Vitalfärbestudien an Euglenaceen

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Vitalfärbungen mit Nilblau und Brillantcresylblau

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Über Vitalfärbung mit Bismarckbraun

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Vitalfärbung mit Derivaten des Phenothiazins

Zusammenfassung Zellkulturen wurden vergleichend mit Handelsfarbstoffen und gereinigten Farbstoffen aus der Phenothiazingruppe (Thionin und seine methylierten Homologe — Azurfarbstoffe — bis zum Methylenblau vitalgefärbt.Granuläre Farbstoffspeicherung wird erst dann beobachtet, wenn im zweifach aminosubstituierten Phenothiazin (Thionin) mindestens zwei Methylgruppen gegen Protonen an den Aminogruppen ausgetauscht worden sind, wie dies bei Azur A der Fall ist.Dieser Befund läßt sich nur bei Verwendung gereinigter Farbstoffe erheben. Die hier verwendeten Handelsfarbstoffe Azur C sind in solchem Ausmaß mit höher methylierten Homologen vermischt, daß deren Effekt eine Eignung des Azur C zur granulären Farbstoffspeicherung vortäuscht. Gereinigtes Azur C ist dazu jedoch ungeeignet.Phasenoptisch erscheint die mit Azur A, Azur B und Methylenblau erreichte Farbstoffspeicherung mehr vakuolär als granulär. Die vom jeweils verwendeten Farbstoff induzierten vakuolären Einschlüsse zeigen morphologische Eigenheiten.Die Befunde werden diskutiert, unter besonderer Berücksichtigung der mit den kationischen Farbstoffen vermutlich reagierenden anionischen zellulären Bestandteilen.

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Vital staining with phenothiazine derivativesComparative application of commercial and purified dyes

Summary In a comparative study cells grown in monolayer have been vitally stained with commercial dye samples and dyes purified by thin layer chromatography and column chromatography. The dyes used were derivatives of amino-substituted phenothiazine (thionine to methylene blue).Granular storage of dyes has been observed only after the protons of the amino groups had at least been substituted by two methyl groups, as represented by the compound azure A.This observation is based on the use of purified dyes. Commercial samples of azure C are mixed with fractions of the higher methylated homologues of thionine to a degree that these impurities imply suitability of azure C for intracytoplasmic granular storage. Purified azure C, however, does not induce formation of cytoplasmic vacuoles.In the phase contrast microscope, inclusions formed under the influence of azure A, azure B and methylene blue exhibit a more vacuolar than granular appearance. There are morphologic differences, between vacuoles formed under the influence of the respective dyes.The observations are discussed with special regard to the anionic cellular constituents supposed to react with the cationic dyes.

Die Arbeit wurde mit Unterstützung der F. Hoffmann-La Roche und Co. AG., Basel, durchgeführt.     

Zur Vitalfärbung tierischer Zellen mit Bismarckbraun

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Die Vitalfärbung des Mäuseasciteskarzinoms mit Acridinorange

