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相似文献
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1.
麻蝇幼虫肠道蛋白酶BGP的分离纯化及性质   总被引:1,自引:0,他引:1  
棕尾别麻蝇幼虫肠液经SDS-PAGE后,X光片显影,呈现两条蛋白酶活性带.IEF后,两条蛋白酶活性带的等电点分别为pH7.7和6.8.麻蝇幼虫肠液经55%~75%硫酸铵沉淀,以及连续两次制备等电聚焦,分离纯化出等电点约为pH7.7,分子量约为35kD的蛋白酶BGP.该酶能分解酪蛋白和类胰蛋白酶专一底物Bz-Phe-Val-ArgNA,不能分解弹性蛋白酶专一底物elastin-CongoRed和类胰凝乳蛋白酶专一底物Suc(Ala)2Pro-PheNA.SBBI,Leupeptin和PMSF能强烈抑制其活性.专一底物和抑制剂的结果表明,BGP是一种类胰蛋白酶.其最适反应温度为50℃,最适作用pH为8.5.不耐高温,50℃保温30min活性急剧下降.Hg2+,Zn2+和Cu2+能抑制酶活性.Ca2+,Mg2+对酶无激活作用,EDTA无抑制作用.  相似文献   

2.
麻蝇幼虫肠液经硫铵沉淀, DEAE-Sephadex A-25离子交换层析, SBBI-Sepharose 4B亲和层析,分离纯化出一种分子量为 16kD的蛋白酶。底物及抑制剂的特异性表明,该酶为类胰蛋白酶。其能够强烈地降解蛋白酶非专一底物酪蛋白和 Hide powder azure,以及类胰蛋白酶专一底物 Bz-Phe-Val-Arg NA, Bz-Pro-Phe-Arg NA和Bz-Val-Gly-Arg NA.该酶又能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF,类胰蛋白酶抑制剂 SB-BI和Leupeptin强烈地抑制。蛋白酶在酸性环境下极不稳定,在弱碱环境(pH8.5-9.5)中活性最高。  相似文献   

3.
卢晓风  杨星勇 《动物学报》1998,44(4):406-412
巨尾阿丽蝇幼虫肠液SDS-PAGE后,X光片显影呈现3条蛋白酶活性带。IEF后出现2条蛋白酶活性带,等电点分别为PH8.5和PH7.7。肠液经硫铵沉淀,SephadexG-75凝胶过滤,SephadexDEAEA-25离子交换和SBBI-Sepharose4B亲和层析,分离化出分子量约为14KD的巨尾阿丽蝇蛋白酶。  相似文献   

4.
昆虫谷胱甘肽S-转移酶分离纯化的新方法   总被引:4,自引:0,他引:4  
谷胱甘肽S-转移酶(glutathioneS-transferases,GST)是一类具有多种生理功能的同功酶.从蜡螟幼虫(Galeriamelonela)的提取液中分离纯化谷胱甘肽S-转移酶的基本方法如下:首先将冷冻的蜡螟幼虫在磷酸缓冲液中匀桨,经10000g和100000g分级离心;取上清液通过QAE-SephadexA-25离子交换柱层析除去部分色素和杂蛋白;然后采用谷胱甘肽-琼脂糖凝胶亲和层析(GSH-QT4),四溴酚酞二磺酸盐-琼脂糖凝胶亲和层析(BSP-QT4),铜离子-琼脂糖凝胶螯合层析(Cu2+-QT4)及PBE94-Sepharose(PBE94)聚焦层析等层析技术进一步分离纯化.将上述方法获得的色谱峰以CDNB和DCNB为底物检测生物活性.具有生物活性部分的蛋白质,通过SDS-PAGE测定其分子量.实验结果表明,采用GSH-QT4亲和层析法获得的活性峰,在SDS-PAGE图谱上呈现出两条带,分子量为24kD,24.5kD左右;Cu2+-QT6螯合层析法分离的活性峰,呈现出一条带,分子量为24kD左右;PBE94-聚焦层析法分离获得三个活性峰:第一色谱峰,呈现出一条带,分子量为23kD左右  相似文献   

