小鼠Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的研究——Ⅰ.正常小鼠肝和Hep.A腹水肝癌染色质磷酸化非组蛋白的比较

研究了Hep.A腹水肝癌染色质磷酸化非组蛋白的变化。Hep.A肝癌染色质非组蛋白,磷酸化非组蛋白的含量以及非组蛋白被磷酸化的比例都较正常小鼠肝增加,分别达到正常肝的2.2,4.4和2.0倍。非组蛋白含磷量也增加,达到正常肝的1.36倍。结果表明HeP.A肝癌染色质非组蛋白磷酸化比例增加。但单位重量非组蛋白及磷酸化非组蛋白所含磷酸基团反而下降,仅分别为正常肝的65%和32%。Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的SDS-凝胶电泳图谱显示分子量为69,000道尔顿的蛋白部份明显增加,此外还有一正常细胞缺乏的分子量为47,000道尔顿的蛋白部份出现。等电聚焦电泳表明等电点偏低的蛋白部份增加。氨基酸组成分析证明两种细胞磷酸基团的接受体基本相同。实验结果表明Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白与正常小鼠肝有质与量的差别。     

小鼠Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的研究——Ⅱ.染色质结合的蛋白激酶和核内磷蛋白磷酸酶的研究

建立了简易的制备~(32)P-酪蛋白和测定核内磷蛋白磷酸酶的方法。测定了Hep.A腹水肝癌染色质结合的蛋白激酶和核内磷蛋白磷酸酶活性。Hep.A肝癌染色质结合的蛋白激酶比活性大于正常肝,但核内磷蛋白磷酸酶的比活性反低于正常。这是引起Hep.A肝癌染色质总磷酸化修饰程度增加,非组蛋白含磷总量增加的重要原因。Hep.A肝癌染色质磷酸化作用的增长低于非组蛋白量的增加,可能是引起单位重量磷酸化非组蛋白所含磷酸基团低于正常肝的原因之一。     

小鼠Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的研究——Ⅱ.染色质结合的蛋白激酶和核内磷蛋白磷酸酶的研究

建立了简易的制备~(32)P-酪蛋白和测定核内磷蛋白磷酸酶的方法。测定了Hep.A腹水肝癌染色质结合的蛋白激酶和核内磷蛋白磷酸酶活性。Hep.A肝癌染色质结合的蛋白激酶比活性大于正常肝,但核内磷蛋白磷酸酶的比活性反低于正常。这是引起Hep.A肝癌染色质总磷酸化修饰程度增加,非组蛋白含磷总量增加的重要原因。Hep.A肝癌染色质磷酸化作用的增长低于非组蛋白量的增加,可能是引起单位重量磷酸化非组蛋白所含磷酸基团低于正常肝的原因之一。     

正常小鼠肝和腹水型肝癌细胞核内酸溶性蛋白质磷酸化的比较研究

染色质的组成成分,组蛋白和非组蛋白在特异的蛋白激酶作用下可以发生磷酸化修饰,组蛋白和非组蛋白的磷酸化和脱磷酸化可能在染色质的结构,基因表达以及DNA复制中起着重要的作用。本文比较是小鼠腹水型肝癌细胞核和正常小鼠肝细胞核内酸溶性蛋白质及其磷酸化的差异。正常小鼠肝细胞核酸溶性蛋白质的电泳染色图谱有一条明显可见的组蛋白H_1~0蛋白带,而对小鼠腹水型肝癌来说,此带极浅,但在腹水型肝癌细胞核酸溶性蛋白质的电泳染色图谱上可见到表观分子量约为68K的一条蛋白带,而正常小鼠肝未见此带。此外,从电泳胶片~(32)P放射自显影图谱可见腹水型肝癌组蛋白H_1,H_2A和非组蛋白带Ⅱ(MW43K),带Ⅲ(MW.67K)带Ⅳ(M.w.97K)磷酸化程度明显高于正常小鼠肝。     

