大肠杆菌NAD+合成关键酶的克隆表达及发酵优化

【目的】烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD~+)在细胞基因表达、氧化还原反应、能量代谢以及调控细胞生命周期中具有重要的作用,其细胞内含量是能量效率的关键因素。强化辅因子合成策略,获得高产NAD~+菌株,对于NAD~+依赖型氧化还原反应的速率和调节相关生化合成途径的代谢流具有重要意义。【方法】首先通过内源性调节,对代谢途径中的关键酶基因进行强化,过量表达和共表达NAD~+合成途径中的关键酶基因pncB、nadD和nadE;其次,通过外源调节增加NAD~+前体物,优化诱导条件提高发酵过程中关键酶的表达量,增加NAD~+的合成量;最后在单因素优化试验的基础上,以NAD~+含量为响应值,采用Box-Bohnken试验设计方法,研究3个显著性影响因素相互作用对NAD~+积累量的影响,确定最佳的优化条件。【结果】根据关键酶基因强化策略,构建了7株重组菌,其中重组菌E.coli BL21/p ET-21a-nad E-pncB胞内NAD~+含量相比初始菌株E.coli BL21/pET-21a提高了405.2%。通过对该菌株诱导条件和NAD~+合成前体的优化,使用Design Expert 8.0分析实验数据,得出该重组菌株的最佳发酵条件为:诱导温度控制在15–20 oC,OD_(600)为0.6–0.8时添加IPTG 0.63 mmol/L、烟酸15.8 mg/L、诱导时长控制在24 h。NAD~+含量在最优条件下实验验证值可达43.16μmol/g DCW,与优化前相比提高了123.6%,与初始菌株相比提高了1029.8%。【结论】在大肠杆菌中共表达关键酶基因pncB和nadE,胞内NAD~+合成量明显增加,前体物以及诱导条件的外源调节使NAD~+积累量达到最佳优化值。实现了提高NAD~+含量的目标,胞内辅因子浓度的增加为提高生物催化效率奠定了可行性基础。     

SLC25A51——首次发现的哺乳动物细胞线粒体NAD+转运体

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD⁺)及其还原形式NADH是糖酵解和线粒体呼吸作用中重要的辅因子,在能量代谢中发挥重要作用。当线粒体缺乏NAD⁺细胞因不能持续产生ATP而出现功能异常。以往研究发现酵母与植物的线粒体上均存在NAD+转运体,可以将NAD+转运至线粒体。但哺乳动物线粒体内膜上是否有NAD+转运体,一直存有争议。近来,美国宾夕法尼亚一研究团队首次证明SLC25A51可以在哺乳动物线粒体上发挥NAD+转运蛋白的功能。     

槲皮素对节律钟基因的调控研究*

目的:探讨槲皮素对节律钟基因表达的影响。方法:通过50%的马血清刺激诱导人骨肉瘤U2OS细胞同步化,利用槲皮素处理同步化后的U2OS细胞。进一步利用荧光定量PCR检测节律钟关键基因的变化。利用western blot检测槲皮素对组蛋白乙酰化的影响,并且通过试剂盒测定槲皮素对细胞内氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的影响。通过尼克酰胺和槲皮素同时处理U2OS细胞,利用荧光定量PCR检测节律钟关键基因的变化。结果:U2OS细胞经过槲皮素处理后节律钟关键基因芳烃受体核转位蛋白3(brain and muscle Arnt-like protein-1,BMAL1),节律周期蛋白2(Period 2, PER2),孤儿核受体alpha(REV-ERBα)和蓝光受体蛋白1(Cryptochrome 1,CRY1)在转录水平的表达水平有明显的升高。槲皮素处理可以显著降低U2OS细胞的组蛋白乙酰化的水平,并且显著升高U2OS细胞内的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平。进一步研究发现,尼克酰胺(Nicotinamide,NAM)处理完全抑制了槲皮素对节律基因的影响。结论:槲皮素显著地激活了节律钟关键基因的mRNA表达水平,槲皮素对于节律基因的调控依赖于Sirtuins的活性,其机制可能是由于槲皮素增加了细胞内的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的水平所导致。     

