五步蛇毒降纤酶的快速分离与纯化

目的：建立快速分离纯化降纤酶工艺方法适合于规模化生产。方法以五步蛇毒为原料。采用ＥＤＴＡ络合－硫氰酸钾沉淀初步分离与快速离子交换和凝胶层析化相结合。分离纯化出符合新部颁标准的降纤酶成分。结果经初步分离五步蛇粗毒可使出血毒去除９２％,非类凝血酶（ＴＬＥ）成分去除６５．１７％,ＴＬＥ活性回收保持９２．６８％以上。层析组份中至少含有４种ＴＬＥ,其中１种为降酶成分。初步化学分离,。离子交换柱层析和凝胶过滤     

蝮蛇毒蛋白C激活物对凝血系统的影响

目的研究蝮蛇毒纯化蛋白C激活物(PCA)的抗凝机制。方法测定PCA对正常人混浆KPTT、PT、TT的影响,对血液凝血活酶生成试验(BTGT)及PA二期法的影响以及对白兔的KPTT和Fgn的影响。结果PCA在最终浓度为0.025mg/L时对正常人混浆KPTT可明显延长,但PT和TT不受影响;当它的浓度增加到50mg/L,PT也可延长,但TT依然无明显变化;最终浓度为0.0125mg/L时,血液凝血活酶生成明显受抑制;当它的浓度增加到2.5mg/L,凝血酶生成显著减少,但抗凝血酶时间始终无明显变化;PCA可明显延长白兔的KPTT。结论PCA在低浓度时首先抑制凝血系统第一阶段内凝途径,在高浓度时也妨碍外凝途径或共同途径,BTGT和PA二期法比KPTT和PT敏感;PCA具有体内抗凝作用。     

溶液环境对百日咳疫苗分离纯化的影响

针对百日咳疫苗在低盐条件下不稳定, 容易聚集而导致层析过程收率低、分离度低的难题, 实验中选择脲作为稳定剂来改善百日咳疫苗所处的溶液环境, 并采用离子交换层析和凝胶过滤层析进行百日咳疫苗的分离纯化, 通过ELISA抗原活性测定和还原性SDS-PAGE等方法研究了脲对百日咳疫苗分离纯化的影响。结果表明, 在流动相中加入 2 mol/L脲作为稳定剂, 能显著提高离子交换层析和凝胶过滤层析中的PT和FHA活性回收率、凝胶过滤层析的分离度、PT和FHA的纯度。这些结果对百日咳疫苗的分离纯化和层析工艺优化提供了重要的依据和参考。     

五步蛇毒AAVC-I对人口腔鳞癌细胞的增殖抑制作用

目的观察祁门五步蛇毒抑瘤组分I(Agkistrodon acutus venom component-I, AAVC-I)对人口腔鳞癌Tca8113细胞的增殖抑制及凋亡的影响。方法以离子交换和凝胶过滤法从安徽祁门五步蛇粗毒中分离纯化五步蛇毒AAVC-I。常规培养口腔鳞癌Tca8113细胞,观察正常细胞形态学。实验分为对照组(加入等量细胞培养液)和实验组(分别加入AAVC-I 2.5、5.0、10.0μg/ml)。采用MTT法检测不同浓度(2.5、5.0、10.0μg/ml)的AAVC-I对Tca8113细胞24、48及72 h的增殖抑制率,倒置显微镜观察不同浓度AAVC-I处理后的细胞形态变化,透射电镜及AO/EB双荧光染色观察AAVC-I对细胞凋亡的影响,并与对照组进行比较。结果与对照组比较,实验组AAVC-I对Tca8113细胞增殖具有明显抑制作用(P0.05);AAVC-I处理后,倒置显微镜下可见明显细胞凋亡现象,电镜下可见细胞核染色质、胞质浓缩及凋亡小体;AO/EB双荧光染色可见细胞膜完整,细胞核致密浓染,染成黄绿色荧光的早期凋亡细胞及细胞膜破损,细胞核浓聚及偏移,呈橘红色荧光的晚期凋亡细胞。结论祁门五步蛇毒AAVC-I能抑制人口腔鳞癌Tca8113细胞生长增殖,诱导其凋亡。     

产纳豆激酶菌株Bacillus sp.ZLK08的分离及酶纯化

获得稳定产纳豆激酶菌株,为高酶活纳豆激酶产生菌的改造奠定基础.取各来源纳豆,用平板梯度稀释法分离菌株,测定菌株酶活,利用16S rDNA鉴定产酶菌株,凝胶过滤法纯化纳豆激酶并SDS-PAGE检测分析.成功获得稳定产酶芽胞杆菌Bacillus sp.ZLK08,16S rDNA分析表明其与GenBank中序列同源率达到99％,液体发酵表明酶活达到2.5 FU/mL,经纯化,SDS-PAGE表明纳豆激酶分子量为28.46 ku.分离出的Bacillus sp.ZLK08菌株能稳定产纳豆激酶且具有较高酶活.     

