Zur Regulation der NAD-abhängigen Hydrogenase-Aktivität

Zusammenfassung Ruhende Zellen von Hydrogenomonas H 16 enthalten je Gramm Trockengewicht 0,7 mg ATP und 0,9 mg NAD. Bei der Fixierung von Kohlendioxyd und der Synthese des Speicherstoffs Poly--hydroxybuttersäure sinkt die intracelluläre ATP-Konzentration um 30% und das Redoxverhältnis NADH₂/NAD von 1,4 auf 0,46. Die NAD-abhängige Hydrogenase enthält NAD als Coenzym relativ fest gebunden. In Gegenwart von Wasserstoff wird dieses zu NADH₂ reduziert und das Enzym in eine aktive, reaktionsfähige Form umgewandelt. Die Geschwindigkeit der NAD-Reduktion ist infolge einer allosterischen Hemmung der NAD-abhängigen Hydrogenase durch ihr Reaktionsprodukt NADH₂ von dem Redoxverhältnis NADH₂/NAD abhängig. Hierdurch erhält das Enzym eine regulatorische Funktion für den von Folgereaktionen abhängigen Wasserstofftransport.

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Summary Resting cells of Hydrogenomonas strain H 16 contain 0.7 mg ATP and 0.9 mg NAD/g dry weight. During the fixation of carbon dioxide and the synthesis of the storage product poly--hydroxybutyric acid, the intracellular concentration of ATP decreases by 30% and the redox-ratio (NADH₂/NAD) decreases from 1.4 to 0.46.In the NAD-dependent hydrogenase the coenzyme NAD is bound to the enzyme. In the presence of hydrogen NAD is reduced to NADH₂ and the enzyme is converted to a reactive state. The velocity of NAD-reduction is related to the concentration of NADH₂ and the redox-ratio NADH₂/NAD. This allosteric inhibition of the NAD-dependent hydrogenase by its reaction product NADH₂ is responsible for the control of hydrogen transport exerted by consecutive hydrogen requiring reactions.

     

Harnsäureabbau und Biosynthese der Enzyme Uricase,Glyoxylatcarboligase und Urease bei Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Glyoxylatcarboligase und d-Glycerat-3-Dehydrogenase werden in Hydrogenomonas H 16 unter dem induktiven Einfluß von Harnsäure, Allantoin und Glyoxylsäure gebildet.In zellfreien Extrakten wurden spezifische Enzymaktivitäten bis zu 500 E/g bzw. 4000 E/g gemessen. Beide Enzyme erwiesen sich in Extrakten als nicht an subcelluläre Partikeln gebunden.Glyoxylatcarboligase benötgt Thiaminpyrophosphat und MgCl₂; NADH₂ und NADPH₂ sind als Coenzyme der d-Glycerat-3-Dehydrogenase wirksam.Die Bildung der Glyoxylatcarboligase wurde durch Fructose reprimiert, wenn Glyoxylat das induzierende Substrat war. Mit Harnsäure als Induktor unterlag die Enzymbildung jedoch keiner Repression durch Fructose.

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Uric acid degradation and biosynthesis of the enzymes uricase, glyoxylate carboligase and urease in Hydrogenomonas H 16 I. Formation of glyoxylate carboligase and d-glycerate-3-dehydrogenase

Summary Inductive formation of glyoxylate carboligase and d-glycerate-3-dehydrogenase was observed in cells of Hydrogenomonas H 16 in presence of uric acid, allantoin and glyoxylic acid.Specific enzyme activities up to 500 U/g and 4000 U/g respectively were determined in cell-free preparations. Both enzymes are not bound to subcellular particles in ultrasonic preparations. Thiamine pyrophosphate and MgCl₂ are necessary cofactors for glyoxylate carboligase; NADH and NADPH are active coenzymes of d-glycerate-3-dehydrogenase.The formation of glyoxylate carboligase was repressed by fructose, provided glyoxylate was the inducing substrate. Enzyme synthesis induced by uric acid was not subject to fructose repression.

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Auszug aus der gleichlautenden Habilitationsschrift zur Erlangung der venia legendi der Landwirtschaftlichen Fakultät der Georg-August-Universität Göttingen.     

Synthese von Phosphoenolpyruvat aus Pyruvat durch Extrakte aus Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16

Zusammenfassung Zellfreie Extrakte aus Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 katalysieren die Biosynthese von Phosphoenolpyruvat aus Pyruvat und Adenosintriphosphat. Unter identischen Bedingungen erfolgte diese Synthese auch durch Extrakte aus Escherichia coli.Das Reaktionsprodukt Phosphoenolpyruvat wurde durch Papierchromatographie, durch Anwendung von radioaktivem Pyruvat und durch einen gekoppelten enzymatischen Test unter Einsatz eines gereinigten Präparates von 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonsäure-7-phosphat Synthase, AMP wurde als zweites Produkt der PEP-Synthasereaktion nachgewiesen. Die Versuchsergebnisse lassen darauf schließen, daß der Stamm H 16 über ein Enzym verfügt, welches Pyruvat direkt phosphoryliert.

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Biosynthesis of phosphoenolpyruvate from pyruvate by extracts from Hydrogenomonas eutropha strain H 16

Summary Crude extracts from Hydrogenomonas eutropha strain H 16 catalyze the biosynthesis of phosphoenolpyruvate from pyruvate and adenosine triphosphate. Under identical conditions extracts from Escherichia coli synthesized phosphoenol-pyruvate from pyruvate also.The reaction product phosphoenolpyruvate has been identified by paper chromatography, by employing radioactive pyruvate and by a coupled enzyme assay, using a purified preparation of 3-deoxy-d-arabino-heptulonic acid-7-phosphate synthase. AMP has been found as the second product of the PEP-synthase reaction. From these results it is concluded that strain H 16 contains an enzyme phosphorylating pyruvate directly.

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Abkürzungen DAHP 3-Desoxy-d-arabino-heptulosonsäure-7-phosphat - DTT Dithiothreitol - PEP Phosphoenolpyruvat - P ortho-Phosphat - PP Pyrophosphat     

Über das Wasserstoff aktivierende System von Hydrogenomonas H16

Zusammenfassung In zellfreien Extrakten aus Hydrogenomonas H 16 ist die Hydrogenase-Aktivität auf zwei Fraktionen verteilt, die durch einstündiges Zentrifugieren bei 100 000 g voneinander getrennt werden können. Die überstehende Fraktion reduziert Methylenblau, NAD, FMN, FAD und Sauerstoff, aber nicht NADP. Die Partikelfraktion reduziert Methylenblau und, anscheinend als einzigen physiologischen H-Acceptor, Sauerstoff. Cyanid und Kohlenmonoxyd hemmen nur die Sauerstoff-Reduktion durch die Partikelfraktion, aber nicht die der überstehenden Fraktion. Die Funktionen der beiden Hydrogenasen werden diskutiert.

