植物焦磷酸酶(PPase)的研究进展

植物焦磷酸酶(PPase)可分为存在于细胞质中可溶性的无机焦磷酸酶和与膜结合的不可溶性焦磷酸酶.后者不仅能水解焦磷酸,同时还具有质子泵的功能.橡胶树乳管中与黄色体膜结合的不可溶性焦磷酸酶,是调控橡胶生物合成的一个必不可少的酶.对植物焦磷酸酶的结构及其功能和分子生物学研究的进展进行了综合论述,并着重阐述了焦磷酸酶在橡胶树橡胶生物合成中的作用.     

焦磷酸在植物细胞能量代谢中的作用(综述)

ADVANCESINRESEARCHONTHEROLESOFPYROPHOSPHATEINCELLULARENERGYMETABOLISMOFPLANTSWangYixing(DepartmentofBiology,JinanUniversity,Guangzhou510632)LiMingqi(DepartmentofAgriculturalBiology,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642)焦磷酸（PPi）是一种高能化合物,其水解的G为-33．4kJmol,即PPi水解释放的自由能与ATP相似（ATP水解为ADP和Pi的G为-31．3kJmol）。但是对于焦磷酸代谢的传统观点是：细胞内焦磷酸水平很低,代谢中的焦磷酸,主要是在大分子如蛋白质、淀粉等生…     

弱氧化葡糖杆菌ddsA基因在大肠杆菌不同宿主菌中的表达

泛醌（辅酶Q）在生物体氧化呼吸链中作为重要的质子和电子传递物质。聚十异戊烯焦磷酸合成酶催化辅助酶Q10的侧链的生物合成。为了获得高产辅助酶Q10的菌株,将选择了10种不同大肠杆菌宿主菌用于弱氧化葡糖杆菌的聚十异戊烯焦磷酸合成酶基因ddsA的表达,通过产物分析证实该基因能在大肠杆菌中表达出有活性的聚十异戊烯焦磷酸合成酶,使大肠杆菌合成了辅酶Q10。此外,还发现在Escherichia coli HB101这一菌株中,ddsA的表达使辅酶Q10的产量略超过了在野生型中占主导地位的辅酶Q8的产量。该结果证明了利用大肠杆菌大规模发酵生产辅酶Q10的可能性。     

基于焦磷酸测序分析技术的金银花掺伪鉴别方法研究

金银花是大宗药材,市场掺伪时有发生,但目前的检测方法不能满足快速准确的检测需求,因此亟需建立快精准的检测方法。为了确立高精准度和大通量的金银花掺伪鉴别检测方法,结合SNP标记及焦磷酸测序分型分析技术,对金银花及其常见伪品差异性SNP位点进行PCR扩增及焦磷酸测序分析。结果发现,运用焦磷酸测序技术对金银花和山银花的差异性SNP位点进行定量分析,能够对金银花真伪及掺伪量进行鉴定。该方法兼有PCR技术的灵敏性和焦磷酸测序技术的准确性,具有重复性好、自动化程度较高、易操作的特点,能在3小时之内完成金银花成分掺伪量的检测工作,并得出量化结果。     

可溶性焦磷酸酶的研究进展

焦磷酸酶(pyrophosphatase, PPase)是一种将底物焦磷酸(pyrophosphoric acid, PPi)水解成两分子磷酸盐的酶。目前,自然界中存在两大类PPase:膜结合型焦磷酸酶(membrane-integral pyrophosphatase, M-PPase)和可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase, s-PPase)。s-PPase又分为Ⅰ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅠ, s-PPaseⅠ)、Ⅱ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅡ, s-PPaseⅡ)和Ⅲ型可溶性焦磷酸酶(soluble inorganic pyrophatase FamilyⅢ, s-PPaseⅢ)。s-PPaseⅠ在不同生物中寡聚物的状态不同,s-PPaseⅡ在所有生物中都以二聚体形式存在,s-PPaseⅢ是卤代烷脱卤酶的变体。s-PPase催化PPi水解过程包括基团去活化和亲核体产生。s-PPaseⅡ中的CBS-PPase调控机制研究的比较清楚。本综述将重点对s-PPase的结构、催化特性、调控机制和应用等方面进行分析阐述,为后续深入的研究提供参考。     