Zusammenfassung Es wurde über die Acridinorange-Vitalfluorochromierung des Mäuseasciteskarzinoms unter besonderer Berücksichtigung der intraplasmatischen Speicherung des Farbstoffs in granulärer Form berichtet.Die Untersuchungen wurden an lebenden Zellen mit der kombinierten Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt und die Ergebnisse dann den Bildern gegenübergestellt, die nach Fixation und Färbung der vitalfluochromierten Zellen zu erreichen waren.Im wesentlichen wurden die Verhältnisse nach Injektion sehr hoher Acridinorangedosen untersucht, aus Vergleichsgründen aber auch die Wirkung geringerer Farbstoffmengen und anderer, verwandter basischer Farbstoffe.Nach Injektion von 8 mg des stärker wirksamen gereinigten Acridinorange kommt es zunächst zu dem Symptomenkomplex der initialen FarbstoffÜberschwemmung. Er ist im wesentlichen gekennzeichnet durch die diffuse, sehr labile Rotfluoreszenz der gesamten Zelle, wobei offen gelassen wird, ob die Rotfluoreszenz im Kernbereich auf Überlagerung entsprechend fluoreszierender Cytoplasmabestandteile, oder auf leicht reversibler Farbstoffadsorption an der Kernmembran beruht.Die Bedeutung dieses Fluoreszenzmodus liegt in dem gelungenen Nachweis, daß diffuse Rotfluoreszenz aller Zellareale mit dem Weiterleben der Zellen vereinbar sein kann. Der Nachweis der erhaltenen Vitalität läßt sich nicht nur durch den weiteren Ablauf des Färbeprozesses, sondern auch durch die Überimpfung solcher acridinorange-überschwemmter Zellen führen.Dieses Stadium der massiven Farbstoffaufnahme ist von dem der nachfolgenden Farbstoffspeicherung durch eine Phase getrennt, in dem die Zellen trotz reichlichen Farbstoffangebots nicht fähig sind, das Acridinorange in granulärer Form zu sammeln. Geringere Farbstoffmengen werden wesentlich schneller im Cytoplasma zu rotleuchtenden Körnchen konzentriert. Es wird daher die Auffassung vertreten, daß durch die initiale Farbstoffüberschwemmung eine reversible Zellschädigung, als solche kenntlich durch den weiteren Ablauf der Vitalfärbung, verursacht wird.Im Stadium der Farbstoffspeicherung wird das Acridinorange im Cytoplasma unter aktiver Mitwirkung der lebenden Zellen in gut abgegrenzten, leuchtend rot fluoreszierenden Gebilden gespeichert. Es wird erneut die Frage diskutiert, ob nicht dieser Konzentrationsvorgang, in Analogie zu ähnlichen, bereits entsprechend gedeuteten Prozessen in der Zellpathologie als Koazervatbildung aufgefaßt werden könne.Teilnehmer an der Bildung solcher Komplexkoazervate sind im wesentlichen Nukleoproteide der Zelle und der Farbstoff.Entstehung, Wachstum und Rückbildung der Koazervate wurden an vitalen Zellen im kombinierten Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskop und in gefärbten Präparaten untersucht.Ein Frühstadium wird von einem Spätstadium abgegrenzt. Im Frühstadium sind die Koazervate groß, wasserreich, labil, dem Fixations- und Färbeprozeß nicht gewachsen. Der Übergang vom Früh- in das Spätstadium wird im Phasenkontrastmikroskop von einem Gestaltwechsel angezeigt:Die großen, gelb-glänzenden Frühkoazervate werden durch Dehydratation zu dichten, grau-gelben oder schwarzen Körnchen bei zunächst gleichbleibender Rotfluoreszenz.Diese dehydrierten Gebilde des Spätstadiums färben sich mit May-Grünwald-Giemsa-Lösung tief dunkelblau; mit Methylgrün grün, mit Pyronin rot, bei kombinierter Methylgrün-Pyroninfärbung mit erhöhtem Pyroninanteil rot, mit modifizierter Gallocyaninchromalaunfärbung tiefblau. Allgemein färben sie sich mit den basischen Farbstoffen dann, wenn der Färbeprozeß so schnell abläuft, daß die immer noch labilen Koazervate in der Zelle erhalten werden können.Die Färbeergebnisse werden mit dem hohen Gehalt der Koazervate an Nukleoproteinen, speziell