大鼠肝癌和正常肝染色质非组蛋白(HAP_2)的双向凝胶电泳比较~*

利用等电点聚焦(IEF)和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的双向电泳以及高度灵敏的银染色相结合的方法,对大鼠肝癌和正常肝染色质非组蛋白进行了对比分析。结果指出,在两个样品中均可看到五百个左右的蛋白点。关于这些蛋白点的分布,正常肝在较大分子量和较高等电点区域有较高的相对百分率,而肝癌在较低分子量和较低等电点区域有较高的相对百分率。与正常肝制品比较,肝癌制品中出现了一些独有的蛋白质点子,而在正常肝中原有的一些点子却消失了。     

海洋游仆虫细胞核染色质组分和组蛋白的初步研究

收集海洋游仆虫(Euplotes vannus)的细胞,制备其染色质。稀酸抽提染色质得到的组蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、等电点聚焦和氨基酸分析等方法测定,其核染色质中组蛋白占核总蛋白的69.6％;DNA:RNA:组蛋白:非组蛋白为1∶0.022∶1.1∶0.047。染色质的全组蛋白由16种氨基酸组成,碱性氨基酸与酸性氨基酸之比为1.06∶1,是一种弱碱性蛋白质。等电点为pH8.1—9.15,分子量为10,500—22,000道尔顿。     

实验性肝癌形成过程中染色质组分的量的变化

平行观察了三甲基奶油黄(3′-Me-DAB)诱发大鼠肝癌不同期的病理形态变化及染色质组分含量变化。染色质非组蛋白含量以及非组蛋白与组蛋白的比值,随细胞癌变而逐渐增加,而且这些变化出现在细胞形态变化之前。表明非组蛋白含量的增加和细胞基因表达失常、从而出现癌变有关。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅲ.正常小鼠肝和Hep A腹水肝癌中K型丙酮酸激酶同工酶的比较研究

从正常小鼠肝和Hep A 腹水肝癌中纯化了K 型丙酮酸激酶(PyK)。当比较这两种不同来源的PyK 时,发现下列各项指标均极为接近或完全相同。这些指标是:1.在磷酸纤维素柱上被相近浓度的KCl 洗脱下来。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率完全一致,两者混合样品在不同的电泳条件下均不能分开。3.两酶在50℃保温时的失活速度基本相同,半失活时间均为11.5分。4.两酶的pH 活性曲线几乎完全重合,其最适pH 均为7.4。5.六种氨基酸中的每一种对两酶的抑制百分率十分接近。Mg~( )或丝氨酸对两酶的激活也基本一致。6.两酶对底物PEP 和ADP 均呈正协同别构效应,不论PEP 或ADP 的Hill 氏系数(η_H)S_(0.5)和K_(0.5s)也十两分接近。7.苯丙氨酸对两酶均呈别构抑制效应,其η_H或表观Ki 也基本相同。8.ATP 对酶均呈别构抑制效应,两酶的Hill 氏曲线互相平行,且几乎重合。(9)用葡聚糖G-200凝胶过滤法测得正常小鼠肝和Hep A 中K 型PyK 的分子量分别为224,000及210,000道尔顿,其差别在实验误差范围内。(10)用双相免疫扩散鉴定,两酶都能和兔抗大鼠M 型PyK 抗体起沉淀反应,且沉淀线完全吻合。总结上述结果,证明肝癌细胞中K-PyK 与正常小鼠肝脏中的K-PyK 具有相同的性质,表现相似的动力学,提示它们很可能具有相同的结构,也即可能是同一种酶。癌细胞的基因表达产物既与正常相同,说明癌细胞中PyK 同工酶活性的改变可能是由于基因调控的失常而不是结构基因本身DNA 中碱基顺序的改变。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅲ.正常小鼠肝和Hep A腹水肝癌中K型丙酮酸激酶同工酶的比较研究