大腸杆菌多核苷酸磷酸化酶的研究 Ⅰ.酶的提純与性质

大腸杆菌的抽提液中,合有焦磷酸酯酶,P~(32)中含有放射性焦磷酸,二者的联合作用,对于利用P~(32)-ADP末端磷交换方法測定多核苷酸磷酸化酶有干扰作用,P~(32)必須事先用酸水解。粗酶液中含有磷酸酯酶,能分解ADP、AMP,含量高时,对测定多核苷酸磷酸化酶有严重的干扰作用。經过一系列提純步驟,純酶制品的比活性与抽提液相比可提高約400倍,其中未檢查出核酸酶,非特异性磷酸单酯酶,5′-核苷酸酶,焦磷酸酯酶的含量很少。提純的酶制品相当稳定,在2—4℃中可保存三周,在37℃、47℃中加热20分钟,仍能保存87.2%与82.7%的活性,TMV-RNA,酵母HRNA与商品酵母HRNA均能稳定酶活性。     

氮素形态对番茄根系液泡膜焦磷酸酶活性的影响

采用超速梯度离心提取液泡膜微囊,研究硝态氮和铵态氮供应情况下番茄（Lycopersicon esculentum L.)根系液泡膜焦磷酸酶活性的变化。结果表明：供应铵态氮番茄根系专一性液泡膜焦磷酸酶活性比供应硝态氮的高37．7％;供应铵态氮根系液泡膜焦磷酸酶转运质子活力也明显高于供应硝态氮根系。Western blot结果表明,供应铵态氮根系液泡膜焦磷酸酶蛋白表达量也明显增加。     

植物液泡膜上的焦磷酸酶

本文概述了焦磷酸酶在植物物质和能量代谢过程中的调节作用,并对液泡膜焦磷酸酶的质子泵功能研究现状进行了讨论。     

单管PCR-Pyrosequencing快速检测华法林代谢酶基因多态性方法的建立

文章旨在建立一种单管、快速及高通量的华法林药物代谢酶相关基因多态性的检测方法。通过抽取人外周血DNA,应用带有生物素标记的扩增引物,经PCR扩增并制备焦磷酸测序单链模板,于PyroMark ID焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序,以Sanger测序法测序结果为对照,观察分析的准确性。结果显示,华法林药物代谢酶的3个相关基因多态性(CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC1(-1693))于单管中可被同时检测,一次可获得96份DNA的华法林药物代谢相关多态性位点检测结果。经与Sanger测序方法比较,符合率为100%。结果表明本方法可准确、高通量、快速检测华法林药物代谢酶相关基因多态性,与单管检测一个位点的焦磷酸测序方法相比,能有效降低检测成本,节省检测时间。该方法在个性化医疗上有较大的推广应用价值,也可以将该平台运用于其他疾病相关基因多态性检测。     

NTP焦磷酸酶的生物学功能及临床相关性研究进展

核苷三磷酸焦磷酸酶(nucleotide triphosphates pyrophosphatase,NTP-PPase)是一类可将核苷三磷酸(nucleotide triphosphates,NTPs)水解生成其对应的NMPs,同时释放出焦磷酸的核酸酶。随着其在从大肠杆菌到哺乳动物细胞中的广泛发现,它们在进化上的保守性表明该家族分子在维持生命过程中具有重要作用。NTP焦磷酸酶可以通过水解异常核苷酸,避免其掺入到新合成的DNA或RNA链中,保证DNA合成的精确性和基因组的稳定性,并与肿瘤的发生、发展密切相关。将对NTP焦磷酸酶的研究进展作简要介绍。     

利用焦磷酸测序技术检测H7N9禽流感病毒NA基因分子标签

本研究旨在建立H7N9亚型禽流感病毒NA基因分子标签的焦磷酸测序检测方法,用于H7N9型禽流感病毒的快速检测和鉴定。通过对公开发表的H7N9亚型禽流感病毒NA基因序列进行比对,发现分离株在NA基因特定区域缺失的15个核苷酸可作为H7N9亚型禽流感病毒NA基因特异性的分子标签。通过设计覆盖此区域的特异性扩增引物和测序引物,建立了H7N9型禽流感病毒NA基因焦磷酸测序检测方法。基于NA基因特定缺失区域建立的焦磷酸测序技术能用于H7N9亚型禽流感病毒国内分离株NA基因的快速检测和鉴定,且具有较好的特异性和重复性。通过对3株H7N9亚型禽流感病毒分离株的检测,表明3株H7N9亚型禽流感病毒的NA基因均存在15个核苷酸缺失的分子标签。本研究建立的H7N9亚型禽流感病毒NA焦磷酸测序检测方法,可用于H7N9禽流感病毒的检测和鉴定。     