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Summary In cell-free extracts of Hydrogenomonas H 16, the hydrogenase activity is found in two fractions which can be separated by centrifugation at 100000 g for one hour. The supernatant reduces methylene blue, NAD, FMN, FAD and oxygen, but not NADP. The particle fraction reduces methylene blue and apparently, only oxygen as a physiological H-acceptor. Cyanide and carbon monoxide inhibit oxygen reduction by the particle fraction, but not that of the supernatant. The functions of both hydrogenases are discussed.

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Auszug aus der gleichlautenden Dissertation der mathematisch-naturwissen-schaftlichen Fakultät der Universität Göttingen 1965.     

Der Biosyntheseweg der RNS-Ribose in Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 und Pseudomonas facilis

Zusammenfassung Die am Fructose- und Gluconatabbau über den Entner-Doudoroff-Weg beteiligten Enzyme sowie die Enzyme des oxydativen Pentosephosphat-Weges wurden in Rohextrakten von Hydrogenomonas eutropha Stamm H 16 und Pseudomonas facilis, sowohl nach autotrophem Wachstum als auch nach heterotrophem Wachstum auf Fructose oder Gluconat, bestimmt. Fructose induziert in H. eutropha alle Enzyme des Entner-Doudoroff-Weges, Gluconat nur die Gluconokinase, die 6-Phosphogluconat-Dehydratase und die 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat-Aldolase. Dagegen induzieren in P. facilis beide Substrate den gesamten Enzymsatz. Das Fehlen der 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase in H. eutropha und das Vorhandensein einer NAD-abhängigen 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase in P. facilis wurden bestätigt. Die Enzymaktivitäten in voll induzierten, auf Fructose gewachsenen Zellen beider Arten sind ähnlich.Mit beiden Stämmen wurden Einbauexperimente mit U-¹⁴C-, 1-¹⁴C- und 6-¹⁴C-Fructose sowie 1-¹⁴C- und 6-¹⁴C-Gluconat als Substrate durchgeführt. Die Ribose wurde aus der RNS isoliert und durch Lactobacillus plantarum fermentativ in Essigund Milchsäure gespalten. Die spezifische Radioaktivität der einzelnen C-Atome wurde durch schrittweisen Abbau der Säuren, quantitative Bestimmung des dabei entstehenden ¹⁴CO₂ und Messung der darin enthaltenen absoluten Radioaktivität ermittelt.Die Ergebnisse zeigen, daß die Ribose in Stamm H 16 ausschließlich über die nicht-oxydativen Reaktionen des Pentosephosphat-Weges gebildet wird. Die C-Atome 1,2 und 3 des Gluconats tragen nicht signifikant zur Gluconeogenese bei.Das Markierungsmuster der Ribose aus P. facilis ist mit dem von Stamm H 16 nahezu identisch. Die oxydativen Reaktionen des Pentosephosphat-Weges über die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase sind von quantitativ geringerer Bedeutung als die Transaldolase-Transketolase-Reaktionen.

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The biosynthetic pathway of RNA ribose in Hydrogenomonas eutropha Strain H 16 and Pseudomonas facilis

Summary The enzymes involved in the degradation of fructose and gluconate via the Entner-Doudoroff-pathway as well as those involved in the oxidative pentose phosphate pathway have been determined in crude extracts of Hydrogenomonas eutropha strain H 16 and of Pseudomonas facilis after either autotrophic growth or heterotrophic growth on fructose or gluconate as substrates. In H. eutropha fructose induces all enzymes of the Entner-Doudoroff-pathway, gluconate induces only glucokinase, 6-phosphogluconate dehydratase and 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate aldolase. In contrast, in P. facilis both substrates induce the entire set of enzymes. The absence of 6-phosphogluconate dehydrogenase in H. eutropha and the presence of a NAD-linked 6-phosphogluconate dehydrogenase in P. facilis have been confirmed. Otherwise, the enzyme activities in fully induced fructose grown cells of both species are similar.Incorporation experiments were performed using both bacterial species and employing U-¹⁴C-, 1-¹⁴C-, and 6-¹⁴C-fructose as well as 1-¹⁴C- and 6-¹⁴C-gluconate as substrates. Ribose was isolated from RNA and fermented by Lactobacillus plantarum with the production of acetic and lactic acids. By stepwise degradation of the acids and by quantitative measurement and scintillation counting of the carbon dioxide formed the specific radioactivity of each carbon atom has been determined.The results demonstrate that in strain H 16 ribose is formed exclusively via the non-oxidative reactions of the pentose phosphate pathway. Carbon atoms 1 to 3 of gluconate do not significantly contribute to gluconeogenesis.With P. facilis an almost identical labelling pattern was observed, indicating that the oxidative reactions of the pentose phosphate pathway via 6-phosphogluconate dehydrogenase are quantitatively of minor importance for ribose synthesis than the transaldolase-transketolase reactions.

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Abkürzungen ATP Adenosin-5-triphosphat - DAP Dihydroxyacetonphosphat - E-4-P Erythrose-4-phosphat - ED Entner-Doudoroff - EDTA Äthylen-diamin-tetraessigsäure - FDP(ase) Fructose-1,6-diphosphat(ase) - F-6-P Fructose-6-phosphat - G-6-P(-DH) Glucose-6-phosphat(-Dehydrogenase) - GAP Glycerinaldehyd-3-phosphat - GDH Glycerin-1-phosphat-Dehydrogenase - GK Gluconokinase - HK Hexokinase - KDPG 2-Keto-3-desoxy-6-phosphogluconat - LDH Lactat-Dehydrogenase - NAD(H₂) Nicotin-amid-adenin-dinucleotid (reduziert) - NADP(H₂) Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat (reduziert) - PGI Phosphoglucose-Isomerase - PP Pentosephosphat - 6-PG(-DH) 6-Phosphogluconat(-Dehydrogenase) - 6-PG-DHT 6-Phosphogluconat-Dehydratase - R-5-P Ribose-5-phosphat - Ru-5-P Ribulose-5-phosphat - Su-7-P Seduheptulose-7-phosphat - TA Transaldolase - TEA Triäthanolaminhydrochlorid - TIM Triosephosphat-Isomerase - TK Transketolase - TPP Thiaminpyrophosphat - Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan - Xu-5-P Xylulose-5-phosphat     

Verwertung von Pyrimidinderivaten durch Hydrogenomonas facilis

Zusammenfassung Nach Behandlung mit 1-Nitroso-3-nitro-1-methylguanidin und nach Anreicherung in einem penicillinhaltigen Medium wurden von Hydrogenomonas facilis 35 Mutanten isoliert, die Uracil nicht mehr als N-Quelle zu nutzen vermochten. Eine Gruppe dieser Mutanten bildete keine Dihydrouracil-Dehydrogenase und verwertete Thymin, Orotsäure und Uracil nicht mehr. Eine zweite Gruppe hatte die Fähigkeit verloren, Dihydrouracil-Hydrase zu bilden und konnte Uracil, Orotsäure, Thymin, Dihydrouracil und Dihydrothymin nicht mehr verwerten. Während des Wachstums mit Cytosin wurde durch die erste Gruppe dieser Mutanten Uracil und durch die zweite Gruppe Dihydrouracil in das Nährmedium ausgeschieden.Die Enzyme Dihydrouracil-Dehydrogenase und Dihydrouracil-Hydrase waren in Zellen, die mit Cytosin, Uracil, Thymin oder Orotsäure angezogen worden waren, mit wesentlich höherer spezifischer Aktivität nachweisbar als in Zellen, die mit Ammoniumchlorid gewachsen waren. Dihydroorotsäure-Dehydrogenase und Dihydroorotsäure-Hydrase waren in den zellfreien Extrakten in keinem Fall nachweisbar. Die Befunde weisen daraufhin, daß Uracil und Thymin bei H. facilis durch eine unspezifische Dehydrogenase und Dihydrouracil und Dihydrothymin durch eine unspezifische Hydrase umgesetzt werden, und daß diese Enzyme in Gegenwart von Uracil, Thymin oder Orotsäure induktiv gebildet werden.

