短短小芽孢杆菌启动子筛选载体的构建

为了筛选短短小芽孢杆菌强启动子元件,应用PCR技术从枯草杆菌168中分离出α-淀粉酶基因,用其作为报告基因与质粒pUB110和pKF3一起构建了启动子筛选载体pKB/A.将短短小芽孢杆菌细胞壁蛋白基因启动子引入该载体构建成重组质粒pKB/PA,电穿孔法转化短短小芽孢杆菌50后发现α-淀粉酶以活性形式分泌表达.结果表明短短小芽孢杆菌启动子筛选载体构建成功.     

双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定

利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终构建了双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体pSBPTQ。将VasostatinⅠ基因作为靶基因检测sacBp.s.、α-amyT和degQ在pSBPTQ进行外源基因表达时的功能,结果表明,在蔗糖诱导下,sacB启动子有效启动了Vasostatin I基因的表达和分泌,α-amy T提高了VasostatinⅠ基因的转录效率,而degQ明显增强了VasostatinⅠ基因的表达水平。VasostatinⅠ基因在蔗糖诱导下成功表达并分泌到枯草杆菌细胞外,蛋白质分泌效率达到90%左右。质粒稳定性试验结果表明,经过40个世代之后,质粒pSBPTQ在枯草杆菌DB1342中仍旧保持在83%以上。     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α－淀粉酶基因在枯草杆菌中的表达和分泌

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克隆了枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列,将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ３１酶切,Ｔ４ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ⅱ及ｐＵＳＡ１８６Ⅰ系列质粒,将这些重组质粒转化枯草杆菌ＱＢ１１３０（ａｍｙ－）后都能向胞外分泌淀粉酶,酶活测定结果表明,基因表达水平比用原有的启动子高１－２倍,蛋白质分泌率在８４－９６％之间。     

地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。     

枯草杆菌α－淀粉酶基因的克隆和表达

以自构的质粒pBEl为载体,采用鸟枪法克隆枯草杆菌168突变株GRl0的α－淀粉酶基因,获得了在大肠杆菌中的表达。该基因片段位于7367bp的Bgl Ⅱ酶切片段上。利用质粒pUB110。将此片段亚克隆到枯草杆菌中,同样也获得了表达。本文还测定了该基因克隆子是否有GR10的抗葡萄糖阻遏效应。     

短短小芽孢杆菌大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建

应用PCR技术从具有分泌蛋白能力强且没有胞外蛋白酶活性的短短小芽孢杆菌50中分离出细胞壁蛋白基因的多启动子和信号肽编码序列,利用它与质粒pUB110和pKF3-起构建成穿梭分泌表达载体pBKE50,将α0淀粉酶基因引入该载体转化短短小芽孢杆菌50后,发现α－淀粉酶可以活性形式分泌表达,此工作为下一步建立短短小芽孢杆菌高效分泌表达系统奠定了基础。     

分泌载体pUS186的构建及地衣杆菌α—淀粉酶基因在枯草杆菌中的表…

利用枯草杆菌的分泌系统构建分泌型表达载体表达和分泌外源基因产物具有重要的商业价值。我们用鸟枪法克枯草杆菌染色体的启动子和信号肽序列。将克隆的序列连接到能在枯草杆菌中复制的质粒ｐＵＢ１８上,获得分泌型表达载体ｐＵＳ１８６。为了测试构建的载体ｐＵＳ１８６的功能,将地衣杆菌α－淀粉酶基因的缺失了启动子和信号肽序列的片段重组进该质粒,经过Ｂａｌ ３１酶切,Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶补齐等处理,获得ｐＵＳＡ１８６Ｉ     

猪生长激素cDNA在芽孢杆菌中的表达

利用随机克隆的枯草杆菌启动子-信号序列构建茅孢杆菌分泌载体pUS186。用限制酶将切除了信号序列的猪生长激素cDNA从质粒pLY3-PGH 604切下,亚克隆至pUS186,并在该cDNA的下游接上地衣杆菌α-淀粉酶基因的转录终止子,构建猪生长激素表达质粒pSGH 1864,将此质粒转化蛋白酶双缺陷的枯草杆菌DB104及短小茅孢杆菌289。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检出在发酵上清液中多出一条22kD的蛋白带,抗猪生长激素血清免疫印迹法证明这一蛋白带具有免疫活性,表明猪生长激素cDNA已在枯草杆菌及短小茅抱杆菌中表达。     