蝮蛇毒蛋白C激活成份的柱层析分离及生物学性质

本文以浙江产蝮蛇毒为材料,经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００和ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ５０二次柱层析,分离到的峰Ⅱ蛋白组份具有强烈抗血液凝固活性,并能够激活人血浆中的蛋白Ｃ,特异地使发色底物分解而产生颜色,生色反应光密度变化确定峰Ⅱ组份激活作用的大小。峰Ⅱ组份无直接生色作用,其激活血浆蛋白Ｃ的反应曲线类似国外同类产品Ｐｒｏｔａｃ,与激活物的蛋白浓度和血浆浓度成正比关系,但激活作用较Ｐｒｏｔａｃ弱。     

马氏蝎毒毒素的分离纯化及其对红细胞膜作用的初步研究

本文用山东产马氏蝎(Buthus martensii kashi)粗毒为材料,经SephadexG-50和Sp-Sephadex C-25二次柱层析,分离纯化获得三个毒峰部分,毒性比粗毒分别提高40—100倍。 纯度鉴定表明三个毒峰的聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳均为一条带,等电点分别为8.7,9.1,9.1,分子量用SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分别为6,600,5,000和8,500。对纯化蝎毒毒素的氨基酸组分也作了分析。 蝎毒毒素对人红细胞膜作用的初步探索结果表明:它使人红细胞膜的Na.K-ATP酶活性和膜脂流动性有所降低。     

里氏木霉纤维素酶的分离纯化及酶学性质

通过(NH4)2SO4分级沉淀、HiPrep 26/10 Desalting凝胶色谱脱盐、Source 15 Q阴离子交换色谱技术,里氏木霉(Rut C-30)纤维素酶主要组分得以初步分开,再经过Source 15 S阳离子交换色谱、HiPrep Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱、Superdex 75 PrepGrade凝胶过滤色谱进一步分离纯化,得到2个纯化的内切葡聚糖酶组分EGⅡ、EGⅠ和一个外切葡聚糖酶组分CBHⅠ;经过SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,测得相对分子质量分别为5.22×104,5.62×104和6.90×104。EGⅡ的最适反应pH是5.6,最适反应温度为65℃;EGⅠ的最适反应pH是4.4,最适反应温度为55℃;以羧甲基纤维素(CMC)为底物时,EGⅠ、EGⅡ的米氏常数(Km)分别为2.20 mg/mL、3.38 mg/mL。CBHⅠ的最适反应pH是5.8,最适反应温度为60℃,以对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(PNPC)为底物时,米氏常数(Km)为0.12 mg/mL。     

意蜂工蜂酸性磷酸酶的纯化及其酶学特性

从意蜂Apis mellifera工蜂体内分离提纯酸性磷酸酶（ACPase, EC3.1.3.2）,并对其性质进行了研究。将工蜂酸性磷酸酶的初提物经分段盐析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析及Sephadex G-200 凝胶过滤等纯化步骤,得到经聚丙烯酰胺凝胶电泳为单一蛋白区带的酶液。提纯倍数为77.24,酶液比活力为16.22 U/mg（对硝基苯磷酸二钠作底物）。利用凝胶过滤法测定酶的相对分子质量为135 kD,SDS-PAGE测定酶的亚基相对分子质量为63 .1 kD。酶的等电点为4.46和4.79。非还原/还原（NR/R）单向、双向SDS-PAGE显示酶分子含有链内二硫键。对二级结构圆二色谱分析显示,酶分子中α-螺旋占13.84%,β-折叠占25.68%,无规则卷曲占56.34%。氨基酸组成分析结果表明, 酸性磷酸酶约含有507个氨基酸残基,富含门冬氨酸残基。     

巴西橡胶树胶乳磷脂酶A_2的分离纯化及部分酶学性质鉴定

通过丙酮沉淀、DEAE-纤维素离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤柱层析等分离纯化技术,对巴西橡胶树胶乳C-乳清磷脂酶A2进行分离纯化。用SDS-PAGE测定其亚基的相对分子量。测定该酶最适温度和pH,动力学常数Km和Vmax。并测定Ca2+和La3+对酶活性的影响。结果显示:该酶被纯化了49.47倍,产率为5.12%。SDS-PAGE检测为单一条带,其亚基相对分子量约43kDa。最适反应温度为37℃,最适反应pH为8.0,Km为0.44mmol·L-1,Vmax为7.22μmol.(mL.min)-1。最适Ca2+浓度为50μmol·L-1,稀土元素La3+离子对磷脂酶A2活性有抑制作用,但加入Ca2+后可缓解La3+对磷脂酶A2活性的抑制作用。胶乳C-乳清磷脂酶A2与其他植物磷脂酶A2在Ca2+的依赖性上存在差异。研究结果为今后探索橡胶树胶乳磷脂酶A2的催化机理、调节机理及生理功能等奠定了基础。