从正常小鼠肝和Hep A腹水肝癌中纯化了K型丙酮酸激酶(PyK)。当比较这两种不同来源的PyK时,发现下列各项指标均极为接近或完全相同。这些指标是:1.在磷酸纤维素柱上被相近浓度的KC1洗脱下来。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率完全一致,两者混合样品在不同的电泳条件下均不能分开。3.两酶在50℃保温时的失活速度基本相同,半失活时间均为11.5分。4.两酶的pH活性曲线几乎完全重合,其最适pH均为7.4。5.六种氨基酸中的每一种对两酶的抑制百分率十分接近。Mg~( )或丝氨酸对两酶的激活也基本一致。6.两酶对底物PEP和ADP均呈正协同别构效应,不论PEP或ADP的Hill氏系数(η_H)S_(0.5)和K_(0.5s)也十两分接近。7.苯丙氨酸对两酶均呈别构抑制效应,其η_H或表观Ki也基本相同。8.ATP对酶均呈别构抑制效应,两酶的Hill氏曲线互相平行,且几乎重合。(9)用葡聚糖G-200凝胶过滤法测得正常小鼠肝和Hep A中K型PyK的分子量分别为224,000及210,000道尔顿,其差别在实验误差范围内。(10)用双相免疫扩散鉴定,两酶都能和兔抗大鼠M型PyK抗体起沉淀反应,且沉淀线完全吻合。总结上述结果,证明肝癌细胞中K-PyK与正常小鼠肝脏中的K-PyK具有相同的性质,表现相似的动力学,提示它们很可能具有相同的结构,也即可能是同一种酶。癌细胞的基因表达产物既与正常相同,说明癌细胞中PyK同工酶活性的改变可能是由于基因调控的失常而不是结构基因本身DNA中碱基顺序的改变。     

HMG非组蛋白在基因表达调节中的作用——Ⅱ.正常大鼠肝和大鼠移植性BERH-2肝癌HMG非组蛋白比较研究

本实验通过5%过氯酸抽提、丙酮分级分离以及CM-Sephadex离子交换层析等步骤分别从正常大鼠肝和大鼠移植性肝癌(BERH-2)细胞核中获得了HMG蛋白,并且比较了它们的电泳和层析行为以及生物学作用,发现正常鼠肝和肝癌HMG没有明显的质的差别。比较了正常大鼠肝细胞核和BERH-2肝癌细胞核体外转录活性,并比较了DNA酶Ⅰ消化这两种细胞核的动力学和有限消化时释放出来的HMG和组蛋白H_1相对量的变化。发现肝癌细胞核转录活性明显高于正常大鼠肝细胞核;肝癌细胞核对DNA酶Ⅰ消化的敏感性大于正常肝细胞核;肝癌细胞核在DNA酶Ⅰ有限消化时HMG的释放较正常大鼠肝细胞核多。实验结果说明,在肝癌的细胞中HMG与正常肝细胞的HMG可能没有明显的质的差别,但与活性核小体结合的HMG量有所增加。这可能是肝癌染色质结构的改变,基因转录失常原因之一。     

组蛋白激活拟南芥CDPK催化CaMBP10的体外磷酸化反应

植物转脂蛋白 (plant lipid transfer proteins, LTPs) 是高等植物中广泛存在的多基因编码的小分子碱性蛋白. 本研究室已经证明白菜和豌豆LTPs可分别被内源胞浆可溶性和膜结合钙依赖性蛋白激酶 (calcium-dependent protein kinase, CDPK) 磷酸化. 为深入研究CDPK对白菜钙调素结合蛋白10 (calmodulin-binding protein-10, CaMBP10) 的磷酸化性质及特征, 本文从拟南芥可溶性蛋白粗提物中检测到1个分子量约为54 kD的CDPK对CaMBP10有磷酸化作用. 研究表明, 组蛋白可增强 CDPK对CaMBP10的磷酸化活性, 促进磷酸化进程. 而且组蛋白和Ca2+对CDPK具有协同调节效应, 二者共同作用时比Ca2+单独作用时, 激酶的活力增强约12倍. 此外, 不同组蛋白对CDPK的激活能力不同, 组蛋白1对该激酶活性的激活能力要比组蛋白3高约8倍.     

北京鸭卵清蛋白基因调控的研究——Ⅰ.停产与产蛋的北京鸭肝脏和输卵管染色质蛋白质的比较

从停产和产蛋的北京鸭的肝和输卵管制备纯染色质。用0.4NH_2SO_4抽提组蛋白和酸溶性非组蛋白,剩余的非酸溶性非组蛋白用牛胰DNaseI消化DNA法制备。对染色质大分子含量的测定表明,非组蛋白和RNA的含量在产蛋鸭染色质中明显地增加了。用乙酸脲电泳分析,核心组蛋白成份在所有实验样品中都是恒定的,但在产蛋鸭肝和输卵管染色质组蛋白H_1呈两条区带,并且出现较多条酸溶性非组蛋白区带。用SDS电泳分析,产蛋鸭肝和输卵管染色质中出现分子量约20,000的非酸溶性非组蛋白。非组蛋白的这些变化,启示它们可能是控制基因活性的调节因素。     