地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶异源表达研究

目的：以地衣芽孢杆菌高温α-淀粉酶基因（amyL）为报告基因,构建含不同启动子的枯草杆菌表达载体,转化枯草杆菌,并对重组菌的酶活进行分析,比较不同启动子对amyL基因在枯草杆菌中表达的影响。方法：以高温α-淀粉酶高产菌株B.licheniformis0204染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyL并分别与PQ启动子和P43启动子进行连接构建表达载体pUB-PQ-amyL和pUB-P43-amyL,化学法转化枯草杆菌1A717,筛选得到重组转化子后对重组菌的表达产物进行SDS-PAGE和酶活检测。结果：重组菌摇瓶发酵105h后测定高温α-淀粉酶酶活,B.subtilis1A717（pUB-PQ-amyL）的最高酶活为280.1U/mL,B.subtilis1A717（pUB-P43-amyL）的最高酶活为190.5U/mL。结论：PQ启动子调控的高温α-淀粉酶最高表达水平是P43启动子调控的最高表达水平的1.47倍,说明PQ启动子能使amyL基因在枯草杆菌中更高效地表达。     

地衣形芽孢杆菌热稳定α-淀粉酶基因的分子克隆及其在枯草杆菌中的表达

以E.coli噬菌体λ EMBL 3为载体,用鸟枪法将地衣形芽孢杆菌的热稳定α-淀粉酶基因克隆到λ噬菌体的基因组中。携带α-淀粉酶基因的杂种噬菌体λ pAmy_αL16的DNA,经限制性内切酶HindⅢ水解后,被亚克隆到枯草杆菌的质粒pNQ 122上,并得到了表达。通过重转化作用和物理图谱分析,证明α-淀粉酶基因位于3.9 kb的Hin dⅢ DNA限制片段上。 转化子枯草杆菌(pAmy_αL41)产生的α-淀粉酶的热稳定性、最适反应温度等与亲本菌株一致。α-淀粉酶的分子量和等电点也与原菌株相同。     

以β-半乳糖苷酶为报告基因的原核启动子检测体系构建

目的:以β-半乳糖苷酶为报告基因构建原核启动子检测体系.方法:以由质粒 pDL 扩增获得的 bgaB 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBEB.将组成型启动子P43和诱导型启动子Pcpac克隆入 pBEB,得到重组表达载体 pBEBP43 和 pBEBPapac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.结果:两种不同类型的启动子均能在大肠杆菌 BL21 和枯草芽孢杆菌 1A751 中启动 bgaB 基因的表达.结论:成功构建具有较为广泛适用性的原核启动子检测体系.     

PspA外源表达对枯草芽孢杆菌168蛋白质分泌的影响

PspA同源物广泛存在于细菌和高等生物的组织中.在本研究中克隆了来源于地衣芽孢杆菌的PspA基因,并将其克隆于用于大肠-芽孢穿梭诱导表达载体pDG-StuI中构建重组质粒pDG-PspA.将构建的诱导表达型的重组质粒转化到Bacillus subtilis 168中,研究PspA的外源表达对该菌的生长,总蛋白分泌,以及Sec分泌途径中α-淀粉酶分泌的影响,结果表明,PspA基因的外源表达,在发酵过程后期能在一定程度上提高总蛋白的分泌量,在发酵过程后期能在一定程度上提高分泌的α-淀粉酶浓度.     

人工合成的植物化猪α乳清蛋白基因在转基因拟兰芥的表达

将一个398bp的植物化的猪α乳清蛋白基因(Lactalbumin,LA)编码区克隆到带有花椰菜花叶病毒的35S启动子的质粒中。对它们进行PCR检测和序列分析,证实这些阳性克隆是实验预期的重组质粒。随即将35S启动子-α-乳清蛋白基因-终止子这一表达单元克隆到双元载体pCG-CB中,用该重组质粒双元载体pCG-CB-Lact转化农杆菌V3101后,以农杆菌法进行拟兰芥植物转化,用除草剂Finale对转化植物进行抗除草剂基因筛选,得到一些抗除草剂的转化植株。对这些抗除草剂植株进行猪α乳清蛋白基因PCR分析,成功筛选到带有猪α乳清蛋白基因并且可以在后代稳定遗传的转基因植物。Western blot蛋白质表达分析,表明猪α乳清蛋白在拟兰芥中成功表达,并且猪仅乳清蛋白被正确加工成天然蛋白。     

长双歧杆菌NCC2705高效转化系统的建立及GFP表达

目的:建立长双歧杆菌NCC2705高效稳定的电转化系统,并以其为宿主表达绿色荧光蛋白(GFP),构建一个稳定的带报告基因的表达载体。方法:从双歧杆菌克隆载体pDG7中切取其在双歧杆菌中复制所必需的pMB1复制子插入质粒pUC19的多克隆位点区,并将gfp基因在双歧杆菌中进行表达;设计双歧杆菌电击转化体系,研究在不同电击电压条件下的电转效率。结果:首先构建了大肠杆菌-长双歧杆菌穿梭质粒pUB1和带有gfp基因的表达质粒pUB2,用电击法将之转化至双歧杆菌,当细菌生长到D600nm约为0.5时制备感受态细胞,在电容25μF、电阻200Ω、电压12.5 kV/cm的电击条件下进行完整质粒转化,可得到较高的转化率。结论:构建了以长双歧杆菌NCC2705为宿主的高效稳定的表达系统,为进一步研究益生菌的分子生物学和功能特性提供了基础。     

