双拷贝人α型心钠素基因的组建及大肠杆菌分泌型克隆与表达

将单拷贝人α心钠素基因3′端用Ban Ⅱ酶解除去包括终止密码在内的36个碱基对,代之以人工合成的含Glu-Lys-Phe-Glu连接片段与另一单拷贝人α心钠素基因的5′端串连成编码60肽的双拷贝心钠素基因,克隆于大肠杆菌分泌型表达载体pIN-Ⅲ-OmpA_2质粒中,表达生成60肽的双拷贝人α型心钠素衍生物,在信号肽的作用下分泌至胞膜间质并自动切割为60肽的外源基因产物。分子量约8K的表达产物用分子筛或超滤膜分离后再经HPLC纯化,表达产物具有明显的心钠素放免活性和舒张血管活性。     

人骨形成蛋白-7成熟肽基因在巴斯德毕氏酵母中的分泌表达

目的:利用甲醇酵母表达系统,构建重组人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)成熟肽的基因工程菌,并实现其分泌表达。方法:采用PCR方法,依据GenBank数据库中hBMP-7成熟肽序列(AccessionNo.NM_001719)设计并合成一对引物,从已构建的含hBMP-7的克隆载体中扩增获得人骨形成蛋白-7成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,电转化巴斯德毕氏酵母SMD1168,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,经筛选获得rhBMP-7成熟肽表达株,并进行了表达产物的活性测定。结果:表达产物存在于培养上清中,约占分泌蛋白总量的8%。经Western印迹分析可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性。结论:构建了重组人骨形成蛋白-7成熟肽的基因工程菌并在甲醇酵母中实现了分泌表达,为进一步的活性及功能研究奠定了基础。     

基因定点诱变删除及天然α型心钠素的分泌型表达

用基因定点诱变技术,删除了pO_1α ANF表达质粒中的33对碱基,使人α型心钠素结构基因直接与大肠杆菌分泌型表达质粒pIN-Ⅲ-OmPA中的信号肽酶切位点编码区相连,构成天然人α型心钠素的表达质粒pANF,在IPTG诱导下表达28肽的天然人α型心钠素。纯化后的表达产物具有天然心钠素的放免活性和很强的舒张血管的生物活性。     

人α降钙素基因相关肽基因在酵母细胞中的分泌表达与产物的分离纯化

化学合成的人α降钙素基因相关肽(CCRP)基因用PCR法改造后使其能正确融合在酵母分泌型表达载体pVT102U/α中的α交配因子前导肽序列之后,然后进行克隆并转化酵母宿主菌S－78进行表达．培养物的上清用酶标(ELlSA)鉴定为阳性,而对照S－78、pVT102u／α为阴性,表达量用ELISA定量大于2mg／L。表达产物经阳离子交按层析(CM—Sphadex C₂₅)和HPLC纯化得到了HPLC纯产品。纯化后的CGRP能引起小鼠血压的降低,说明表达的目的蛋白既有CGRP的免疫结合活性,又有CGRP的生理活性。测定其N－端10个氨基酸序列,证明人工合成的CGRP基因在酵母细胞中已正确表达。     

地鳖虫纤溶活性蛋白cDNA序列克隆与毕赤酵母表达

依据已报道的地鳖虫成熟肽cDNA序列设计引物,通过RT-PCR法从地鳖虫(Eupolyphage sinensis Walker)中克隆得到675 bp地鳖虫纤溶活性蛋白 (fibrinolytic protein,EFP)成熟肽编码序列.将此片段克隆到表达载体pPICZα-A中,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达得到重组表达蛋白,经SDS-PAGE电泳和活性鉴定,表明重组EFP在毕赤酵母中均获得表达,重组表达蛋白相对分子质量为28.2 kD,表达产物分子质量与理论分子质量相符.重组蛋白在毕赤酵母中以分泌形式表达,具有纤溶活性.     