5.
分离和鉴定沙冬青抗冻蛋白质   总被引:3,自引:0,他引:3  
采用经典的蛋白质色谱技术,纯化沙冬青( Ammopiptanthus mongolicus (Maxim .) Chengf.) 叶片中的抗冻蛋白质,然后经非变性PAGE胶分离、回收,得到具有热滞活性的两条带:B1 和B3。前者在8 g/L时热滞活性为0.46 ℃,并在SDS_PAGE胶上分离出两条带( 分子量为67 kD和21 kD) ;后者在10 g/L时热滞活性为0.45 ℃,在SDS_PAGE胶上只有1 条带( 分子量为39.8 kD)。B1 和B3 均不能被Shiff 试剂染色,也不具有典型糖蛋白的紫外吸收特征,因而可能不是糖蛋白  相似文献   

6.
柑叶片蔗糖酶的分离纯化及其部分性质的研究   总被引:8,自引:0,他引:8  
柑(Citrusreticulata Blanco)幼叶中存在高活性的酸性蔗糖酶。经硫酸铵盐析、DEAE-琼脂糖离子交换层析、SephacrylS-200 凝胶层析纯化,活性回收率6.4% ,纯化倍数179.2 倍。纯化的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一蛋白带,SDS-PAGE显示1 条蛋白带,其亚基分子量40 kD。用SephacrylS-200 凝胶层析法测得分子量为80 kD。推测该酶由两个相同亚基构成。以蔗糖为底物测定该酶的表观Km 为1.6×10- 2 m ol·L- 1,Vm ax为100 m g 还原糖·m g- 1蛋白质·h- 1。最适pH 5.0,酸碱稳定区在pH 4.5—5.5 之间。最适温度55℃  相似文献   

7.
枯草芽孢杆菌B034拮抗蛋白的分离纯化及特性分析   总被引:29,自引:2,他引:29  
枯草芽孢杆菌(Bacilussubtilis)B034分离自水稻叶面,对水稻白叶枯病菌具有较强的拮抗能力。除去菌体培养液以70%饱和度硫酸铵沉淀所得的拮抗物粗提液对热稳定,对胰蛋白酶不敏感,对蛋白酶K、链霉蛋白酶E部分敏感,对氯仿部分敏感,其作用的活性pH范围低至4,高至12以上,比较耐碱性。粗提液经PhenylSepharoseCL4B柱层析、DEAESephacel柱层析和HPLC的Superdex75HR10/30柱层析,得到二个拮抗活性峰:P1和P2。P2经SDSPAGE和PAGEIEF电泳显示为单一蛋白带,分子量503kD,等电点625。自动Edman降解法从P2的N端测出残基序列为IleSerAsnProXIleAspVal  相似文献   

8.
蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)对BAEE的降解   总被引:2,自引:0,他引:2  
以苯甲酰-L-精氨酸乙酯(benzoyl-L-arginineethylester,BAEE)为底物,研究了蚯蚓体内纤溶酶原激活剂(plasminogenactivatorfromEiseniafetida,e-PA)的酶学性质.酶促反应的最适pH为8.4,e-PA降解BAEE的Km为1.24±0.16×10-5mol/L,Kcat为13.80±4.02s-1.测定了构成e-PA的大,小亚基分别降解BAEE的Km和Kcat.结果表明,大亚基的Km与全酶的Km相差不多,但比小亚基小约10倍,即对底物的亲和力比小亚基强约一个数量级.大小亚基的Kcat比较接近,分别是全酶的1/6和1/3.研究了8种抑制剂对e-PA降解BAEE活性的影响,其中pepstatin和E-64(一种巯基抑制剂)对酶促反应有激活作用,TPCK,TL-CK,PMSF,chymostatin和leupeptin对其有不同程度的抑制作用,EDTA对e-PA的活性没有影响.对e-PA的BAEE活性和e-PA的纤溶活性之间作了比较.  相似文献   

9.
枯草芽孢杆菌中性内切β-甘露聚糖酶的纯化及性质   总被引:14,自引:0,他引:14  
三草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BM9602产生的中性内切β-甘露聚糖酶(endo-β-1,4-D-mannan mannanohydrolaes,EC,3.2.1.78)经硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素(DE22)离子交换柱层析,得到电泳纯的样品,提纯了45.5倍,收率为5.9%。用SDS-PAGE测得该酶的分子量为35kD。用PAGEIEF测得其等电点pⅠ为4.5。酶反应的  相似文献   