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Utilization of pyrimidine derivatives by Hydrogenomonas facilis II. Degradation of thymine and uracil by wild type and mutants

Summary 35 mutant strains, unable to utilize uracil as a nitrogen source, were isolated from Hydrogenomonas facilis following treatment with 1-nitroso-3-nitro-1-methylguanidine and enrichment in a penicillin containing medium. One group of these mutants lacked dihydrouracil dehydrogenase and did not utilize thymine, orotic acid and uracil. A second group of mutants had lost the ability to form dehydrouracil hydrase and was unable to utilize uracil, orotic acid, thymine, dihydrouracil and dihydrothymine. The first group of these mutants excreted uracil, the second group dihydrouracil into the medium during growth with cytosine.The enzymes dihydrouracil dehydrogenase and dihydrouracil hydrase were present in much higher specific enzyme activities in cells grown with cytosine, uracil, thymine or orotic acid than in ammonia grown cells. Dihydroorotic dehydrogenase and dihydroorotase could not be demonstrated in cell-free extracts. These data indicate that both uracil and thymine are utilized as substrates by a non-specific hydrogenase and that both dihydrouracil and dihydrothymine are utilized by a non-specific hydrase. Both these enzymes are induced in presence of uracil, thymine or orotic acid in cells of Hydrogenomonas facilis.

     

Eigenschaften der NAD-spezifischen Hydrogenase aus Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Aus zellfreiem Extrakt von Hydrogenomonas H 16 wurde die lösliche Hydrogenase 45 fach bis zu einer spezifischen Aktivität von 36500 E/g Protein angereichert. Das Enzym katalysiert die Reduktion von NAD mit molekularem Wasserstoff. Ein Cofaktorbedürfnis konnte nicht festgestellt werden. Der Einfluß von NADH, ATP, Bicarbonat und Magnesium auf die hydrogenasekatalysierte NAD-Reduktion war unerheblich. Das angereicherte Enzym ist flavin- und pyridinnucleotidfrei und reagiert mit NAD, nicht mit O₂, NADP, FMN, FAD oder Methylenblau. Die drei letztgenannten Wasserstoff-Acceptoren werden lediglich in Gegenwart katalytischer Mengen NAD reduziert. Die lag-Phase der Reduktion von NAD läßt sich durch Vorinkubation des Enzyms mit NADH oder Wasserstoff, nicht jedoch mit NAD eliminieren. Die Hemmung der Hydrogenasereaktion durch Sauerstoff ist gering. Reduzierende Agenzien wie Mercaptoäthanol oder Sulfid setzten die Reaktionsrate herab.Die Michaeliskonstante der löslichen Hydrogenase für molekularen Wasserstoff beträgt K _m ^H2 =1,9·10^–4 M. Die NAD-Konzentration, bei der halbmaximale Aktivität erreicht wird, beträgt [NAD]_{0,5 (V)}=1,3·10^–4 M. Das pH-Optimum wird in 0,05 M Kaliumphosphat-Puffer bei pH 8,5 und in 0,05 M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,9 erreicht. Unter den angegebenen Bedingungen lag das Temperatur-Optimum bei 36°C. Die Aktivierungsenergie der löslichen Hydrogenase wurde als 10,4 kcal/mol ermittelt.

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Properties of the NAD-Specific Hydrogenase from Hydrogenomonas H 16

Summary A soluble hydrogenase from cell-free extracts of Hydrogenomonas H 16 has been purified 45-fold up to a specific activity of 36,500 units per g protein. The enzyme catalyzes the reduction of NAD with molecular hydrogen. It does not require cofactors. The NAD-reduction catalyzed by this enzyme is influenced to only a small extent by the presence of NADH, ATP, bicarbonate or magnesium ions. The enzyme is free from flavins and pyridine nucleotides, reacts only with NAD and not with oxygen, NADP, FMN, FAD or methylene blue. FMN, FAD and methylene blue are reduced only in the presence of catalytic amounts of NAD. The lag-phase of the reduction of NAD can be eliminated by preincubating the enzyme in the presence of NADH or molecular hydrogen; NAD is ineffective. The inhibition of the hydrogenase reaction by oxygen is negligible. Reducing agents such as mercaptoethanol or sulfide decreased the reaction rate.The Michaelis constant of the soluble hydrogenase for molecular hydrogen is K _m ^H2 =1.9·10^–4 M. Half maximal activity is attained at a NAD-concentration of [NAD]_{0.5 (V)}=1.3·10^–4 M. The pH-optimum is 8.5 in 0.05 M potassium phosphate buffer and 7.9 in 0.05 M Tris-HCl-buffer; reaction rates were maximal at 36°C under the conditions employed. The activation energy was calculated to be 10.4 kcal/mol.

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Abkürzungen E Enzymeinheit (mole Substrat/min) - E _x Extinktionsänderung bei der Wellenlänge x nm - Ext._x Extinktion bei der Wellenlänge x nm - KP Kaliumphosphat (KH₂PO₄-K₂HPO₄-Gemisch) - MB Methylenblau - NAD Nicotinamid-adenin-dinucleotid - NADH reduziertes - NAD; TEAE Triäthylaminoäthyl - Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan     

Enzyme der Elektronentransportpartikel aus Rhodospirillum rubrum: Eigenschaften von NADH- und Succinat-Cytochrom c-Reduktase

