获得控制细菌固氮的基因——固氮微生物学的重要成果

一切固氮微生物的固氮作用都是受固氮基因(nif)所控制。近年成功地从这些微生物(如Kl.Pneumoniae)分离到决定固氮能力的基因,并且把它们引入到大肠杆菌中,也已成功地被引入到酵母中,这是当前固氮微生物研究的一项重要进展。现在已鉴别固氮基因由17个基因组成。它们是以基因群的形式分布,7个或8个操纵子,保证同时合成这些基因的某些产品即固氮酶。已鉴定了三个基因是控制固氮酶的合成,如nifH     

固氮基因转移的研究进展

生物学家特别是微生物学家、生物化学家、分子遗传学家十分注视生物固氮和固氮基因转移问题。目标是。如何把原核生物系统的固氮基因转移到高等植物特别是粮食作物中去,使它们能自主地进行共生固氮作用。实现这个目标还不是眼前的事,有的科学家认为,需要10年左右的时间才能达到这一目标。美国哈佛大学(F.M.Ausubel)、Cornell大学(A.A.Szalay)等已成功地将固氮基因(来自土壤中能够固氮的Klebsiella)     

固氮基因转移的研究进展

生物学家特别是微生物学家、生物化学家、分子遗传学家十分注视生物固氮和固氮基因转移问题。目标是。如何把原核生物系统的固氮基因转移到高等植物特别是粮食作物中去,使它们能自主地进行共生固氮作用。实现这个目标还不是眼前的事,有的科学家认为,需要10年左右的时间才能达到这一目标。美国哈佛大学(F.M.Ausubel)、Cornell大学(A.A.Szalay)等已成功地将固氮基因(来自土壤中能够固氮的Klebsiella)     

城市景观水体中固氮微生物多样性及固氮活性检测

为探究城市景观水体中固氮微生物群落结构、多样性及固氮活性, 揭示水体中固氮蓝藻的固氮贡献, 研究选取新乡市牧野湖和人民公园水体两个小型水体进行研究。通过理化指标测定, 发现两个水体均处于富营养化状态, 借助高通量测序, 对两水体中微生物的16S rDNA和固氮酶nifH基因进行测序, 并利用乙炔还原法测定水体中固氮微生物的固氮速率。结果表明: 牧野湖水体中的原核生物类群共检测出32个门, 275个属; 固氮微生物共检测出9个门, 66个属。人民公园水体中的原核生物类群共检测出31个门, 238个属; 固氮微生物共检测出4个门, 13个属。固氮蓝藻在两个水体固氮微生物类群中分别占有3%和9.3%, 牧野湖固氮微生物丰富度相对较高, 与人民公园水体固氮微生物多样性差异较大。乙炔还原法测固氮速率结果显示, 两水体均未检测到固氮活性, 推测在富营养化的水体中固氮活性可能被抑制。     

共生固氮微生物与农作物

固氮蓝细菌与满江红、苏铁共生,还与真菌、苔藓、裸子植物和被子植物某些种属建立共生固氮体系;此固氮蓝细菌是地球上最早的绿色自养原核生物,行光合作用和放氧;还具共生固氮(N2)功能。已从那些固氮微生物中获得固氮基因,若能通过某种分子载体转移到水稻、小麦等粮食作物体内而获得有效表达的话,那将会使那些转基因作物实现氮素营养自给,这将导农业生产一场革命,这是研究所关注的一个重要方面;     

三峡库区水体中固氮微生物多样性及其影响因素

【目的】研究分析不同时空条件下三峡库区水体固氮微生物多样性,并探讨其与地球化学参数的相关性。【方法】采集三峡库区不同时间(三月份和六月份)和空间(干流与支流)的水体样品,对其进行地球化学参数分析,并通过构建克隆文库分析样品中固氮功能基因(nifH)的多样性进而探讨其与水体地化参数的相关关系。【结果】统计分析显示三峡库区水体固氮微生物α-多样性和群落组成具有时空差异。支流水体样品的固氮微生物α-多样性高于干流水体样品;六月水体样品的固氮微生物α-多样性高于三月水体样品。三峡库区三月水体样品中的固氮微生物群落以Proteobacteria (50.3%)和Firmicutes (40.0%)为主;六月水体样品的固氮微生物群落以Proteobacteria(48.4%)、Firmicutes(25.4%)和Cyanobacteria(19.0%)为主。Mantel检验结果显示:固氮微生物群落结构的差异与温度、pH和DIC等地球化学参数具有显著(P0.05)相关性,其中温度和pH的相关性系数最大。【结论】三峡库区固氮微生物的种群结构和多样性具有时空差异,影响三峡水库水体中固氮微生物群落结构与多样性的主要环境因素为温度和pH,同时浊度、DIC、氨氮也对库区水体固氮微生物群落结构和多样性有一定的影响。     