10.
败血症大鼠心肌肌浆网phospholamban蛋白磷酸酶活性的变化   总被引:3,自引:1,他引:2  
杨青  吴立玲 《生理学报》1995,47(4):357-365
用DEAE-Sephacel层析法部分纯化了大鼠心肌肌浆网phospholamban(PLB)蛋白磷酸酶(PPase),并证明其是PPase-1。在SDS-PAGE电泳放射自显影上证明,ES大鼠心肌SR部分纯化的PLBPPase对底物^32P-磷酸化酶a和^32P-SR)的去磷酸化作用明显减弱;LS大鼠该部分纯化的PPase对底物的去磷酸化作用和健康大鼠相比未见明显变化。测定败血症大鼠心肌SR及其  相似文献   

11.
葡萄糖异构酶(glucoseisomerase,GI)是使用量最大的工业酶之一,可用于高果糖浆的生产,也可以用含木聚糖物质及废料为底物发酵生产乙醇,具有重要的经济价值.本文选择了表达载体pBV220[1],利用PCR方法删除了原表达质粒pTKDGI1中GI结构基因5′端多余的核苷酸,并添加了合适的酶切位点,重新构建了能在大肠杆菌DH5α中高效表达GIG138P的表达质粒pBZGI1.传代实验表明,新表达体系的稳定性明显优于原表达体系.粗酶液经热处理、DEAESepharoseFF和分子筛Se…  相似文献   

12.
经SephadexG-75凝胶过滤,QAE-SephadexA-50和CM-SephadexC-25离子交换层析的步骤,从湖南产尖吻蝮(Dienagkistrodonacutus)蛇毒中纯化出两个出血毒素(DaHT-1和DaHT-2).SDS-PAGE测得分子量均为23.5kD,IEF-PAGE测得等电点分别为5.6和5.2,两者具有相似的氨基酸组成,其中酸性氨基酸(Asx,Glx)分别占23%和24%,DaHT-1和DaHT-2的最小出血剂量(MHD)分别为0.5μg和0.8μg。都具蛋白水解酶活性,无对TAME,BAEE的水解活性和PLA2酶活性.两者的蛋白水解酶活力与出血活性并非正相关.DaHT-1和DaHT-2的最适温度分别为35℃和40℃,最适pH为6-9,对热均不稳定,温度高于60℃活性完全丧失。金属离子的分析显示每摩尔毒素蛋白约含0.5mol的Zn,1mol的Ca,较多的Na、K、Mg,不含Co。  相似文献   

13.
本文以GST-UVS.2抗体和卵黄膜为检测手段,采用凝胶过滤和离子交换等方法将非洲爪蟾(Xenopuslaevis)孵化酶纯化了90倍以上,并研究了其酶活性和生化特性。实验发现,孵化酶分子量为60kD,有很强的蛋白酶活性和卵黄膜溶解活性;它很不稳定,在纯化时极易降解为40kD分子,40kD分子没有卵黄膜溶解活性,但仍有很强的蛋白酶活性。40kD分子很可能只代表60kD分子中的蛋白酶功能区,而丢失了两个CUB重复区。孵化酶对EDTA和金属离子非常敏感、又为p-APMSF等胰蛋白酶抑制剂所强烈抑制,表明它是属于胰蛋白酶类型的一种金属蛋白酶。其特异性MCA-底物为Boc-Leu-Gly-Arg-MCA。  相似文献   

14.
东亚钳蝎神经毒素在大肠杆菌中的表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
以山西风陵渡东亚钳蝎(ButhusmartensiKarsch)的尾腺总RNA为模板,根据已知的蝎神经毒素保守氨基酸序列设计引物,利用PCR技术,扩增并克隆了两个蝎神经毒素基因.序列分析表明,由两个基因导出的氨基酸序列(BmKMm1和BmKMm2)与已知的蝎神经毒素BmKⅠ、BmKⅡ、BmKⅢ、BmKM1、BmKM9有很高的同源性.将BmKMm2基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体pExSec1中进行表达.SDS-PAGE证明表达产物被分泌到细胞周间质及培养液中.经IgG-Sepharose纯化后的蛋白质注射小白鼠表明表达产物有生物学活性  相似文献   