膜外核苷酸焦磷酸酯酶/磷酸二酯酶家族的研究进展

膜外核苷酸焦磷酸酯酶/磷酸二酯酶家族(E-NPPs)是哺乳动物体内一族结构相似的膜蛋白,目前共发现该家族的7个成员。该家族名称的由来是因为最初发现的NPP1、NPP2、NPP3均具有水解核苷酸及其衍生物的焦磷酸酯键/磷酸二酯键的活性,而进一步的研究表明,E-NPPs的一些成员还具有重要的磷脂酶活性。它们广泛参与核苷酸循环、骨矿化、磷脂信号调控、细胞运动、细胞增殖等多种生理过程,其表达异常时会导致肿瘤、骨矿化异常、Ⅱ型糖尿病等疾病的发生。     

乙肝治疗耐药基因突变的焦磷酸测序技术诊断

目的：建立焦磷酸测序技术检测拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝所致乙肝病毒基因耐药突变的定量检测方法,为临床乙肝耐药诊断和治疗提供依据。方法：针对乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4个常见基因突变位点的6种突变形式,分别克隆构建野生型和突变型质粒作为标准品,应用生物信息学手段设计目标基因通用PCR引物和各突变点的焦磷酸测序引物,建立焦磷酸测序的突变检测方法。对接受拉米夫定、阿德福韦酯治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本进行检测。结果：构建了乙肝病毒四种常见耐药性突变的标准株和变异株克隆,建立了分别或同时检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变的焦磷酸测序方法,对68例临床耐药或疑似耐药的患者血清标本进行检测,双脱氧测序验证,检出拉米夫定耐药突变32例,阿德福韦酯耐药突变5例,其中焦磷酸测序检出20例为混合突变,而双脱氧测序显示为6例。结论：成功建立了焦磷酸测序定量检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药基因突变的方法,构建了乙肝病毒耐药基因突变的标准质粒,为临床动态监测乙肝病毒变异病毒株、指导合理用药奠定了基础。     

福氏志贺痢疾杆菌硫胺素单磷酸激酶(ThiL)表达纯化及晶体生长研究

硫胺素单磷酸激酶(ThiL)在ATP存在下催化硫胺素单磷酸(TMP)形成硫胺素焦磷酸(TPP)和ADP,硫胺素焦磷酸就是维生素B1的活性形式。硫胺素单磷酸激酶属于一个小的ATP结合蛋白超家族成员。将来源于福氏志贺痢疾杆菌2a(301株)ThiL基因构建入pET-22b(+)表达载体,在大肠杆菌中得到高效表达,经过两步纯化,得到高纯度蛋白,用于晶体生长,经过对其晶体生长条件进行摸索和优化,得到了能用于X-射线衍射的单晶,为其结构解析、催化机理研究和药物设计提供了基础。     

乙肝治疗耐药基因突变的焦磷酸测序技术诊断

目的:建立焦磷酸测序技术检测拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙肝所致乙肝病毒基因耐药突变的定量检测方法,为临床乙肝耐药诊断和治疗提供依据。方法:针对乙肝病毒DNA聚合酶基因序列上4个常见基因突变位点的6种突变形式,分别克隆构建野生型和突变型质粒作为标准品,应用生物信息学手段设计目标基因通用PCR引物和各突变点的焦磷酸测序引物,建立焦磷酸测序的突变检测方法。对接受拉米夫定、阿德福韦酯治疗的慢性乙型肝炎患者血清标本进行检测。结果:构建了乙肝病毒四种常见耐药性突变的标准株和变异株克隆,建立了分别或同时检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药突变的焦磷酸测序方法,对68例临床耐药或疑似耐药的患者血清标本进行检测,双脱氧测序验证,检出拉米夫定耐药突变32例,阿德福韦酯耐药突变5例,其中焦磷酸测序检出20例为混合突变,而双脱氧测序显示为6例。结论:成功建立了焦磷酸测序定量检测拉米夫定、阿德福韦酯耐药基因突变的方法,构建了乙肝病毒耐药基因突变的标准质粒,为临床动态监测乙肝病毒变异病毒株、指导合理用药奠定了基础。     