蚕丝腺体染色质的研究 Ⅲ.染色质功能与结构蛋白的关系

本文比较了五龄三天及眠期的蓖麻蚕后丝腺体染色质的结构蛋白与转录活性,结果表明非组蛋白的单相凝胶电泳有显著的变化,转录活性亦有差异。染色质经DNase Ⅱ处理后分离的可溶性染色质与不溶部分的染色质结构蛋白电泳图谱不同。对重组染色质的转录活性进行了研究,初步结果表明同源和异源的组蛋白对DNA 转录有抑制作用,去H_1的组蛋白抑制作用显著减少。非组蛋白能恢复部分被抑制的转录活性。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅰ.丙酮酸激酶和线粒体对ADP的竞争

以果糖-1,6-二磷酸(FDP)为底物,正常小鼠肝匀浆无克奈特瑞效应;但以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为底物,则在正常小鼠肝中也出现此效应;而小鼠Hep A腹水肝癌(简称Hep A)细胞匀浆中由这两种底物所引起的此效应均十分明显。Hep A中,丙酮酸激酶(PyK)的活性为正常小鼠肝的4.7倍。在研究PyK和克奈特瑞效应关系时发现:1.PyK的底物PEP可抑制线粒体中琥珀酸、丙酮酸和NADH的氧化,而琥珀酸和NADH又可抑制PEP的酵解;2.加入从Hep A中纯化的K型PyK,可抑制琥珀酸的氧化,加强PEP对琥珀酸氧化的抑制,且其对FDP氧化的抑制率和K型PyK的加入量成正相关;3.用L-苯丙氨酸抑制PyK后,可减小PEP对琥珀酸氧化的抑制,并使PEP的酵解降低;4.加入氧化磷酸化的解联剂2,4-二硝基酚(DNP),可使PEP的酵解随DNP浓度的增加而增加;(5)加入正常小鼠肝的线粒体,可使正常小鼠肝匀浆的呼吸增高,酵解降低;并使Hep A的克奈特瑞效应逆转。此外,加入外源性的ADP既可促进呼吸,又可促进酵解;加入可消耗ADP的磷酸肌酸和肌酸激酶,则使呼吸和酵解均降低。K型PyK加强PEP对琥珀酸氧化的抑制效率也和ADP的浓度密切相关。这些实验结果都证明:胞液中的PyK和线粒体之间存在着对ADP的竞争。并且胞液中增高的PyK对ADP的有效的夺取,很可能是导致癌瘤中克奈特瑞效应的一个要机理。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅰ.丙酮酸激酶和线粒体对ADP的竞争

以果糖-1,6-二磷酸(FDP)为底物,正常小鼠肝匀浆无克奈特瑞效应;但以磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为底物,则在正常小鼠肝中也出现此效应;而小鼠Hep A 腹水肝癌(简称Hep A)细胞匀浆中由这两种底物所引起的此效应均十分明显。Hep A中,丙酮酸激酶(PyK)的活性为正常小鼠肝的4.7倍。在研究PyK 和克奈特瑞效应关系时发现:1.PyK 的底物PEP 可抑制线粒体中琥珀酸、丙酮酸和NADH 的氧化,而琥珀酸和NADH 又可抑制PEP 的酵解;2.加入从Hep A中纯化的K 型PyK,可抑制琥珀酸的氧化,加强PEP 对琥珀酸氧化的抑制,且其对FDP 氧化的抑制率和K 型PyK 的加入量成正相关;3.用L-苯丙氨酸抑制PyK 后,可减小PEP 对琥珀酸氧化的抑制,并使PEP 的酵解降低;4.加入氧化磷酸化的解联剂2,4-二硝基酚(DNP),可使PEP 的酵解随DNP 浓度的增加而增加;(5)加入正常小鼠肝的线粒体,可使正常小鼠肝匀浆的呼吸增高,酵解降低;并使Hep A 的克奈特瑞效应逆转。此外,加入外源性的ADP 既可促进呼吸,又可促进酵解;加入可消耗ADP 的磷酸肌酸和肌酸激酶,则使呼吸和酵解均降低。K 型PyK 加强PEP 对琥珀酸氧化的抑制效率也和ADP 的浓度密切相关。这些实验结果都证明:胞液中的PyK 和线粒体之间存在着对ADP 的竞争。并且胞液中增高的PyK 对ADP 的有效的夺取,很可能是导致癌瘤中克奈特瑞效应的一个重要机理。     