虎纹镇痛活性肽在毕赤酵母中的分泌表达

虎纹镇痛活性肽HWAP-Ⅰ是从虎纹捕鸟蛛初毒中分离纯化,具有镇痛活性的多肽类神经毒素.为了在P.pastoris中高效分泌表达HWAP-Ⅰ,依照RT-PCR的结果,人工合成编码虎纹镇痛活性肽的基因片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,构建表达质粒pPIC9K-HWAP-Ⅰ.转化GS115宿主菌后,筛选出整合型His⁺Mut^S表达菌株.经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)证明HWAP-Ⅰ在毕赤酵母中能有效分泌表达,产物的分子质量为4 ku左右,产量达80 mg/L.体外小鼠输精管阻断实验证实表达产物具有明显的生物活性.     

斑点叉尾鮰LEAP-2和NK-lysin抗菌肽在毕赤酵母中的串联表达

[目的]合成密码子优化的斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)LEAP-2与NK-lysin成熟肽的串联基因(LN),构建真核重组表达载体p PICZαA-LN,实现LN在毕赤酵母中的重组DNA表达并对其纯化。[方法]参考编码斑点叉尾鮰LEAP-2和NK-lysin成熟肽的c DNA序列,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性,优化合成LEAP-2与NK-lysin成熟肽的串联基因LN,两者之间通过α因子信号肽酶切位点对应的核苷酸序列连接;选择表达载体p PICZαA,构建重组表达载体p PICZαA-LN;电转化至毕赤酵母X-33,29℃、p H 6.0条件下,采用1.0%甲醇诱导表达目的蛋白;采用阳离子交换层析对表达产物进行分离纯化。[结果]Tricine-SDS-PAGE分析显示,培养72 h的表达产物经阳离子交换层析,获得了重组体LEAP-2成熟肽、NK-lysin成熟肽和两者的串连表达物;LEAP-2成熟肽的分泌表达效率较NK-lysin成熟肽的高。[结论]实验构建了斑点叉尾鮰LEAP-2与NK-lysin串联基因的真核重组表达载体,并在毕赤酵母X-33中成功表达。     

重组人α8型干扰素的纯化与鉴定

采用酵母表达载体进行重组人α８型干扰素（ＨｕＩＦＮα８）的表达,该表达菌株可将重组α８型干扰素分泌进入培养基中,回收培养基进行纯化,然后利用超滤浓缩,先过Ｓ．ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱,再进行ＤＥＡＥ-ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ层析和Ｇ-２５脱盐,最后用高效液相ＨＰＬＣ,ＳＤＳ-ＰＡＧＥ丙烯酰胺凝胶电泳及肽图等方法对纯化产品进行鉴定。采用以上两步纯化方法纯化酵母分泌表达的重组人α８型干扰素纯度可达９５％以上,其比活性为３.０×１０^８ｕ／ｍｇ。     

昆虫神经毒素BjαIT的表达及杀虫活性

根据毕赤酵母Pichia pastoris密码子偏爱性,不改变毒素蛋白质一级结构,设计合成了昆虫神经毒素BjαIT基因,并分别克隆至大肠杆菌Escherichia coli融合表达载体pPET30-a(+)和毕赤酵母分泌表达载体pPIC9K。在IPTG的诱导下,神经毒素在大肠杆菌中融合表达,表达产物利用镍亲和层析柱纯化,纯化产物用于制备抗血清和活性测试。采用斑点杂交,筛选得到了较高水平分泌表达重组BjαIT的酵母转化子,摇瓶条件下,毒素表达量最大可达约20 mg/L。大肠杆菌BjαIT表达产物对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis和德国小蠊Blattela germanica没有活性,但酵母表达产物经注射东亚飞蝗和德国小蠊表现出杀虫活性。     