两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究*

通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD₆₀₀达150,蛋白表达量4.8g·L^-1,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。     

基因重组与外源铁离子对大肠杆菌合成血红素的影响

【背景】大肠杆菌通过C5途径合成卟啉及血红素,5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,5-ALA)是C5途径中关键的前体物质,血红素由原卟啉IX (protoporphyrin IX, PPIX)螯合一个铁离子所形成,目前5-ALA与PPIX的外泌对卟啉的积累和血红素合成的影响尚不清楚。【目的】构建5-ALA外泌蛋白基因rhtA和卟啉外泌蛋白基因tolC双缺失的大肠杆菌以积累卟啉,同时外源添加铁离子,并过表达亚铁螯合酶基因hemH及参与铁摄取的基因efeB,促进卟啉向血红素的转化。【方法】通过Red同源重组敲除大肠杆菌BL21(DE3)的rhtA和tolC,并外源添加不同浓度的FeSO₄及Fe₂(SO₄)₃,同时构建重组质粒pEHE过表达hemH和efeB,检测卟啉和血红素含量,分析卟啉向血红素的转化。【结果】敲除rhtA和tolC对菌体生长无显著影响,与野生菌WT相比,敲除菌株WT-RT的卟啉含量增加,血红素合成略有提升。外源添加100μmol/L Fe²⁺     

大肠杆菌σ70启动子的识别

应用多样性增量结合二次判别分析（Increment of Diversity with Quadratic Discriminant analysis,IDQD）方法,对大肠杆菌σ^70启动子进行识别。使用受试者操作特性（receiver operating characteristic,ROC）曲线和精度召回率曲线（Precision Recall Curves,PRC）进行性能评估。10-fold交叉检验给出,在正负集之比为1：1时,ROC曲线下面积和PRC曲线下面积均为95％。结果表明,IDQD算法有能力应用于原核启动子的识别。识别精度高于现有算法。     

基于转录组测序的细风轮花青素合成途径及关键酶基因分析

为进一步理解细风轮花青素合成途径,本研究利用华大基因BGISEQ-500平台对细风轮中的根、茎、叶、花4个组织进行了转录组测序,从头组装后得到128 856个Unigene。KEGG通路表明有40个Unigene编码了细风轮的花青素生物合成途径中6个关键酶。我们对其中的关键酶DFR（二氢黄酮醇还原酶）进行同源比对和空间结构模拟,结果显示DFR序列和结构均具有良好的保守性,且具有高度保守的NAD⁺结合位点,其二级结构主要由α螺旋和β折叠组成,在空间上α螺旋包裹着β折叠,形成“夹心饼干”样结构。     

基因重组大肠杆菌表达HrpNEcc蛋白的发酵条件及诱导条件优化

对已构建好的表达HrpNEcc蛋白的工程菌BL21(DE3)/pET30a(+)hrpN Ecc的摇瓶发酵条件及乳糖诱导进行优化, 通过在7L发酵罐中放大发酵实验,以期提高蛋白产量并降低生产成本。在摇瓶中优化的发酵及诱导条件是：5% 的接种量,TB培养基,菌体培养至对数生长前期,添加3g/L外源诱导剂乳糖时,HrpNEcc蛋白产量可达417.60mg/L,比不添加乳糖时提高了36.73%,比用IPTG诱导时提高了16.85%。7L发酵罐中发酵,获得菌体湿重达到57.24g/L（WCW）,可溶性HrpNEcc蛋白产量占细胞总蛋白的50.2%,为3.29 g/L。     