蚕丝腺体染色质的研究——Ⅲ.染色质功能与结构蛋白的关系

本文比较了五龄三天及眠期的蓖麻蚕后丝腺体染色质的结构蛋白与转录活性,结果表明非组蛋白的单相凝胶电泳有显著的变化,转录活性亦有差异。染色质经DNase Ⅱ处理后分离的可溶性染色质与不溶部分的染色质结构蛋白电泳图谱不同。对重组染色质的转录活性进行了研究,初步结果表明同源和异源的组蛋白对DNA转录有抑制作用,去H_1的组蛋白抑制作用显著减少。非组蛋白能恢复部分被抑制的转录活性。     

喂二乙基亚硝胺大鼠肝染色质体外转录的研究

在二乙基亚硝胺(DENA)诱发大鼠肝癌过程中,无论在E.Coli RNA聚合酶或大鼠肝RNA聚合酶Ⅱ作用下,肝染色质的体外转录活性都比正常大鼠的高,并有随肝脏恶化程度而增高的趋势。进一步研究证明在RNA聚合酶Ⅱ作用下,喂DENA大鼠肝染色质的转录起始点数量比正常肝的多;而在E.Coli RNA聚合酶作用下,两种染色质的转录起始点数量未见明显差异,但喂DENA大鼠的肝染色质转录的RNA链较长。癌变过程中,肝染色质组蛋白及非组蛋白含量都无明显改变,而RNA含量则较正常肝略有增高。     

蟾蜍红细胞与网织红细胞染色质蛋白的比较研究——Ⅰ、非组蛋白蛋白质

从亚洲蟾蜍(Bufo bufo asiaticus)的成熟红细胞与网织红细胞中分离纯化了染色质非组蛋白(NHP),并在体外转录系统中比较了两类细胞的NHP对RNA合成的激活作用。实验结果表明:从网织红细胞中分离获得的NHP只能部份恢复被网织红细胞组蛋白抑制的模板活力,而成熟红细胞的NHP不仅能恢复被成熟红细胞组蛋白抑制的模板活力,而且还能恢复被网织红细胞组蛋白抑制的模板活力。此外,从聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱中也观察到这两类细胞的NHP的差异。     

与大鼠Morris肝癌7777相关的染色质蛋白的免疫亲和层析分离与鉴定

 用5mol/L尿素,将大鼠Morris肝癌7777染色质解离为染色质非组蛋白 (UP组分)及染色质沉淀(UC组分)。UP(含90—95％非组蛋白)用免疫亲和层析(与大鼠Morris肝癌7777去组蛋白染色质抗体交联)分级,经2mol/L NaSCN及8mol/L尿素分部洗脱。将UP及UC,来自UP亲和层析的2mol/L NaSCN及8mol/L尿素洗脱组分同时进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。以大鼠Morris肝癌7777去组蛋白染色质抗体作探针,进行免疫显迹(Immunoblot)测定。在UP部分出现二条阳性带,分子量为:200K及116K。UC部分有三条染色不很深的阳性带,分子量为200K,118K及91K。来自UP亲和层析的2mol/L NaSCN及8mol/L尿素洗脱部分分别有一条浓而清晰的阳性带,分子量分别为74K及83K。用酶联免疫吸附法(E1isa)测试从UP凝胶上切割下的阳性区带,其免疫特异性显著。     

人脑胶质细胞瘤核染色质非组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

用不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析了人脑胶质细胞瘤与正常脑细胞核NHCP电泳图谱。从二者的NHCP电泳结果表明,脑胶质细胞瘤增加了一条表观分子量为3万的蛋白区带;表观分子量为1.75万～6.5万的蛋白区带染色明显加深。染色质紫外吸收光谱也有明显差异。总之,脑胶质细胞瘤核NHCP发生质与量的变化。