人胸腺素α1在大肠杆菌中的融合表达

利用基因工程表达的方法,在大肠杆菌中通过与GST蛋白融合的方式高效表达了胸腺素α1前体基因,随后经亲和层析和SP强阳离子树脂纯化相结合的方式,得到了胸腺素前体肽段31肽和N端未经乙酰化修饰的28肽。融合蛋白表达量达到菌体总蛋白的35%～40%,样品肽的产量也达到了约200mg/L（肽/发酵液）的产量。经质谱测定,分子量分别为3366和3066。BalB/C小鼠脾脏淋巴细胞体外测活表明,所构建的GSTTα1融合蛋白和纯化后的产物对于淋巴细胞具有比较明显的增殖作用,其中N端未经乙酰化的28肽产物与31肽产物活性相近,均对淋巴细胞具有明显的刺激增殖作用。     

海蚕新型抗菌肽Perinerin在毕赤酵母中的表达及活性测定

摘要：利用巴斯德毕赤酵母表达系统,对海蚕抗菌肽 Perinerin 进行分泌性表达,并进行活性检测。首先通过 SOE 法（Gene splicing by over lap extension）设计三对互补引物来合成完整的Perinerin 的基因,将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPICZαA中,构建了重组表达质粒 pPICZαA-PEN ,转化Pichia pastoris GS115 宿主菌,利用甲醇来诱导外源基因在阳性菌株中的表达,表达产物经 Tricine-SDS-PAGE 电泳验证。生物学活性检测证实重组蛋白对部分革兰阳性及革兰阴性细菌有明显抑制作用,尤其对绿脓杆菌有强烈的抑制作用。     

地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆和及其启动子功能鉴定

根据已知α-淀粉酶编码基因保守区核苷酸序列,通过PCR和反向PCR技术克隆出Bacillus licheniformisCICIM B0204α-淀粉酶编码基因amyL全长序列及其上下游序列。B.licheniformisCICIM B0204amyL由1539bp组成,其上游180bp为启动子序列,下游160bp为终止子序列;成熟肽由512个氨基酸残基组成,氨基端的29个氨基酸残基为α-淀粉酶的信号肽。通过基因及其氨基酸序列比对发现,amyL及其编码产物与芽孢杆菌来源的α-淀粉酶具有高度相似性。将amyL的结构基因在PT7介导下于大肠杆菌中诱导表达,获得具有α-淀粉酶活性的表达产物。将amyL的启动子序列和信号肽序列与B.licheniformisCICIM B2004的β-甘露聚糖酶结构基因进行读框内重组,在大肠杆菌中获得了β-甘露聚糖酶的分泌表达,重组大肠杆菌表达295U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。     

枯草杆菌α-淀粉酶基因克隆及其在毕赤酵母中表达的初步研究

以B.subtilis XL-15基因组为模板,运用PCR法成功克隆了α-淀粉酶基因,其开放式阅读框(ORF)为1980bp,编码659个氨基酸残基。分别将该基因转入大肠杆菌BL21(DE3)和毕赤酵母GS115中,进行诱导表达。结果表明,大肠杆菌破碎上清液中未检出酶活,SDS-PAGE电泳分析显示表达产物均以无活性包涵体存在;而毕赤酵母在α-Factor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,经高密度培养,表达产物分泌至胞外,发酵液酶活力为4.3U/ml,实现了B.subtilis α-淀粉酶基因的分泌表达。     

乙肝表面抗原专一的单链嵌合抗体在大肠杆菌中的表达

利用重组ＰＣＲ技术将乙肝表面抗原专一单抗的Ｖｋ与人源的Ｃ基因拼接成轻链嵌合抗体Ｖ－Ｃ,再通过编码柔性肽段（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）的Ｌｉｎｋｅｒ与Ｖ连接成单链嵌合抗体ＳｃＦＶ－Ｃ,并分别在大肠杆菌的热敏与分泌型表达系统中进行表达。表达产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ与间接ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ＳＣＦｖ－Ｃ产两种系统中的表达产物均具有抗原结合活性,并已在分泌肽的指导下ＳｃＦｖ－Ｃｋ能被Ｅ．ｃｏｌｉ分泌出胞外。     