根瘤菌结瘤基因研究的新突破

根瘤菌是能侵入合适寄主植物根部并形成根瘤的一类细菌。由于在根瘤中,根瘤菌可以大量固定大气中的氮,因而在生物固氮研究中具有重要地位。过去十年中,由于分子生物学技术的进展使我们对根瘤菌遗传的各个方面有了许多了解。在一些根瘤菌中,成功地识别、分离了与共生固氮有关的基因。这些基因中有一类是与根瘤菌固氮能力有关的,统称为固氮基因(Fix基因)其中偏码固氮酶的结构基因nif HDK在所有已检查过的固氮微生物中具     

豆科植物—根瘤菌共生固氮的基因调控和转移

豆科植物-根瘤菌共生固氮是由寄主与细菌双方基因共同参与完成的,在相互基因调控中形成特导的结构—根瘤。参与根瘤菌固氮(nif基因)和结瘤(nod基因)的基因已被克隆和分析。     

巴西固氮螺菌Yu62glnB基因的克隆及其功能分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌Yu62的基因文库中,筛选到glnB基因的阳性克隆,将3.7kb/EcoRI PstI的阳性克隆亚克隆到pUC19中,进行了全序列分析,其在GenBank中的登记号是AF323960。DNA序列分析表明该阳性克隆含有完整的glnB基因,glnB基因下游是编码谷氨酰胺合成酶（GS）的glnA基因,glnB基因上游是一个编码未知蛋白的ORF。glnB基因编码区长336bp,编码112个氨基酸,与肺炎克氏杆菌、大豆慢生根瘤菌、豌豆根瘤菌及大肠杆菌在氨基酸顺序的同源性分别高达71%、77%、79%和69%。将卡那霉素抗性片段（Km-cassette)插入glnB基因的BglII位点,通过三亲杂交法将其引入到巴西固氮螺菌Yu62中,通过同源重组,获得GlnB^-突变株（glnB::Km）。为进一步分析glnB基因的功能,将glnB基因的编码区（339bp）构建在pVK100中,置于Km启动子下组成型表达,形成重组质粒pVK-II。将重组质粒pVK-II转入到GlnB^-突变株,构建成互补株C-glnB(glnB:Km/glnB)。对GlnB^-突变株和互补株的固氮酶活性和生长性能的测定表明,GlnB^-突变体无固氮酶活性,即表型为Nif^-;而互补株像野生型菌株一样具有固氮酶活性。突变株、互补株及野生型在菌落生长速度上基本相同。将含有glnB基因的重组质粒pVK-II分别转移到野生型Yu62菌株和具有一定抗铵能力的DraT^-突变标中,使glnB基因的拷贝数增加,并进一步比较它们的固氮酶活性,结果表明多拷贝的glnB基因能显著提高固氮酶活性。     

用遗传工程技术强化水稻结合性固氮的研究

本文介绍甘蔗、玉米、水稻等粮食作物和经济作物根际固氮微生物及固氮活性的存在,阐明水稻可以根据这一存在,运用工程技术的成就,将固氮基因引入水稻根面细菌,强化水稻形成结合性固氮,以便为水稻提供氮素营养的可能性。试验证明,带有固氮基因质核粒(PRD_1)转入根面受体菌或采用结合转移,均能获得成功。在获得转化体的同时,探讨培育抗氨、泌氨高效菌株的途径、提出水稻种子催芽拌种,或蘸根头肥时加入高效的固氮菌株以强化形成结合性固氮的可能性。     