Zusammenfassung Es werden einige Eigenschaften von NADH- und Succinat-Cytochrom c-Reduktase aus R. rubrum beschrieben. Beide Aktivitäten sind ausschließlich in der durch Ultrazentrifugation erhaltenen Partikelfraktion lokalisiert. Aerob im Dunkeln und anaerob im Licht gezüchtete Zellen zeigen keine Unterschiede in ihren spezifischen Aktivitäten.Das Optimum der Reaktion liegt für beide Aktivitäten bei 8,3; das von Succinatdehydrogenase bei 7,7. K _Mfür NADH ist 7,1·10^-6 m, für succinat 1,1·10^-4 m. NADPH wird nicht umgesetzt. Die Partikel zeigen unterschiedliche Affinität zum Elektronenacceptor Cytochrom c. K _Mfür Cytochrom c bei NADH 9,5·10^-6 m, bei Succinat 4,5·10^-6 m.NADH-Cytochrom c-Reduktase wird durch Verdünnung inaktiviert. Durch Serumalbumin kann das Enzym nur begrenzt geschützt werden. Das Substrat und der Acceptor sind wirkungslos.Succinat und Fumarat, jedoch nicht Malonat inaktivieren Succinat-Cytochrom c-Reduktase, wenn das Enzym in verdünntem Zustand vorliegt. Die beiden Substanzen zeigen unterschiedliche Inaktivierungskinetik. Serumalbumin bewirkt hier weitgehenden Schutz des Enzyms.Succinat-Cytochrom c-Reduktase wird durch Phosphat aktiviert.NADH- und Succinat-Cytochrom c-Reduktase werden durch steigende Phosphatkonzentrationen verschieden stark gehemmt.Detergentien (Triton X-100) inaktivieren beide Aktivitäten; NADH-Cytochrom c-Reduktase ist sehr viel empfindlicher als die Succinat-oxydierende Aktivität.Inhibitoren des Elektronentransports wirken auf beide Aktivitäten. NADH-Cytochrom c-Reduktase wird besonders durch Rotenon stark gehemmt.Succinat-Cytochrom c-Reduktase wird durch Malonat, Fumarat und durch Oxalacetat gehemmt. Oxalacetat ist bei R. rubrum ein sehr starker Inhibitor.

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Enzymes of the electron transport particles of Rhodospirillum rubrum: Properties of NADH- and succinate-cytochrome c-reductase

Summary Some properties of NADH- and succinate-cytochrome c-reductase from R. rubrum are described. Both activities are predominantly located in the particlefraction obtained by ultracentrifugation. No differencies in specific activities of the enzymes are observed between aerobic darkgrown and anaerobic lightgrown cells.The optimum pH of both reactions is at 8,3, the optimum for Succinicdehydrogenase at 7.7. K _M for NADH is 7.1×10^-6 m, for succinate 1.1×10^-4 m. NADPH is not oxidized. The particles also show different affinities for the electronacceptor cytochrome c. K _Mfor cytochrome c with NADH 9.5×10^-6 m and with succinate 4.5×10^-6 m.NADH-cytochrome c-reductase is inactivated by dilution. Serumalbumine can protect the activity to a limited extent. Substrate and acceptor are without effect.Succinate and fumarate but not malonate inactivate succinate-cytochrome c-reductase, when the enzyme is in a diluted form. Succinate and fumarate exhibit different kinetics of inactivation. There is a large protection by serumalbumine against the inactivation.Succinate-cytochrome c-reductase is activated by phosphate.Increasing concentrations of phosphate inhibit NADH- and succinate-cytochrome c-reductase to a different degree.The activities also show different sensitivities to inactivation by treatment with detergents (Triton X-100), NADH-cytochrome c-reductase being much more sensitive than succinate-cytochrome c-reductase.Inhibition of both activities by inhibitors of the electron transport chain is observed, notably a strong inhibition of the NADH-enzyme by low concentrations of rotenone.Succinate-cytochrome c-reductase is inhibited by malonate, fumarate and also by oxalacetate. In R. rubrum the latter substance is a potent inhibitor.

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Verwendete Abkürzungen NADH reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid - DCPIP 2,6-Dichlorphenol-indophenol     

Weinsäureabbau bei Milchsäurebakterien

Zusammenfassung Von 78 verschiedenen Stämmen der Gattungen Pediococcus, Leuconostoc und Lactobacillus vermochten vier Stämme der Species L. plantarum und ein Stamm von L. brevis Weinsäure umzusetzen. Bei beiden Organismen ist das Weinsäure abbauende Enzymsystem induzierbar. Die Induktion wird bei L. plantarum durch Glucose, nicht aber durch das ebenfalls vergärbare Mannit gehemmt. Mit ruhenden Zellen und zellfreien Extrakten wurden die Endprodukte des anaeroben Weinsäureabbaus bestimmt. Infolge der Instabilität der Enzyme konnte nur mit Rohextrakten gearbeitet werden. Je Mol Weinsäure werden von L. plantarum 1,5 Mol CO₂, 0,5 Mol Essigsäure und 0,5 Mol d,l-Milchsäure, von L. brevis 1,33 Mol CO₂, 0,67 Mol Essigsäure und ca. 0,3 Mol Bernsteinsäure gebildet. Oxalessigsäure wurde bei beiden Organismen als Zwischenprodukt nachgewiesen. Die Umsetzung von Weinsäure durch zellfreie Rohextrakte wird durch NAD oder NADH₂ gefördert; ein Überschuß von NADH₂ verhindert oder verringert die CO₂-Entwicklung und führt zur vermehrten Bildung von Milchsäure oder Bernsteinsäure. Zum Nachweis des Abbauweges wurde eine Reihe von möglichen Zwischenprodukten untersucht. Danach ergibt sich für den Abbau der Weinsäure durch das homofermentative Milchsäurebakterium L. plantarum folgender Reaktionsverlauf: Nach Dehydratisierung von Weinsäure zu Oxalessigsäure (Weinsäure-Dehydratase) wird diese quantitativ zu Brenztraubensäure decarboxyliert (Oxalessigsäure-Decarboxylase). Die Hälfte der Brenztraubensäure wird — wahrscheinlich durch das Pyruvat-Dehydrogenase-System — zu CO₂ und Essigsäure oxydiert, die andere Hälfte der Brenztraubensäure wird zu Milchsäure (Lactat-Dehydrogenase) reduziert. Der Weinsäureabbau durch den heterofermentativen L. brevis zeigt folgenden Reaktionsverlauf: Die durch Dehydratisierung entstandene Oxalessigsäure wird zu zwei Drittel zu Pyruvat decarboxyliert (spontan oder Oxalessigsäure-Decarboxylase). Pyruvat wird quantitativ zu Essigsäure und CO₂ oxydiert. Das restliche Drittel Oxalessigsäure wird über Äpfelsäure, Fumarsäure zu Bernsteinsäure reduziert. Das Weinsäure abbauende System des homofermentativen Stammes (L. plantarum) unterscheidet sich im Reaktionsablauf, in der Sauerstoffempfindlichkeit, der Einwirkung von 2-Mercapto-äthanol, dem Einfluß von Glucose, der Stereospezifität und dem pH-Optimum der zellfreien Extrakte von demjenigen des heterofermentativen L. brevis.