中性蛋白酶基因诱导型表达分泌载体的构建

利用PCR方法分别扩增出sacB基因的启动子-信号肽序列（sacR）和枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的前肽-成熟肽序列,将两者连接后克隆入载体pHP13中,构建了含有中性蛋白酶基因的诱导型表达分泌载体pHP13SN,再将其转化入枯草杆菌DB104,获得基因工程菌DB104(pHP13SN)。中性蛋白酶基因在蔗糖的诱导和sacR的调控下实现了分泌表达,并获得了具有生物学活性的中性蛋白酶。     

高温α-淀粉酶高表达的研究

为了进一步提高工业上重要的地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶(BLA)的发酵生产性能,以高温α-淀粉酶基因(amyL)为目的基因,构建地衣芽胞杆菌高温α-淀粉酶基因产生菌的整合表达通用性质粒pB li16 s-amyL-EryR,采用原生质体转化法将此整合型表达质粒导入B.licheniformis CBBD302,在整合表达质粒中的16SrDNA序列的介导下实现了同源整合。挑选20株阳性转化子,分别通过提高培养基中红霉素的使用浓度,增加染色体上目的基因amyL的拷贝数,由此获得的重组菌的BLA生产水平提高了56.37%~80.29%。     

西方许旺酵母α-淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的分泌表达

目的:将带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因克隆到大肠杆菌中,验证西方许旺酵母α-淀粉酶基因能否在大肠杆菌中有效表达。方法:利用PCR扩增带有完整自身信号肽的西方许旺酵母α-淀粉酶基因,并将其接入Zeocin启动子片段,构建了重组表达载体GapZA,转化大肠杆菌,验证得到的阳性克隆菌株是否表达α-淀粉酶活性。结果:阳性克隆菌株均有α-淀粉酶活性。结论:证明了许旺酵母α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞外,并且表现出明显酶活。     

α淀粉酶和糖化酶在酿酒酵母中的表达和分泌

将地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因及黑曲霉糖化酶cDNA重组进大肠杆菌-酵母穿梭质粒,转化酿酒酵母,构建能分解淀粉的酵母工程菌。酶活力测定和酶学性质分析的结果显示:在酵母MF-α1因子及磷酸甘油酸激酶基因的启动子和终止信号的调控下,α-淀粉酶和糖化酶基因在酵母中获得高表达并向胞外分泌这两种酶。构建的酵母工程菌在含10％淀粉的培养基中6天内能水解97％的淀粉,重组质粒能在酵母中较稳定地存在。     

以绿色荧光蛋白为报告基因的原核启动子检测体系构建

以质粒pMUTIN-GFP 扩增获得的目的gfp 基因为报告基因,将其克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建成一个具有启动子活性检测功能的重组质粒pBE2-GFP .将组成型启动子P43和诱导型启动子Pspac克隆入pBE2-GFP ,得到重组表达载体pBE-GFP-P43和pBE-GFP-Pspac,转化至大肠杆菌和枯草芽孢杆菌.荧光显微镜检测GFP 蛋白的表达情况.结果 表明,2种不同类型的启动子均能在大肠杆菌BL21和枯草芽孢杆菌1A751中启动gfp 基因的表达.     

双启动子对重组溶源性枯草杆菌中外源蛋白表达的增强作用

探讨了双启动子对基于溶源性噬菌体构建的重组枯草杆菌中外源蛋白表达的影响。分别将不含或含有本身启动子的α-淀粉酶基因(来源于Bacillus amyloliquefaciens)和青霉素酰化酶基因(来源于Bacillus megaterium)克隆到溶源性枯草杆菌中,得到重组菌B.subtilisAMY1,B.subtilisAMY2,B.subtilisPA1以及B.subtilisPA2。由于同源重组,所克隆的片段整合到溶源性枯草杆菌中的噬菌体基因组上,并处于噬菌体强启动子的下游。在重组菌AMY1和PA1中,在热诱导的情况下外源基因的转录只受到噬菌体启动子的作用,而在重组菌AMY2和PA2中,在热诱导下外源基因的转录同时受到噬菌体启动子和基因本身所带启动子的作用。双启动子的应用使重组α-淀粉酶的表达量提高了133%,使重组青霉素酰化酶的表达量提高了113%。