野葛根际固氮微生物群落分布特征及其影响因素

【目的】研究野葛根际固氮微生物群落的空间分布特征,同时结合地理气候因子、土壤理化性质探讨影响野葛根际固氮微生物群落的空间分布特征的主要因素。【方法】在野葛广泛分布的广西、江西和湖南采集17份野葛根际土壤,测定土壤常规理化性质,进行基于MiSeq测序平台的nifH基因高通量测序,采用多元统计分析方法探索固氮微生物群落结构与环境因子之间的关系。【结果】不同采样区域固氮微生物α多样性无显著差异;同一采样区内各样点的固氮微生物群落结构与组成较相似,而不同采样区之间固氮微生物群落结构与组成差异较大,这表明固氮微生物群落存在明显的区域性分布特征。野葛根际土壤中固氮微生物主要归属于变形菌门(Proteobacteria)(相对丰度>60%),在目水平上,已注释出的固氮微生物主要归属于根瘤菌目(Rhizobiales)和伯克氏菌目(Burkholderiales)。根瘤菌目相对丰度在江西采样区最高,伯克氏菌目相对丰度在湖南采样区最高。pH、交换性钙、全钾、海拔和年平均气温对土壤固氮微生物群落结构的影响较大。优势种群伯克氏菌目与pH、交换性钙和全钾正相关,与C/N负相关;优势种群根瘤菌目与pH、交...     

巴西固氮螺菌中P_Ⅱ和P_Z在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌 (Azospirillumbrasilense)中 ,glnB和glnZ是两个高度同源基因 ,分别位于 3 7kb EcoRI+PstI和 3 7kb SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒 (Kmr cas sette)插入法 ,对glnB和glnZ分别进行定位诱变 ,并获得相应的突变株 ,即glnB- 和glnZ- 。研究表明 ,glnB- 突变株丧失固氮酶活性 ,表现为Nif- ,而glnZ- 象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能 ,将glnB和glnZ分别构建在pVK1 0 0载体上形成重组质粒pVK -Ⅱ和pVK -Z ,对glnB- 和glnZ- 突变株进行互补实验 ,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性 ,而glnZ无此作用。同时 ,通过三亲接合法将pVK -Ⅱ和pVK -Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT- 突变株中 ,使glnB和glnZ的拷贝数增加 ,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因 ,能显著提高固氮酶活性 ,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时 ,将pVK Ⅱ和pVK -…     

铜尾矿废弃地生物土壤结皮固氮微生物多样性

生物土壤结皮能够有效提高矿业废弃地有机质和氮的积累,促进植被的恢复.本研究基于固氮微生物的nifH基因多样性,以铜陵铜尾矿废弃地3种类型的生物土壤结皮(藻结皮、藓结皮和藻-藓混合结皮)为对象,利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术研究生物土壤结皮中固氮微生物的多样性以及废弃地植物群落发育对其产生的影响.结果表明： 尾矿库裸地表面的藻结皮的固氮微生物多样性最高,其次为维管植物群落下的藻-藓混合结皮,苔藓结皮的固氮蓝藻多样性最低;随着维管植物群落高度和盖度的增加,固氮微生物多样性降低,铜尾矿废弃地的pH、水分、有机质、养分含量(氮和磷)以及有效态和总重金属浓度对固氮微生物多样性的影响均不显著.测序和系统发育分析表明,废弃地结皮中固氮微生物以蓝藻为主,主要为不具有异形胞的丝状蓝藻.
     

巴西固氮螺菌中PⅡ和Pz在固氮调节中的不同使用

在巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense)中,glnB和glnZ是两个高度同源基因,分别位于3.7kgb/EcoRI PstI和3.7kb/SalI的两个不同的染色体片段上。用卡那霉素盒（Km^r-cas-sette)插入法,对glnB和glnZ分别进行定位诱变,并获得相应的突变株,即glnB^-和glnZ^-。研究表明,glnB^-突变株丧失固氮酶活性,表现为Nif^-,glnZ^-象野生型菌株一样具有固氮酶活性。为了进一步研究这两个基因的功能,将glnB和glnZ分别构建在pVK100载体上形成重组质粒pVK-Ⅱ和pVK-Z,对glnB^-和glnZ^-突变株进行互补实验,进一步证明了glnB与固氮酶活直接相关性,而glnZ无此作用。同时,通过三亲接合法将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT^-突变株中,使glnB和glnZ的拷贝数增加,进一步比较它们的固氮酶活性。结果表明多拷贝的glnB基因,能显著提高固氮酶活性,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响。同时,将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到nifA^-突变株中,结果表明glnB和glnZ均不能恢复nifA^-的固氮酶活性。     