产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达*

为了实现GL-7-ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达 ,将GL-7-ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列 ,并将其连接到质粒pET-28a ,通过筛选得到了表达GL-7-ACA酰化酶的重组菌BL21 (DE3) /pET ACY。分别考察了诱导温度、菌浓 (OD₆₀₀)、诱导剂IPTG的用量等因素对重组菌表达GL-7-ACA酰化酶的影响。在优化条件下 ,GL-7-ACA酰化酶酶活可达 266U/L。GL-7-ACA酰化酶经一步DEAE Sepharose纯化即     

pH对香菇多糖含量及合成关键酶基因转录水平的影响

香菇是一种药食两用真菌,其主要代谢产物香菇多糖具有较高药用价值,研究香菇多糖代谢途径对提高香菇多糖含量具有较大参考价值。以香菇新808为材料,苯酚-硫酸法测定不同pH发酵条件下香菇多糖的含量,通过荧光定量PCR及3个软件(GeNorm、NormFinder和BestKeeper)筛选出了不同pH条件香菇稳定表达的内参基因,并以此为基础分析多糖代谢途径中3个关键酶基因的转录表达水平。结果表明,在实验用pH值范围内(5.0-7.0),香菇菌丝体生物量和胞内多糖含量随着pH值的升高而增加,而胞外多糖含量则呈下降趋势;18S和rpl4分别被鉴定为不同pH发酵条件下最稳定和最不稳定表达的内参基因。不同pH发酵条件UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)的相对表达量明显高于葡萄糖磷酸变位酶基因(PGM)与葡萄糖磷酸异构酶基因(PGI);PGM相对表达量小且稳定,PGI相对表达量较小,但随pH值的变化波动较大。不同pH对香菇生物量及多糖含量的影响存在差异,3个关键酶基因的转录表达水平与多糖含量之间无明显相关性。     

代谢工程改造大肠杆菌合成己二酸

己二酸是一种具有重要应用价值的二元羧酸,是合成尼龙-66的关键前体。目前,生物法生产己二酸存在生产周期长、生产效率低的问题。本研究选择一株野生型高产琥珀酸菌株大肠杆菌(Escherichia coli) FMME N-2为底盘细胞,首先通过引入逆己二酸降解途径的关键酶,成功构建了可合成0.34 g/L己二酸的E. coli JL00菌株;接着,对合成路径限速酶进行表达优化,使E. coli JL01菌株在摇瓶发酵条件下产量达到0.87 g/L;随后,通过敲除sucD基因、过表达acs基因和突变lpd基因的组合策略平衡己二酸合成前体的供应,优化菌株E. coli JL12己二酸产量进一步提升至1.51 g/L;最后,在5 L发酵罐上对己二酸发酵工艺进行优化。工程菌株经72 h分批补料发酵,己二酸的产量达到22.3 g/L,转化率为0.25 g/g,生产强度为0.31 g/(L·h),具备了一定的应用潜力。本研究可为包括己二酸在内的多种二元羧酸细胞工厂的构建提供理论依据和技术基础。     

利用CRISPRi挖掘大肠杆菌生物合成D-泛酸的关键基因

【目的】D-泛酸(D-pantothenic acid,DPA)是一种重要的功能化合物,被广泛应用于医疗保健、化妆品、动物食品和饲料等领域,具有良好的市场前景及应用。本研究以实验室保藏的大肠杆菌菌株DPAP10为底盘菌株,利用CRISPR干扰(clustered regularly interspaced palindromic repeats interference,CRISPRi)技术,筛选影响工程菌株DPA生物合成的内源性基因靶点。【方法】构建了p Target和pd Cas9的双质粒CRISPRi系统,可以实现对基因单个或组合表达抑制,摇瓶发酵检测基因抑制对DPA合成的影响;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)检测了基因抑制后的转录水平;通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测了中间代谢物分析代谢通路变化。【结果】成功从126个靶基因中筛选得到5个显著影响DPA合成的关键...     