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Decomposition of tartrate by lactobacilli

Summary The decomposition of tartrate was only observed in four strains of Lactobacillus plantarum and one strain of L. brevis among 78 different strains of lactic acid bacteria of the genera Pediococcus, Leuconostoc and Lactobacillus. The enzyme decomposing tartrate is inducible in both organisms. In L. plantarum the induction is prevented by glucose but not by mannitol. The endproducts of the anaerobic metabolism of one mol of tartrate were 1.5 mol CO₂, 0.5 mol acetic and 0.5 mol lactic acid with L. plantarum and 1.33 mol CO₂, 0.67 mol acetic acid and 0.3 mol succinic acid with L. brevis when resting cells or cell free extracts were used. As the enzymes were very unstable, no substantial purification could be achieved; dialysis, gel chromatography or precipitation with ammonium sulphate led to rapid inactivation. Therefore crude extracts had to be used for the investigation of the enzymatic mechanism. NAD or NADH₂ are essential for the decomposition of tartrate. However, a large surplus of NADH₂ reduces or prevents the production of CO₂ by cell free extracts and results in an increased formation of lactic or succinic acid, depending on the organism. Oxalacetic acid could be proven to be an intermediate metabolite. Using possible intermediates of the pathway of tartrate decomposition, the following sequences of reactions were demonstrated. In the homofermentative lactic acid bacterium L. plantarum tartrate is converted to oxalacetic acid (by tartrate dehydrase) which is decarboxylated to pyruvic acid (by oxalacetic decarboxylase). Half of the pyruvate is oxidised to CO₂ and acetic acid (probably by the pyruvic-dehydrogenase-system), the other half of pyruvic acid is reduced to lactic acid (by lactate dehydrogenase). In the heterofermentative L. brevis tartrate is also converted to oxalacetic acid, but only two thirds of the oxalacetic acid are decarboxylated to pyruvic acid (spontaneously or by oxalacetic decarboxylase), the remaining third of oxalacetic acid is reduced to succinic acid via malic and fumaric acids. Pyruvic acid is completely oxidised to acetic acid and CO₂. — The tartrate decomposing systems of the homofermentative strain (L. plantarum) and the heterofermentative strain (L. brevis) differ in the metabolic pathway, the inactivation by oxygen, the effect of 2-mercaptoethanol, the influence of glucose, the stereospecifity, and the pH-optimum.

     

Glutathione reductase from Rhodospirillum rubrum

Summary Glutathione reductase (NADPH¹: glutathione oxidoreductase (EC 1.6.4.2) was purified 70 fold from Rhodospirillum rubrum by ammonium sulfate fractionation, gelfiltration with Sephadex and chromatography on DEAE-cellulose. The optimum pH of the reaction is 7.5–8.2 K _m values of 8.4×10^–6 M for NADPH and 5.8×10^–5 M for GSSG were determined. The kinetic data indicate a bisubstrate reaction mechanism. The prosthetic group is FAD (K _m 1.1×10^–6M). The flavin can be completely dissociated from the enzyme, and 70% of the original activity can subsequently be restored by FAD. The molecular weight was determined with a calibrated column Sephadex G-200 and found to be approximately 63,000. The enzyme is inhibited reversibly by several anions. With iodide the inhibition is competitive with respect to GSSG. Sulfhydryl reagents (N-ethylmaleinimide, p-chlormercuribenzoate) strongly inhibit the enzyme when it is present in the reduced state. The enzyme is reduced by low concentrations of NADPH and by higher concentrations of NADH. GSSG protects the enzyme against this inhibition. The enzyme is reversibly inhibited by incubation with NADPH or NADH.

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Zusammenfassung Glutathionreduktase wurde aus Rhodospirillum rubrum mit Ammoniumsulfatfraktionierung, Gelfiltration mit Sephadex und Chromatographie an DEAE-Cellulose 70 fach angereichert. Das pH Optimum der Reaktion liegt bei 7,5–8,2. K _m -Werte: 8,4·10^–6 M für NADPH und 5,8·10^–5 M für GSSG. Aus den kinetischen Daten ergibt sich für das Enzym ein Bisubstratreaktionsmechanismus. Die prosthetische Gruppe ist FAD (K _m 1,1·10^–6 M). Das Flavin kann vollständig vom Enzymprotein abdissoziiert werden, durch erneute Zugabe von FAD können etwa 70% der ursprünglichen Aktivität zurückerhalten werden. Das Molekulargewicht, bestimmt durch Gelfiltration mit einer kalibrierten Säule Sephadex G-200, ist ca. 63000. Das Enzym wird durch verschiedene Anionen reversibel gehemmt. Bei J^– ist die Hemmung kompetitiv mit GSSG. Sulfhydrylreagentien (N-Äthylmaleinimid und p-Chlomercuribenzoat) sind potente Inhibitoren, wenn das Enzym im reduzierten Zustand vorliegt. Das Enzym kann bereits durch niedrige Konzentrationen an NADPH sowie durch höhere Konzentrationen an NADH reduziert werden. GSSG schützt das Enzymprotein gegen die Hemmung durch Sulfhydryl-reagentien. Das Enzym wird durch Inkubation mit NADPH und NADH reversibel gehemmt.

     

Biochemische Untersuchungen über das proteolytische Enzym des Darmsaftes von Helix pomatia L.

Zusammenfassung Die Verfasserin hat mit der biochemischen Duspiva-Methode eine kaseinspaltende Tätigkeit im Darmsaft von Helix pomatia nachgewiesen. Das proteolytische Enzym wirkt bei p_H 4 optimal. Es wird durch Glutathion, Cystein und Ascorbinsäure aktiviert, aber durch Cystin, Kaliumeisencyanid, Bleinitrat, p-Chloromercuribenzoat und o-Jodosobenzoat gehemmt.Die von diesen beiden letzten Stoffen hervorgerufene Hemmung ist durch Glutathion und Ascorbinsäure umkehrbar. Daraus schließt die Verfasserin, daß die Protease des Darmsaftes von Helix pomatia zu den sulfhydrylischen Enzymen gehört; sie nimmt an, daß dieses Enzym nicht nur von der Mitteldarmdrüse, sondern auch vom Darmkanal kommt.     

Eine NADP(H)-spezifische Oxidoreduktase beiCalliphora

Zusammenfassung BeiCalliphora erythrocephala Meig. wird eine NADP(H)-abhängige Oxidoreduktase nachgewiesen, die Glukose-6-phosphat und Sorbit-6-phosphat umsetzt. Das Enzym wird durch Sorbit-6-phosphat ebenso wie durch Sorbit inaktiviert. Die mit Glukose-6-phosphat erzielte maximale Aktivität ist wenig geringer als die für die Sorbitdehydrogenase ermittelte Größe. Die Einschleusung der Fruktose in den Kohlenhydratstoffwechsel könnte, zumindest zu einem Teil, über Sorbit-6-phosphat zu Glukose-6-phosphat und weiter zu Glykogen oder Trehalose erfolgen.

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A NADP(H)-specific oxidoreductase inCalliphora

Summary InCalliphora erythrocephala Meig. a NADP(H)-dependent oxidoreductase transforms glucose-6-phosphate and sorbit-6-phosphate. The enzyme is inactivated by sorbit-6-phosphate as well as sorbit. The maximum activity achieved using glucose-6-phosphate as a substrate is slightly less than that reported for sorbitdehydrogenase withCalliphora (Wenzl, 1966). The introduction of fructose into carbohydrate metabolism could, at least in part, follow the sorbit-6-phosphate in glucose-6-phosphate and further to glycogen or trehalose.

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Teil einer Diplomarbeit, die unter Leitung von Herrn Prof. Dr. Langer durchgeführt wurde.     

