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤模型;比色法测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力以及丙二醛(MDA)含量;Western blot检测H9c2细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。结果:在H2O2浓度为200μmol/L作用6 h条件下,细胞存活率降低程度适中,实验结果重复性好,确定后续实验采用200μmol/L H2O2作用6 h建立模型。与H2O2组比较,10 mg/L及20 mg/L AST均显著提高细胞存活率(P<0.01),使细胞培养液中LDH活性显著降低(P<0.01),T-SOD及Mn-SOD活力显著提高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01)。10 mg/L及20 mg/L AST均显著增加H2O2损伤的H9c2细胞p-ERK1/2蛋白的表达(P<0.01),当用PD98059(ERK1/2的抑制剂...     

LOX-1过表达诱发H9C2心肌细胞肥大

目的:构建携带过表达大鼠凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)基因的慢病毒载体,研究LOX-1与心肌细胞肥大的关系。方法:构建大鼠LOX-1基因pHIV-LOX-1过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293T细胞,检测其侵染效率。包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞,72 h后观察其侵染效率。qPCR法检测细胞LOX-1表达。检测过表达LOX-1后心肌细胞面积及其蛋白含量变化。结果:成功构建过表达LOX-1 H9C2心肌细胞。过表达LOX-1组(Lv.LOX-1+)心肌细胞面积(16691.890±1022.368μm2)较对照组(Lv.NC)(3459.865±343.175μm2)显著增加(P0.001)。Lv.LOX-1+组心肌细胞蛋白含量(132.457±8.188 pg/cell)较Lv.NC组(45.095±1.655 pg/cell)显著增加(P0.001)。结论:LOX-1过表达能诱导H9C2心肌细胞肥大。     

木犀草素纳米制剂通过介导ERK/p38 MAPK/ JNK 改善体内外氧化应激损伤作用机制研究

为探讨木犀草素-泊洛沙姆纳米制剂对体内外氧化应激损伤的改善作用。实验使用泊洛沙姆(F127)包裹木犀草素制备纳米胶束并对其进行表征,采用透析法评价其体外释放行为。建立体外H_2O_2诱导PC12细胞氧化应激损伤模型,对各组细胞进行活性检测和细胞骨架染色。利用western-blot检测各组细胞中MAPK的磷酸化水平。通过中动脉线栓阻断法建立大鼠右侧大脑缺血再灌注损伤模型(MCAO)用于评价其体内氧化应激损伤,测定各组大鼠脑梗死体积、脑含水量及血浆中氧化应激水平(SOD、MDA、GSH-Px)。最后对木犀草素纳米制剂在大鼠体内的药代动力学进行研究。结果显示,木犀草素纳米制剂多呈球形,粒径均一,载药量和包封率较高,且木犀草素可以缓慢地从胶束中释放出来。体内外抗氧化应激作用表明,木犀草素纳米制剂可显著提高细胞存活率,降低p-JNK、p-p38、p-ERK表达(P<0.01),且细胞骨架清晰呈网状结构。同时木犀草素纳米制剂可显著降低大鼠脑梗死体积(P<0.05),上调SOD、GSH-Px水平(P<0.01),下调MDA水平(P<0.01),显著提高了其抗氧化应激损伤作用。其机制与木犀草素纳米制剂延长了其体内循环时间,提高了血药浓度,通过抑制MAPK信号转导途径的激活有效减少了细胞凋亡有关。     

葡萄籽原花青素通过PI3K/Akt信号通路抑制氧化应激诱导的H9c2心肌细胞凋亡

为了探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin, GSP)对心肌细胞的保护作用及机制,通过CCK-8法评估细胞活力,采用Western-blot分析评估GSP对凋亡相关蛋白质(cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2)和PI3K/Akt通路相关蛋白质(p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt)表达水平的影响,并使用TUNEL染色和Hoechst 33258染色评估H9c2心肌细胞凋亡情况。结果显示, GSP可以抑制H₂O₂诱导的H9c2心肌细胞的细胞毒性和凋亡,使促凋亡蛋白cleaved caspase-3和Bax表达下降,并使抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平升高; GSP作用于H9c2细胞后, PI3K和Akt的磷酸化水平增加,使PI3K/Akt信号通路激活。实验结果初步表明, GSP可抑制氧化应激诱导的H9c2心肌细胞凋亡,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。     