重组人肽抗生素hPAB—β及其突变体的活性测定与筛选

从人体基因组中克隆了一个编码肽抗生素样的基因。按基因编码产物的氨基酸序列 ,化学合成目的产物 ,药物敏感测定法证实产物具有杀菌活性后 ,又用基因工程法人工表达了目的产物。测定表达的重组人肽抗生素hPAB β及其突变体的抗菌活性 ,筛选理想的活性分子。方法是应用平板法和最小抑菌浓度 (MinimumInhibitionConceng tration ,MIC)测定法检测重组表达的hPAB β及突变体hPAB β38,hPAB β34对 8株实验室保存菌株及 10株临床分离菌株的杀菌能力 ,并以化学合成的肽抗生素hPAB β作对照 ;根据各目的分子抗菌能力的强弱 ,筛选理想的目…     

人成骨蛋白成熟肽基因在毕氏酵母(Pichia Yeast)中的高效表达

采用PCR方法,根据文献报道的人成骨蛋白（osteogenic protein-1,OP-1）成熟肽基因序列,设计并合成一对引物,从构建的含人成骨蛋白基因的质粒中扩增获得大小为420bp的DNA片段,连接到pGEM-T载体进行测序,证明获得人成骨蛋白成熟肽基因片段,并以pPIC9K为表达载体构建重组表达质粒,转化大肠杆菌细胞,经鉴定的阳性重组质粒并线形化,电转化毕氏酵母细胞GS115,于30℃进行甲醇诱导分泌表达,表达产物存在于培养基中,占分泌蛋白的10％.重组表达产物进行Western Blot可以检测到重组表达产物,ELISA检测其具有特异性结合活性.     

鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒的构建

生长激素(GH)是动物垂体前叶分泌的一种多肽类激素.应用分子重组及PCR等技术,构建了一种鲑鱼生长激素基因分泌型表达质粒pOsGH153,使编码鲑鱼生长激素成熟肽的序列克隆在大肠杆菌分泌型表达载体PIN-Ⅲ-ompA内,直接位于编码大肠杆菌外膜蛋白A信号肽序列的下游,在Lpp-Lac杂合启动子控制下,经IPTG诱导,分子量约23 000的鲑鱼生长激素在大肠杆菌中获得高效表达,该产物具有天然鲑鱼生长激素的免疫活性,直接分泌到细胞周质,而信号肽被自动剪除.     

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut 表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。     

利用双抗生素标记提高血管钠肽在毕赤酵母中的分泌表达

依照血管钠肽氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性,人工合成了血管钠肽的编码基因,通过PCR技术,扩增出5'端含有组氨酸标签的血管钠肽基因片段,构建的分泌型表达质粒pPIC9K-VNP,pPICZαB -VNP分别经SalⅠ和SacⅠ线性化后,双质粒转化毕赤酵母GS115宿主菌后,G418/Zeocin双抗筛选出整合型His⁺Mut^s表达菌株,Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析,证明His-VNP在毕赤酵母中可有效分泌表达,摇瓶产量可达70mg/L左右,双质粒整合较单质粒整合重组子目的多肽表达量提高了75%。生物学活性研究表明,表达产物在体外具有对巨噬细胞iNOS和TNFα mRNA的抑制作用。     

甲醇酵母Pichia pastoris高水平表达有活性的辣根过氧化物酶

表达有活性的辣根过氧化物酶(HRP)不仅可以深入揭示HRP结构与功能及其生理作用规律,而且为HRP的广泛需要提供新的来源.为了在甲醇酵母P.pastoris中成功表达,将编码HRP-C成熟肽的cDNA构建到pPIC9上,再转化到P.pastoris中,筛选到了分泌表达非糖基化HRP和高糖基化HRP(分子质量超过100 ku)两种主要产物的重组细胞株.优化表达条件,目标产物在摇瓶发酵液中高效表达,可达4～6 g/L.并且直接从发酵液中可获得具有活性的高糖基化HRP,每毫升发酵液中酶活力约有2 U,经初步的纯化HRP具有最大吸收峰403 nm.