Untersuchungen über den Einfluss von Aflatoxin B1 auf die Morphologie und die cytochemisch fassbare Aktivität einiger Enzyme von Mucor hiemalis (Mucorales)

Zusammenfassung Mit Hilfe cytochemischer Methoden wurde der Einfluß verschiedener Konzentrationen von Aflatoxin B₁ (100 ppm, 10 ppm, 0 ppm) auf die Enzyme Succinat-Dehydrogenase, L (+)-Lactat: NAD-Oxydoreduktase, Alkohol-Dehydrogenase, L-Isocitrat: NAD-Oxydoreduktase, Malat dehydrierendes Enzym (NAD als Akzeptor), NADPH₂-Cytochrom c-Reduktase, Cytochromoxydase und saure Phosphatase des PilzesMucor hiemalis untersucht. Succinat-Dehydrogenase, Alkohol-Dehydrogenase, L-Isocitrat: NAD-Oxydoreduktase und saure Phosphatase wurden bereits durch 10 ppm des Mycotoxins in ihren Aktivitäten vermindert. Atypische Sporenkeimung und verringerter Durchmesser der Hyphen waren die äußeren Kennzeichen der Aflatoxin B₁-Intoxikation. Die Ähnlichkeit des Eingriffs von Aflatoxin B₁ in den Stoffwechsel der Leber junger Enten und in denjenigen von Zellen vonMucor hiemalis wird diskutiert.

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Investigations of the influence of aflatoxin B₁ on the morphology and the cytochemically detectable activities of some enzymes ofMucor hiemalis (Mucorales). Using cytochemical methods the influence of various concentrations of aflatoxin B₁ (100 ppm 10 ppm, 0 ppm) on the enzymes succinic dehydrogenase, L(+)-lactate: NAD oxidoreductase, alcohol dehydrogenase, L-isocitrate: NAD oxidoreductase, malate dehydrogenating enzyme (NAD as acceptor), NADPH₂: cytochrome reductase, cytochrome oxidase and acid phosphatase of the fungusMucor hiemalis was investigated. The activity of succinic dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, L-isocitrate: NAD oxidoreductase and acid phosphatase was reduced by the addition of only 10 ppm of the mycotoxin. The morphological symptoms of aflatoxin B₁ intoxication were atypical germination of the spores and reduced diameter of the hyphae. The similarity between the interference of aflatoxin B₁ with metabolism in the liver of ducklings and that of the cells ofMucor hiemalis is the subject of discussion.

     

Cyclic photophosphorylation by chromatophores of the facultative phototroph,Rhodopseudomonas capsulata

Summary Cyclic photophosphorylation catalyzed by chromatophores derived from the facultative phototroph, Rhodopseudomonas capsulata was investigated. In the absence of an external electron donor such as succinate, cyclic photophosphorylation is strongly inhibited by O₂. Maximal phosphorylation rates are obtained in the presence of molecular hydrogen. Cytochrome c and bovine serum albumin have no significant effects on the reaction. However, dichlorophenolindophenol and phenazonium methosulfate are inhibitory to cyclic photophosphorylation. Cyclic photophosphorylation is sensitive to antimycin A, but highly resistant to heptylhydroxy-quinoline-N-oxide. Neither phenazonium methosulfate, nor dichlorophenolindophenol or tetramethyl-p-phenylenediamine can effect antimycin-insensitive cyclic photophosphorylation. Oligomycin strongly inhibits the phosphorylation. Overreduction caused by the ascorbate-dichlorophenolindophenol couple results in strong inhibition of phosphorylation. Addition of fumarate decreases the inhibition caused by overreduction. However, the fumarate mediated phosphorylation is nearly completely inhibited by antimycin A. Atebrine is a strong inhibitor for cyclic photophosphorylation, whereas dinitrophenol is only a weak inhibitor.

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Zusammenfassung Die durch Chromatophoren aus dem fakultativ phototrophen Rhodopseudomonas capsulata katalysierte cyclische Photophosphorylierung wurde untersucht. In der Abwesenheit eines zusätzlichen Elektronendonators wie Succinat wird die cyclische Photophosphorylierung durch O₂ stark gehemmt. Maximale Phosphorylierungsraten werden unter H₂-Atmosphäre erzielt. Cytochrom c und Rinderserumalbumin haben keinen deutlichen Effekt auf die Reaktion. Demgegenüber haben Dichlorphenolindophenol und Phenazinmethosulfat eine hemmende Wirkung auf die cyclische Photophosphorylierung. Die cyclische Photophosphorylierung wird durch Antimycin A stark gehemmt, ist aber gegenüber Heptyl-hydroxy-chinolin-N-oxyd auffallend resistent. Weder Phenazinmethosulfat noch Dichlorphenolindophenol oder Tetramethyl-p-phenylendiamin bewirken eine antimycin-resistente Phosphorylierung. Oligomycin hemmt die Photophosphorylierung stark. Eine durch Ascorbat-Dichlorphenolindophenol verursachte Überreduktion wirkt sich stark hemmend auf die Phosphorylierung aus. In Gegenwart von Fumarat ist die durch Überreduktion bedingte Hemmung stark verringert. Diese vom Fumarat abhängige Photophosphorylierung wird jedoch durch Antimycin A beinahe vollständig gehemmt. Atebrin ist ein starker Hemmstoff für die cyclische Photophosphorylierung. Demgegenüber ist die durch Dinitrophenol bewirkte Hemmung der cyclischen Photophosphorylierung gering.

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Abbreviations ADP adenosine diphosphate - ATP adenosine triphosphate - BChl bacteriochlorophyll - DNP 2,4-dinitrophenol - DCPIP dichlorophenolindophenol - FAD flavinadenine dinucleotide - FMN flavin mononucleotide - G-6-P glucose-6-phosphate - HOQNO heptylhydroxy-quinoline-N-oxide - NAD(P) nicotinamid-adenine-dinucleotide (phosphate) - PMS phenazonium methosulfate - Rh. Rhodospirillum - Rhps. Rhodopseudomonas - TMPD tetramethyl-p-phenylenediamine     

Enzyme des Fettsäureabbaus in den Organen des Flußkrebses Orconectes limosus Rafinesque

Zusammenfassung In den Organen des Flußkrebses wurden drei Enzyme der Fettsäureoxydation festgestellt: Crotonase (E.C.: 4.2.1.17), Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (HAD. E.C.: 1.1.1.35) und Ketoacyl-thiolase (KAT, E.C.: 2.1.3.9).Eigenschaften der HAD und KAT bei unseren Testbedingungen werden geschildert. Im großen und ganzen ähneln die Enzyme in ihren Eigenschaften den Wirbeltierenzymen. Im Gegensatz zu den Wirbeltierenzymen zeigt die HAD des Flußkrebses auch mit NADPH₂ Aktivität (50–75% der Aktivität mit NADH₂). Mit 10^–3 und 2·10^–3 M o-Phenanthrolin wird nur die Aktivität gegen NADPH₂, nicht die gegen NADH₂, gehemmt.Bei unseren Präparationsbedingungen befinden sich 80–90% der Gesamtaktivität der HAD und KAT im 20000 g-Überstand.Hohe spezifische Aktivitäten der HAD und KAT findet man in Herz, Antennendrüse und Darm, niedrige vor allem im Schwanzmuskel.HAD und KAT sind auch in den Organen des Flußkrebses proportionskonstante Enzyme. Durch Quotienten aus Aktivitäten von Schlüsselenzymen des Fettsäureabbaus, der Glykolyse und des Citratcyclus wurden die Organe hinsichtlich ihres energieliefernden Stoffwechsels charakterisiert.