辅酶Q10生物合成与生产研究进展

微生物发酵法是生产辅酶Q10的最佳工艺.辅酶Q10的生物合成途径包括异戊二烯焦磷酸合成、聚十异戊二烯焦磷酸合成、苯环修饰等过程.1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶、聚十异戊二烯焦磷酸合成酶、对羟基笨甲酸聚十异戊二烯焦磷酸转移酶等是Q10合成的关键酶.生产辅酶Q10的菌种可通过诱变、基因重组和支路敲除等方法获得.氧化还原电位控制、pH控制补料分批发酵、发酵萃取耦合技术等新工艺逐浙应用于辅酶Q10生产.     

焦磷酸显色法检测PCR产物及酶活性

聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是分子生物学领域的一项具有划时代意义的技术,但定量PCR产物或测定能生成焦磷酸的酶活性仍需要新技术的发展。本文提供了一种PCR产物定性及定量检测方法(Color PCR kit)及其用途;该方法通过焦磷酸(pyrophosphate,PPi)显色测定PCR的副产物PPi。利用试剂盒中的试剂与PPi反应,最终生成物为甲暨（formazan）,呈红色。根据显色现象(红色)判断PCR的阳性结果,由目测实现PCR的定性检测;或通过测定490 nm 处的吸光度值定量检测PCR过程中生成的副产物PPi的含量,定量检测PCR 产物的生成量;目测情况下Color PCR kit可检测到2.5 ng水平的PCR产物,用紫外分光光度计可检测到低限为1 pg;Color PCR kit法比琼脂糖凝胶电泳检测法（低限为4 ng）灵敏。Color PCR kit还可用于连接酶和转移酶活性的测定。     

谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶研究进展

谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶是生物．体内嘌呤产物合成途径的关键酶,负责催化全合成途径的第一步反应。肌苷属于嘌呤核苷,是食品和医药行业广泛应用的重要产品。谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶在肌苷的生物合成途径中起重要调节作用,对其深入研究将有助于提高肌苷的产量,对工业化生产有重大意义。本从谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的属性、功能、结构和基因表达与调控方面对其做了介绍,为肌苷产量的提高工作奠定了基础。     

水稻ADP—葡萄糖焦磷酸化酶的cDNA基因克隆和结构分析

用ＰＣＲ技术从我国水稻品种“中花１０ 号”（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｖａｒ． ｊａｐｏｎｉｃａ ｃｖ． Ｚｈｏｎｇｈｕａ １０）的未成熟种子中克隆到ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因,进行了全序列分析,并与国外已报道的同类基因进行了核苷酸及推导氨基酸序列的同源性比较。结果表明,作者克隆的ＡＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶基因全长１４６１ ｂｐ,编码１个由４８３ 个氨基酸组成的多肽,与国外基因的核苷酸和推导氨基酸同源率分别为９９．６％ 和９９．７％ 。此外,还对该基因进行了结构及进化分析。     

六磷酸肌醇激酶(IP6Ks)的生物学功能及其在疾病中的作用

可溶性和脂质状态的磷酸肌醇在真核细胞中广泛存在,它们在细胞的发育和生物学功能中起到重要作用。其中,六磷酸肌醇激酶(inositol hexaphosphate kinases,IP6Ks)是焦磷酸肌醇合成的限速酶,它可以在肌醇环第一位、第三位或第五位已有的磷酸基团上再加一个磷酸基团合成焦磷酸肌醇,例如5-焦磷酸–五磷酸肌醇(5-pyrophosphate inositol pentaphosphate,IP_7、PP-IP_5)和1,3-二焦磷酸肌醇–四磷酸(bis-diphosphoinositol tetrakisphosphate,IP_8、[PP]_2-IP_4)。IP6Ks通过以上过程在DNA修复、染色体重组、细胞死亡、凝血作用、造血调控、免疫调控、癌症进展等方面发挥作用,因而受到越来越多的重视。该文基于近期IP6Ks的相关研究进展,就IP6Ks在细胞功能调控以及疾病治疗中的作用作一综述。