巴西固氮螺菌中PⅡ和Pz在固氮调节中的不同作用

在巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)中,glnB和glnZ是两个高度同源基因,分别位于3.7kb/EcoRI+PstI和3.7kb/SalI的两个不同的染色体片段上.用卡那霉素盒(Kmr-cas-sette)插入法,对glnB和glnZ分别进行定位诱变,并获得相应的突变株,即glnB-和glnZ-.研究表明,glnB-突变株丧失固氮酶活性,表现为Nif-,而glnZ-象野生型菌株一样具有固氮酶活性.为了进一步研究这两个基因的功能,将glnB和glnZ分别构建在pVK100载体上形成重组质粒pVK-Ⅱ和pVK-Z,对glnB-和glnZ突变株进行互补实验,进一步证明了glnB与固氮酶活有直接相关性,而glnZ无此作用.同时,通过三亲接合法将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到巴西固氮螺菌野生型Yu62和具有一定抗铵能力的draT-突变株中,使glnB和glnZ的拷贝数增加,进一步比较它们的固氮酶活性.结果表明多拷贝的glnB基因,能显著提高固氮酶活性,而多拷贝的glnZ对固氮酶活性无影响.同时,将pVK-Ⅱ和pVK-Z分别转移到nifA-突变株中,结果表明glnB和glnZ均不能恢复nifA-的固氮酶活性.     

三江源地区不同植被土壤固氮微生物的群落结构研究

利用PCR_RFLP和测序分析法对位于青藏高原腹地三江源自然保护区的高寒草甸、高寒草原和高山森林等不同植被类型的土壤固氮微生物的群落组成进行了探讨。经过PCR_RFLP分析固氮基因nifH ,在3个样品中共得到2 33个克隆和99个可操作分类单元(OTUs) ,NQ_1样地具有最多的克隆数和OTUs,多样性为4 9 74 % ,在所有样品中分别具有1～2个明显的优势种群(占总克隆数>15 % ) ,并且具有4个共同的OTUs。选取了2 6个克隆进行基因测序分析,通过DNAMAN比较表明,这些序列间具有6 6 %～98%的相似性,并且在GenBank数据库中没有发现完全匹配的序列,因此这些序列可能代表着新的固氮生物株系。最后利用ClustalW与Mega软件构建了系统发育树,结果发现,这些序列被分为4个不同的簇,部分序列与属于蛋白细菌(Proteobacteria)的已知细菌具有近的亲缘关系,但是更多的序列与已知细菌具有较远的亲缘关系,而且nifH基因序列的分布在样地间没有明显的聚类     

日勾维肠杆菌中固氮基因表达的调节

用^(32)P中标记的nifHDK和nifA基因探针与日勾维肠杆菌(E.gergoviae 57-7)DNA杂交,证明在E.gergoviae 57-7中存在类似nifHDK及nifA的基因.经接合转移法把nifHpromotor:IacZ融合子引入E.gergoviae 57-7,在转交子中可测到较高的β-半乳糖苷酶活性,表明在E.gergoviae 57-7中类似nifA基因对固氮基因表达的调节特性与K.pneumoniae的类似.载有组成型表达nifA基因的质粒pCK3经接合转移法引入E.gergoviae 57-7,转交子生长速率与野生型相似,在高氨下合成固氮酶并能恢复50%以上的固氮活性.     