15.
Metylomonassp.GYJ3菌的甲烷单加氧酶(MMO)粗酶提取液经DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析、SephadexG-100凝胶过滤层析和DEAE-TSKgelHPLC分离纯化出MMO还原酶组分.经HPLC分析,纯度大于95%,纯化倍数为4.4,加入至MMO羟基化酶和调节蛋白B的体系中表现比活为228nmol环氧丙烷每分钟毫克蛋白.SDS-PAGE电泳表明还原酶由一种亚基组成,分子量42kD.ICP-AES测定还原酶的Fe含量为1.83molFe每mol蛋白.UV-Vis光谱表明还原酶除280nm蛋白质特征峰外在460nm有最大吸收峰,且A280nm/A460nm为2.50,与其它黄素一铁硫蛋白相似,推测还原酶可能含一个FAD辅基和Fe2S2中心.在厌氧条件下,还原酶能够和NADH作用,UV-Vis光谱分析表明还原酶460nm处特征吸收峰消失,说明在MMO催化过程中还原酶接受NADH的电子.DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换层析分离出调节蛋白B,部分纯化的调节蛋白B的分子量大约在20kD,它能够提高MMO比活性40倍,MMO还原酶和调节蛋白B单独存在时不具有MMO  相似文献   

16.
地衣芽孢杆菌1Baciuus Licheniformis)BL-306产生的胞外β-甘露聚糖酶经硫酸铵分级盐析,DEAE-纤维素柱层析。Sephadex-G100柱凝胶过滤和DEAE-纤维素柱再层析分离纯化,得到SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)均一样品。用SDS-PAGE测得纯化后β-甘露聚糖酶分子量为26000道尔顿。用凝胶等电聚焦电泳(PAGEIEF)测得等电点PI为5.0。该酶  相似文献   

17.
百合的鳞茎中含有一种对木瓜蛋白酶有强抑制作用的巯基蛋白酶抑制剂.百合的鳞茎经浸取加热处理,木瓜蛋白酶偶联的Sepharose4B柱亲和层析和SephadexG-100分子筛层析,可获得在PAGE和SDS-PAGE均为单一蛋白带的百合巯基蛋白酶抑制剂(CPI).此CPI为单链蛋白,含有0.307%的中性糖;N端氨基酸为Ile;SDS-PAGE测得亚基分子量为12000;SephadexG-100测得分子量为12500.百合CPI在100℃内和pH2~12范围内非常稳定;对木瓜蛋白酶的抑制属竞争性抑制类型,其Ki值为1.15×10~(-9)mol/L,对木瓜蛋白酶的抑制摩尔比为8.5:1.  相似文献   

18.
杨依军  李多川 《菌物系统》1997,16(4):300-306
嗜热真菌Thermomyes lanuginosusA236在液体培养基中50℃下静止培养14天,粗提酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Toyopearl离子交换层析、Butyl-Toyopearl疏水层析,SephacrylS100凝胶过滤和FPLCMonoQ离子交换层析,得到了凝胶电泳均质的葡萄糖淀粉酶。酶促反应产物经TLC分析为葡萄糖,证明纯化的酶葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.3)。SDS-P  相似文献   

19.
用PAGEA活性染色分析了D.radiodurans过氧化氢酶(Cat)和起氧化物歧化酶(SOD)。2种同种异型D.radiodurans(R1和Sark)的Cat在电泳带型上存在差异,两者Kat均可分为A、B和C3条带,但各带所占比例明显不同,SOD的分析结果表明,D.radiodurans SOD以Fe^2+和Mn^2+离子的嵌合体形式存在,其中Fe-SOD成分占90%以上。PAGE活性染色法  相似文献   

20.
应用杂交瘤技术,以A型红细胞,A1血型物质MSM(A1)和A-RBC+MSM(A1)为免疫原,制备了一组抗人A血型单克隆抗体:A1218,B57,DE923-G8,D286-E12经Takatsy微量血细胞凝集试验证明:这组单抗仅能凝集A1,A2及AB型红细胞,不能凝集B,O型红细胞.采用ELISA定量抑制试验法,精确测定了它们抗原结合部位的结构,互补于A活性寡糖。A1218互补于具有双岩藻糖结构的A活性五糖(A-Penta);B57,DE923-G8互补于具有单岩藻糖结构的A活性六糖(A-Hexa);而D286-E12则互补于具有单岩藻糖的A活性四糖(A-Tetra).结果表明:血凝特异性相同的抗A单抗,其抗原结合部位的结构可呈现多样性。即A活性寡糖的糖基组成数目和含有岩藻糖数目均可不相同,各种抑制剂对不同单抗的抑制作用强弱也不相同。  相似文献   

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