大肠杆菌tRNASec关键核苷酸位点

在原核生物中,硒蛋白合成需要tRNA~(Sec) (SelC)与硒代半胱氨酸合成(Sec synthase, SelA)、硒代半胱氨酸特异性延伸因子(Sec-specificelongationfactor,SelB)之间相互作用。【目的】基于大肠杆菌掺硒机器,寻找tRNA~(Sec)骨架上关键核苷酸位点,为解决硒蛋白目前面临的掺硒效率较低、产量低的问题提供新思路。【方法】以大鼠细胞质型硫氧还蛋白还原酶(thioredoxinreductase1,TrxR1)为掺硒模式蛋白为定点突变tRNA~(Sec),转化至BL21 (DE3) gor-获得阳性重组菌株(携带pET-TRSter/pSUABC’),用于表达大鼠硒蛋白TrxR1,然后使用2￠,5￠ADP-Sepharose亲和层析和凝胶过滤两步法分离纯化TrxR1,最后利用经典硒依赖型DTNB还原反应测定TrxR1的酶活,分析关键核苷酸位点,评价掺硒效率。【结果】在存在SECIS元件的前提下,当SelA、SelB、tRNA~(Sec)共表达时,与野生型相比,携带突变型tRNA~(Sec)所共表达的TrxR1酶活力呈现不同程度的降低,其中E.colitRNA~(Sec)的G18、G19这两个位点的所有的TrxR1酶活远低于野生型(10%);然而,a26和b7的酶活相对较高。【结论】E. coli tRNA~(Sec)骨架上G18和G19位点对于维持tRNA稳定性和灵活性发挥了关键作用,位点突变引起tRNA结构变化会影响tRNA~(Sec)与掺硒元件的互作,因此有望通过改造tRNA核苷酸位点来提高硒蛋白的掺硒效率。     

Recombinant streptokinase production by fed-batch cultivation of Escherichia coli

Streptokinase (SK) is a specific effective medicine for thrombolytic therapy of acute myocardial infarction. This study established a process for the pilot production of recombinant streptokinase (r-SK). Engineering bacteria were fermented in a 20-l fermentor to produce r-SK. After simple renaturation and purification, 12.9 g of r-SK with 97.8% of purity and about 10⁵ IU mg⁻¹ of specific activity was obtained, the yield of protein and the recovery of activity were 44.9% and 51%, respectively. Finally, the r-SK was made into about 700 doses of injections for clinical applications.     

鸡源大肠杆菌毒力基因检测及分子流行特征

[目的] 本试验旨在阐明鸡源大肠杆菌致病性及分子流行特性,为探索大肠杆菌流行途径制定合理的防控策略提供新思路。[方法] 2018–2019年在河北省采集病死鸡肝脏样品,通过选择培养基筛选、生化鉴定、血清凝集试验对分离菌株进行系统鉴定,应用PCR方法检测分离株中毒力基因流行情况。参考系统发育群分类方法对大肠杆菌进行分群分析,并参照McMLST网站数据库提供的7对管家基因序列进行多位点序列分型（multilocus sequence typing,MLST）分析。[结果] 结果显示,56株分离株符合大肠杆菌生化特征,分为8个生化表型,B4（30.36%）、B5（25%）和B2（23.21%）为主要生化表型。56株分离株大肠杆菌血清凝集试验均呈阳性,分为11种血清型,O₇₈（26.79%）、O₂（23.21%）、O₁₅₇（17.86%）和O₁（14.29%）为主要流行血清型。56株大肠杆菌共检测出15种肠外大肠杆菌毒力基因,未检出papC、ibeA和ibeB基因。黏附相关基因fimC和抗血清存活因子相关基因ompA携带率为100%。aatA、yijP、irp2、mat、iss,检出率分别为98.21%、98.21%、98.21%、96.43%、92.86%。同时,大肠杆菌与铁转运相关基因iroN、fyuA、iucD、irp2检出率均在80%以上。56株大肠杆菌中有20株属于肠出血型大肠杆菌（enterohemorrhagic E.coli,EHEC）,其次是肠聚集型大肠杆菌（enteroaggregative E.coli,EAEC）（n=4）、肠产毒素型大肠杆菌（Enterotoxigenic E.coli,ETEC）（n=2）。这些菌株D群分离株较多,其次是B2群。通过MLST分型分析,共分为22个ST型,其中ST88（n=7）、ST85（n=6）、ST243（n=6）型为主要流行型。[结论] 结果显示大肠杆菌血清型多样,毒力因子种类繁多,致病性大肠杆菌同时携带多种毒力基因,表明动物源大肠杆菌具有较强的毒力基础。     