亚热带分层水库固氮微生物时空分布格局

生物固氮作用是水生态系统氮元素的重要来源途径之一,通常通过固氮微生物实现。但是,目前人们对亚热带分层水库固氮微生物多样性、分布和丰度认识还非常有限。以厦门市汀溪水库为例,基于固氮基因(nifH)综合应用克隆文库、定量PCR、定量RT-PCR研究固氮微生物在不同季节和不同水层的时空分布格局与演替规律。结果表明,汀溪水库具有丰富多样的固氮微生物,包括蓝藻、α-变形菌、β-变形菌、γ-变形菌、厚壁菌,以及少量未知的固氮细菌和序列;固氮微生物的群落组成、丰度、多样性和活性均呈现显著的时空差异。春、夏和秋3季表层和底层蓝藻nifH基因序列所占比例均超过50%,其中表层高于底层;冬季表层和底层蓝藻OTU数目比例超过50%。聚类分析表明,冬季表层和底层群落汇聚为一类;春、夏和秋三个季节表层首先聚为一类,然后与底层分别汇为一支。汀溪水库热分层时期的固氮微生物群落组成的空间差异大于季节差异,而且表层水体蓝藻在所有固氮微生物中占据绝对优势地位。相关分析表明,固氮微生物RNA丰度和RNA/DNA分别与氨氮、水温显著负相关;固氮微生物DNA丰度与溶解氧、pH、叶绿素a显著负相关,与硝氮显著正相关。综上所述,亚热带水库热分层对固氮微生物的群落结构具有显著的影响,在水库环境保护和生态管理中,特别是蓝藻水华防控时,要充分考虑水体热分层的生态效应。     

不同时期艾比湖湿地盐角草群落土壤固氮微生物的多样性分析

【目的】研究新疆艾比湖湿地不同季节盐角草根际和非根际土壤固氮微生物的多样性和丰富度与环境因子的相关性,以期探究在荒漠化和盐渍化不断严重的艾比湖湿地中随着季节变化的固氮微生物群落对恢复生态功能起到的潜在作用,为后续的湿地保护和退化恢复工作提供理论支持和数据基础。【方法】应用Illumina HiSeq PE250测序技术,分析6个土壤样本固氮微生物的多样性,结合相关的理化因子并利用RDA分析法探究土壤理化性质和固氮微生物菌落结构及丰富度的相关性。【结果】艾比湖湿地盐角草植物根际土壤的固氮微生物多样性高于非根际土壤,7月的土壤固氮微生物多样性高于10月和4月的土壤。土杆菌属(Geobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、固氮菌属(Azotobacter)和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)等为盐角草根际和非根际土壤中的共同优势菌属。这些固氮微生物优势菌属隶属于变形菌门(Proteobacteria)和蓝藻门(Cyanobacteria),且相对丰富度占比为85%和10%,其余各菌门共占比较少,仅为5%。土壤中固氮微生物的优势菌群与碱解氮(AN)、全氮(TN)、速效钾(AK)和有效磷(TP)呈显著相关。【结论】随着时间的推移土壤样本中固氮微生物的多样性和群落结构也发了改变,同一时期植物根际与非根际土壤中固氮微生物的群落结构并不相同。土壤的环境因子与固氮细菌的群落结构和丰富度的相关性研究可以为艾比湖湿地的退化恢复提供数据基础和理论支持。     

呼伦贝尔沙地不同植被恢复模式对土壤固氮微生物多样性的影响

利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术及扩增产物序列分析方法,研究了经过4年不同植被恢复模式下呼伦贝尔沙地土壤固氮微生物的nifH基因多样性和群落结构的变化.结果表明:不同植被恢复模式间土壤固氮微生物群落组成差异显著.混播柠条+羊柴+冰草+披碱草模式(ACHE)下的土壤固氮微生物nifH基因多样性指数最高,其次为混播柠条+冰草(AC)、单播柠条(UC)、单播冰草(UA)和单播羊柴(UH)模式,对照(裸地)最低.除单播羊柴(UH)模式与对照的多样性指数差异不显著外,其余4种植被恢复模式均显著高于对照.单一恢复模式(UA、UH、UC)下,绝大多数土壤固氮微生物属于蓝藻门,结构比较单一;而混播模式(AC和ACHE)下,土壤固氮微生物组成发生明显变化,以变形菌门为主,还包含蓝藻门,其种类增加,多样性提高.不同植被恢复模式的速效磷(AP)、全磷(TP)、全氮(TN)和硝态氮(N03-N)对固氮微生物区系的影响均达到显著水平,且AP、TP、TN和NO3--N之间均具有显著相关性.不同植被恢复模式下土壤固氮微生物区系组成的变化是不同理化因子之间相互关联、共同影响的结果.