木犀草素通过抑制肝癌细胞Sp1活性上调抑癌基因OPCML表达

抑癌基因OPCML的甲基化失活是肿瘤发生的重要机制,因此采用药物逆转抑癌基因的失活状态是肿瘤防治的重要策略。研究表明,Luteolin可在一定程度上抑制DNA的甲基化转移酶(methyltransferase)的活性,但木犀草素是否能逆转OPCML的失活状态目前尚不明确。本研究通过体外培养肝癌细胞系HepG2,用不同浓度木犀草素处理后,采用实时定量PCR和Western blotting分别检测OPCML、DNMT1的m RNA和蛋白表达;甲基特异性PCR(MSP)和DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases)催化实验分析OPCML基因启动子区域甲基化及细胞核中甲基化活性;ELISA分析木犀草素处理前后对核转录因子Sp1活性的变化;RNA干扰及慢病毒转染等方法观察Sp1在介导甲基化及CPCML表达中的作用。最后建立裸鼠异种移植瘤动物模型,观察木犀草素对异种移植瘤生长的抑制作用。结果显示,Hep G2细胞基础状态下OPCML表达水平较低,其启动子区域甲基化水平较高,而经0~30μmol/L木犀草素处理后,能显著增强OPCML蛋白和m RNA的表达,并能降低其启动子甲基化水平以及细胞核中甲基化活性。同时,木犀草素也能抑制Hep G2细胞中Sp1的活性以及DNMT1的表达。si RNA干扰OPCML后,可逆转木犀草素对Hep G2细胞的生长抑制效应,上调细胞内Sp1表达后,同时伴有DNMT1表达增加及OPCML表达降低。此外,木犀草素也能上调裸鼠异种移植瘤中OPCML表达并抑制移植瘤生长的生长。以上结果表明木犀草素可能通过降低细胞内甲基化水平而上调OPCML基因表达,最终抑制Hep G2细胞生长增殖。     

欧前胡素通过ERK1/2信号保护心肌细胞低氧性损伤

目的:研究欧前胡素对低氧诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用和机制。方法:采用CO2-95%和N2-5%的细胞培养箱诱导H9c2大鼠心肌细胞建立心肌细胞低氧损伤模型,采用不同浓度的欧前胡素孵育细胞12、24 h,检测上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde MDA)的含量。采用MTT方法检测细胞的存活率,Annexin V/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡比例,蛋白质印迹法检测检ERK1/2蛋白的表达。结果:低氧处理H9c2心肌细胞12 h后,上清中LDH和MDA的含量分别为(523.28±90.29)U/L和(5.59±0.33)U/L,均明显高于对照组(P0.05),而SOD的含量[(12.23±1.38)U/mg]明显低于对照组(P0.05)。低、高浓度欧前胡素孵育12 h后,细胞存活率分别为(64.51±2.78)%和(73.22±3.56)%,低、高浓度欧前胡素孵育24 h后,细胞存活率分别为(80.21±4.67)%和(87.38±5.41)%,均较与模型组显著升高(P0.05)。高浓度欧前胡素孵育12 h和24 h后凋亡细胞比例分别为(39.67±4.11)%和(49.61±3.39)%,均较模型组显著降低(P0.05),10μmol/L的PD98059阻断ERK1/2信号通路后细胞存活率均较高浓度欧前胡素组显著降低,凋亡细胞比例较高浓度欧前胡素明显升高(P0.05)。高浓度欧前胡素孵育12 h和24 h后,ERK1/2蛋白相对表达量分别为(1.92±0.09)和(2.42±0.21),与模型组相比均显著增加(P0.05)。结论:欧前胡素可能通过活化ERK1/2信号通路保护低氧诱导的心肌细胞损伤。     

1-磷酸鞘氨醇(S1P)对H9c2心肌细胞肥大反应的保护作用

目的:研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)对H9c2心肌细胞肥大反应的影响。方法:将培养的H9c2心肌细胞随机分为4组,即正常对照组、S1P(1μmol/L)处理组、苯肾上腺素(PE,100μmol/L)处理组、PE(100μmol/L)加S1P(1μmol/L)处理组,每组设3个复孔。处理24 h后应用Actin-Trakcer Green免疫荧光染色检测各组心肌细胞形态大小;Real-Time PCR技术测定各组H9c2心肌细胞中肥大标志物ANP、BNP及β-MHC的转录水平;Western印迹法测定各组中ANP的蛋白表达情况。然后将H9c2心肌细胞随机分为5组,即正常对照组、PE(100μmol/L)组、PE(100μmol/L)加低浓度S1P(0.1μmol/L)组、PE加中浓度S1P(1μmol/L)组、PE加高浓度S1P(10μmol/L)组,每组设3个复孔。处理24 h后应用Western印迹法测定低、中、高浓度S1P干预下磷酸化的Janus激酶2(JAK2)及信号转导和转录激活子3(STAT3)的蛋白表达水平。每项试验独立重复三次。结果:与正常对照组比较,PE组的H9c2心肌细...