CRISPR/Cas9编辑大肠杆菌工程菌生产氨基葡萄糖

【背景】氨基葡萄糖(glucosamine, GlcN)及其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)是合成糖胺聚糖的重要前体物质,在医药、化妆品和保健品领域具有广泛的应用价值。传统的生产方式存在诸多弊端,如环境污染、原料限制、不适于海鲜易过敏人群等问题,因此利用微生物发酵法生产GlcN和GlcNAc越来越受到青睐。【目的】利用微生物发酵生产并提高N-乙酰氨基葡萄糖的产量,探索分子改造及发酵条件优化策略。【方法】以大肠杆菌MG1655为出发菌株,首先利用表达载体共表达大肠杆菌来源的glmS和酿酒酵母来源的gna1,构建GlcNAc的生物合成路径,然后利用CRISPR/Cas9技术敲除GlcNAc的分解代谢与转运途径,以提高GlcNAc的产量,最后结合发酵条件优化使GlcNAc的产量得到进一步提升。【结果】通过分子改造得到一株产GlcNAc菌株RY-5,发酵20 h后GlcNAc的产量达到了2.36 g/L,相较于初始构建的菌株RY-1提高了29倍,进一步对装液量和诱导剂IPTG的添加时间等条件进行发酵优化,GlcNAc产量达到了7.74g/L,与优...     

和厚朴酚对大肠埃希氏菌生物被膜形成的抑制机制

【目的】研究不同浓度的和厚朴酚(honokiol)抑制大肠埃希菌(Escherichia coli)的供试菌株10389生物被膜(biofilm,BF)形成的作用机制。【方法】用氯化三苯基四氮唑比色法(TTC)和四唑盐减低法(XTT)测定honokiol抑制E.coli10389生物被膜形成的药物最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)及其抑制作用与时间的关系;通过qRT-PCR法检测不同浓度的honokiol对E. coli 10389生物被膜形成基因和群体感应系统相关基因表达量的影响;通过生物发光法和qRT-PCR法检测亚-MIC honokiol对E. coli 10389呋喃糖基硼酸二酯(AI-2)及其调控的与生物被膜形成相关的下游基因表达量的影响。【结果】Honokiol能抑制E.coli10389生物被膜的形成,但不同浓度的honokiol抑制E. coli 10389 BF形成的作用机制不同。其中,与对照组相比,MIC的honokiol能使E. coli 10389 BF形成相关基因编码毒素(hha)和细菌酸性调节因子(ari R) mRNA的表达量显著提高,抗毒素...     

模块化工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸

L-色氨酸作为一种必需氨基酸,广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前,微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此,本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等,获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上,将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块,并借助启动子工程,通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块,获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中,工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L,糖酸转化率提升至18.55%,达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略,构建了高产L-色氨酸生产菌株,为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。     

血管内皮生长因子单链抗体在大肠埃希菌中的高效表达

以血管内皮生长因子单链抗体(pTA-anti-VEGF-scFv)为研究对象,考察不同培养基配方和培养条件对血管内皮生长因子单链抗体表达量的影响。经均匀设计试验,确定工程菌R22-4高效表达重组抗体的最佳培养基为以2×YT培养基为基础,添加质量分数为0.3%葡萄糖、1.0%酪蛋白胨、0.4%玉米浆、0.133%KH_2PO_4、0.159 6%K_2HPO_4、0.532%NaCl、0.01%微量元素、0.04%维生素B_1;诱导条件为30℃、0.1 mmol/L IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导5 h。经ELISA (酶联免疫吸附测定,enzyme linked immunosorbent assay)检测,血管内皮生长因子单链抗体的表达量是原始对照组的2.27倍,实现了血管内皮生长因子单链抗体在大肠埃希菌中的高效表达。