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Enzymes of fatty acid oxidation in the organs of the crayfish orconectes limosus Rafinesque

Summary Three enzymes of fatty acid oxidation have been detected in the organs of the crayfish: Crotonase (E.C.: 4.2.1.17),Hydroxyacyl-CoA-dehydrogenase (HAD, E.C.: 1.1.1.35) and Ketoacyl-thiolase (KAT, E.C.: 2. 1. 3. 9.).The properties of HAD and KAT have been investigated at the conditions of our tests. In general the enzymes of the crayfish resemble to those of vertebrates. In contrary to the HAD of vertebrates the HAD of the crayfish shows activity not only with NADH₂ but also with NADPH₂ (50–75% of the activity with NADH₂). The activity with NADPH₂ is inhibited by 10^–3 and 2·10^–3 M o-phenanthroline, the activity with NADH₂ is not.In our preparations 80–90% of the total activity was localized in the 20 000 g — supernatant.High specific activities of HAD and KAT are found in the heart, antennal gland and the intestine, low predominantly in the abdominal muscle.As in vertebrates and insects HAD and KAT in the different organs have constant proportions in their activities. The organs of the crayfish are characterized with regard to their energy supply by help of quotients of the activities of keyenzymes of fatty acid oxidation, glykolysis and citrate cycle.

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Fräulein C. Kretschmer, Herrn H. Förstel und meiner Frau danke ich für zuverlässige Mitarbeit.     

Histochemischer Nachweis von Cholindehydrogenase in tierischen Geweben

Zusammenfassung Eine Methode zum histochemischen Nachweis der Cholindehydrogenase wird mitgeteilt. In diesem System werden keine zusätzlichen Cofaktoren benötigt. Das Enzym wird durch Hg⁺⁺-Ionen, Stickstofflost und Aureomycin gehemmt. Es ist resistent gegenüber Cyanid, Fluorid und Jodessigsäure. Seinph-Optimum liegt zwischenph 7,3 und 7,8.Im wesentlichen ist das Enzym auf Leber und Niere der untersuchten Nager beschränkt.Mit 3 TextabbildungenDer Deutschen Forschungsgemeinschaft danke ich für die Gewährung eines Stipendiums.     

Verwertung von Cytosin und Uracil durch Hydrogenomonas facilis und Hydrogenomonas H 16

Zusammenfassung Hydrogenomonas facilis verwertet Thymin, Cytosin und Uracil als N-Quelle, Hydrogenomonas H 16 dagegen nur Cytosin. Durch Hydrogenomonas facilis wird Cytosin vollständig abgebaut, durch Hydrogenomonas H 16 lediglich desaminiert, wobei das entstehende Uracil in der Nährlösung angehäuft wird.In zellfreien Extrakten aus Hydrogenomonas H 16, die mit Cytosin als einziger N-Quelle gewachsen waren, wurde Cytosindesaminase-Aktivität im gekoppelten enzymatischen Test nachgewiesen, wobei Glutaminsäuredehydrogenase als Hilfsenzym diente. Mit Ammoniumchlorid herangezogene Zellen zeigten während der Indubation in Cytosin-haltigem Medium einen 18fachen Anstieg der spezifischen Cytosindesaminase-Aktivität.

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Utilisation of cytosine and uracil by Hydrogenomonas facilis and Hydrogenomonas H 16

Summary Hydrogenomonas facilis utilizes thymine, cytosine, and uracil as nitrogen sources; Hydrogenomonas H 16, however, only cytosine. Cytosine is completely metabolised by Hydrogenomonas facilis, but is only deaminated by Hydrogenomonas H 16 and the resulting uracil accumulates in the culture medium.Cytosine deaminase activity was demonstrated in cell-free preparations from Hydrogenomonas H 16 which had been grown with cytosine as the sole nitrogen source. Enzyme activity was measured using a coupled enzyme assay in which glutamic acid dehydrogenase served as an accesory enzyme. An 18-fold increase in cytosine deaminase activity was observed in ammonia-grown cells during the incubation in a cytosine containing medium.

     

Studies on a bacteriolytic enzyme of Archangium violaceum (Myxobacteriales)

Summary The bacteriolytic enzyme which is released by Archangium violaceum into the growth medium was purified 650-fold by precipitation with acetone, followed by fractionated precipitation with acetone and chromatography with Sephadex G200. The fractionation with gel chromatography separated three proteolytic enzymes from one with bacteriolytic activity. The bacteriolytic enzyme has a pH optimum of 6 in universal buffer, is more stable in the alkaline than in the acidic region, and has an optimal activity in 0.025M Tris-buffer at pH 7.1. The lytic activity of the enzyme against Micrococcus lysodeikticus is stimulated by low concentrations of certain bivalent cations and decreased by higher concentrations of the same reagents. The activity is inhibited by EDTA. p-Mercuribenzoic Acid and N-acetyl-glucosamine have no influence on the activity. The kinetics of the reaction follow the law of Michaelis and Menten, is of zero order reaction, and the activation energy of the rate determining step is 10.7 kcal.

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Zusammenfassung Das bakteriolytische Enzym, das aus der Nährlösung von Archangium violaceum isoliert wurde, konnte durch Aceton-Fällung, fraktionierte Aceton-Fällung und Chromatographie an Sephadex G-200 650 fach gereinigt werden. Bei der Fraktionierung durch Gelchromatographie wurde gezeigt, daß 3 proteolytische Enzyme, neben dem bakteriolytisch aktiven, an die Nährlösung abgegeben werden. Das bakteriolytische Enzym hat ein pH-Optimum in Universalpuffer bei pH 6, ist im alkalischen Bereich stabiler als im sauren und hat eine optimale Aktivität in 0,025M Trispuffer pH 7,1. Die lytische Aktivität gegenüber Micrococcus lysodeikticus wurde durch geringe Konzentrationen von Erdalkali-Ionen erhöht und durch höhere Konzentrationen derselben Ionen erniedrigt. EDTA verringerte die lytische Aktivität während p-Mercuribenzoesäure und N-Acetylglucosamin ohne Einfluß auf dieselbe waren. Die Reaktionskinetik folgt dem Gesetz von Michaelis u. Menten und ist in Übereinstimmung mit einer Reaktion nullter Ordnung. Die Aktivierungsenergie des geschwindigkeitsbestimmenden Schrittes beträgt 10,7 kcal.

     

Verwertung von Pyrimidinderivaten durch Hydrogenomonas facilis

Zusammenfassung Dihydrouracil, 3-Ureidopropionat und -Alanin, die Intermediärprodukte des reduktiven Cytosinabbaues, wurden durch Zellen von Hydrogenomonas facilis als Kohlenstoff- und Stickstoffquelle verwertet, Barbitursäure und Malonsäure, die Intermediärprodukte des oxidativen Abbaues, dagegen nicht. Während der Inkubation mit Extrakten aus Zellen, die mit Cytosin als N-Quelle gewachsen waren, wurde Uracil zu Dihydrouracil, 3-Ureidopropionat und -Alanin umgesetzt. Barbitursäure und Harnstoff waren hierbei nicht nachweisbar. Nach Anzucht mit Cytosin waren die Enzyme Cytosin-Desaminase, Dihydrouracil-Dehydrogenase, Dihydrouracil-Hydrase und 3-Ureidopropionase, nicht aber Uracil-Oxidase in zellfreien Extrakten nachweisbar. Gegenüber den mit NH₄Cl gewachsenen Zellen zeigten die mit Cytosin herangezogenen Zellen eine deutlich erhöhte spezifische Aktivität an Dihydrouracil-Dehydrogenase und Dihydrouracil-Hydrase, nicht aber an Cytosin-Desaminase. Diesen Befunden zufolge unterliegen die Pyrimidinderivate Cytosin und Uracil in Hydrogenomonas facilis einem reduktive Abbau.

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Utilization of pyrimidine derivatives by Hydrogenomonas facilis I. Intermediates and enzymes of cytosine degradation

Summary Dihydrouracil, 3-ureidopropionate and -alanine, intermediates involved in the reductive degradation of cytosine, were utilized as a carbon and nitrogen source by cells of Hydrogenomonas facilis. Barbiturate and malonate, intermediates of the oxidative pathway, were not utilized. Uracil was converted to dihydrouracil, 3-ureidopropionate and -alanine during incubation with extracts from cells grown with cytosine as a nitrogen source. Barbiturate and urea were not detected under these conditions. The enzymes cytosine deaminase, dihydrouracil dehydrogenase, dihydrouracil hydrase and 3-ureidopropionase but not uracil oxidase were demonstrated in cell-free extracts from cells grown with cytosine. The specific activity of dihydrouracil dehydrogenase and dihydrouracil hydrase but not of cytosine deaminase was significantly higher in extracts from cytosine grown cells, as compared with extracts from cells grown with ammonia. These data indicate that cytosine and uracil undergo a reductive degradation in cells of Hydrogenomonas facilis.

     

The detoxication enzymes causing organophosphate resistance in the housefly; Properties, inhibition, and the action of inhibitors as synergists

A comparison of the breakdown enzymes in OP-resistant houseflies and the ali-esterase of susceptible flies shows differences as well as similarities. In general both are rapidly phosphorylated by the OP-compounds, but only in the case of the breakdown enzymes dephosphorylation can take place. The rate of phosphorylation of the breakdown enzymes by the toxicants is sometimes higher, sometimes lower than that of the ali-esterase with the same compound. Studies of the breakdown reaction showed the Km to be in the order of 10^–6–10^–8 M, the turnover numbers to range from 0.05–0.7 per minute. Whether dephosphorylation takes place depends on the type of breakdown enzyme and the nature of the phosphoryl group. For instance, in the malathion-resistant strains only the dimethyl phosphorylated enzymes are dephosphorylated, but the dimethyl and dipropyl phosphorylated enzymes are not. Dephosphorylation of the enzymes of diazinon-resistant strains occurs with both dimethyl and diethyl, but not with dipropyl compounds. Consequently hydrolysis of some OP-compounds can be blocked by the addition of others that irreversibly phosphorylate the enzymes. Substances that can block the reaction have a marked synergistic action when sublethal doses are applied simultaneously with the OP-compound to which a strain is resistant. There is evidence that the breakdown enzymes can still hydrolyse methyl butyrate and some other esters although at a rate which is only a few percents of that of the aliesterase. The problem as to how enzymes with a rather low breakdown capacity could confer high resistance is discussed.

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Zusammenfassung In phosphorsäureester-resistenten Stubenfliegen sind Abbaufermente vorhanden, die die Fähigkeit zur Hydrolyse von Sauerstoffderivaten derjenigen Verbindungen besitzen, gegen die Resistenz aufgetreten ist. Diese Enzyme entstehen an Stelle einer in anfälligen Fliegen vorkommenden Ali-Esterase. Das Auftreten der Ali-Esterase und der Abbaufermente unterliegt dem Einfluß verschiedener Allele eines Gens. Durch eine Kombination biochemischer, genetischer und toxikologischer Arbeitsmethoden wurden Bedeutung und Eigenschaften dieser Enzyme untersucht.Die Hemmung der Ali-Esterase durch organische Phosphorverbindungen wird durch eine irreversible Reaktion hervorgerufen, bei der eine Dialkylphosphorylierung des Enzyms stattfindet. Die modifizierten Ali-Esterasen oder Abbaufermente unterscheiden sich von der Ali-Esterase dadurch, daß der Reaktion mit den Produkten, gegen die Resistenz besteht, eine langsam fortschreitende Dephosphorylierung folgt. Diese Fähigkeit zur Hydrolyse bestimmter Verbindungen muß die Selektion der Allele hervorgerufen haben, die für die Bildung dieser Enzyme verantwortlich sind. Darüber hinaus wurden aber noch andere Veränderungen herbeigeführt: ein Verlust der Ali-Esterase-Aktivität, eine Änderung in der Affinität einer Azahl Phosphorverbindungen gegenüber und eine Verminderung der Stabilität.Vier verschiedene Abbaufermente sind in verschiedenen resistenten Stämmen vorhanden. Zwei von ihnen können Diäthylverbindungen mit einer Umsatzzahl von 0.05 und 0.25 pro Minute hydrolysieren. Das Enzym mit der höheren Umsatzzahl spaltet auch Dimethyl-Derivate; die Affinität für diese Verbindungen erscheint aber zur Ausbildung eines hohen Resistenzgrades zu niedrig. Zwei andere Fermente finden sich in Malathion-resistenten Stämmen, von denen eines wegen seiner wahrscheinlichen Instabilität in vitro nicht untersucht werden konnte. Das andere Enzym spaltet Malaoxon und einige weitere Methylverbindungen, wobei die Affinität Malaoxon gegenüber höher ist, was möglicherweise die Ursache der ziemlich hohen Spezifizität bildet.Obwohl die Umsatzzahlen sehr niedrig sind und die Enzyme wohl nur einen geringen Teil des in vivo applizierten Giftes zu hydrolysieren vermögen, gestattet aber anscheinend ihre hohe Affinität für Phosphorverbindungen die für die Cholinesterasehemmung notwendige Inhibitormenge zu reduzieren und verursacht so die Resistenz.Die Abbaufermente können bestimmte Typen von Phosphorsäureestern hydrolysieren; sie werden aber noch durch andere Verbindungen dieser Stoffklasse irreversibel gehemmt. Solche Präparate sind zur Blockierung der in vitro stattfindenden Hydrolyse befähigt und besitzen einen stark synergistischen Effekt, wenn sie mit den Thioverbindungen, gegen die Resistenz besteht, gleichzeitig appliziert werden. So werden die Abbaufermente der Malathion- und Parathion-resistenten Stämme durch Propylparaoxon irreversibel phosphoryliert. Sublethale Mengen dieser Substanz reduzieren die Resistenz beträchtlich.