an Ribonukleinsäure, in Zusammenhang gebracht.Besonders hervorgehoben werden die Unterschiede in der Koazervatbildung zwischen Tumorzellen und Histiozyten des Mäuseascitescarcinoms. Die Tumorzellen wieder zeigen Verschiedenheiten zwischen kleinen, stark basophilen Zellen (A-Zellen) und größeren schwach basophilen (B-Zellen). Die letzteren scheinen leichter und in größerem Ausmaß Koazervate zu bilden.Die Histiozytengranula werden schneller und reichlicher gebildet als die der Tumorzellen. Sie sind bereits wenige Stunden nach Fixation und Färbung nachweisbar. Da das Volumen der Koazervate über den ursprünglichen Umfang der dazugehörigen Histiozyten hinauswachsen kann, wird angenommen, daß die Histiozyten während der Koazervatbildung Nährstoffe und Eiweiß aus der Suspensionsflüssigkeit aufnehmen können. Im Frühstadium nehmen die Koazervate auch weiter Farbstoff aus der Umgebung auf, den sie sogar benachbarten Zellstrukturen (Kern) zu entziehen vermögen. Sie behalten stets ihren basophilen Charakter.Im Gegensatz zu den Histiozyten, die einen Großteil oder gar ihre gesamte basophile Plasmagrundsubstanz in den Granula zu sammeln vermögen, ist der Anteil der Nukleoproteide, den die lebende Tumorzelle in die Koazervate abgibt, im Verhältnis zur vorhandenen Gesamtmenge relativ gering: Auch im Anschluß an starke Granulabildung läßt sich nach Fixation und Färbung eine im wesentlichen unveränderte Basophilie des Grundplasmas nachweisen.In der vitalen Zelle besteht eine unterschiedliche Affinität anderer basischer Farbstoffe zu den bereits gebildeten Acridinorangekoazervaten: Neutralrot vermag Acridinorange zu verdrängen, Pyronin und Trypaflavin dagegen nicht. Hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Koazervatbildung nimmt jedoch das Acridinorange absolut eine Sonderstellung ein und wird hierin von keinem anderen Farbstoff erreicht. Mögliche Beziehungen dieser Eigenart zu physikalisch-chemischen Merkmalen des Farbstoffs werden besprochen.Art und Ausmaß der Koazervatbildung werden als unmittelbar abhängig von der Zellstruktur aufgefaßt. Mögliche Zusammenhänge werden unter Berücksichtigung elektronenmikroskopischer Befunde sowie neuere Anschauungen über den Nukleinsäurestoffwechsel diskutiert.Die Relationen zwischen den unter Farbstoffeinwirkung neugebildeten Koazervaten und präexistierenden Cytoplasmaeinschlüssen werden erörtert. Unterscheidungsmöglichkeiten sind nicht immer gegeben. Gesetzmäßigkeiten in der Lokalisation fluoreszierender Einschlüsse, Anfärbung solcher Einschlüsse nach dem erwiesenen Zelltod sprechen für die Anwesenheit präformierter Plasmaeinschlüsse.Hinweise werden auf die mögliche praktische Bedeutung der Koazervatbildung gegeben.In Zellen des Ascitestumors lassen sich nach der oben angegebenen Methode Koazervate in starkem Ausmaß erzeugen. Die koazervattragenden Zellen lassen sich als Testobjekte verwenden, in denen der Einfluß verschiedener Medien allgemein auf die Fluoreszenzeigenschaften und speziell auf die fluoreszierenden Koazervate studiert werden kann. Insbesondere lassen sich Rückbildungs- bzw. Abbauvorgänge verfolgen. Besonders verträglich sind albuminhaltige Medien. Allerdings extrahieren sie mitunter den Farbstoff ziemlich schnell aus den Zellen. Frühkoazervate werden zurückgebudet, ohne Spuren in der Zelle zu hinterlassen. Spätkoazervate werden nach fortschreitender Dehydratation wahrscheinlich so abgebaut, wie auch andere ausgesonderte proteinhaltige Plasmabestandteile.     

Die Vitalfärbung des Zellkernes mit basischen Farbstoffen

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Vitalfärbungen

Ohne ZusammenfassungDurchgeführt im Sommer 1930 an der Hydrobiologischen Station am Tiefen See (Glubokoje Osero) bei Moskau. Für die freundliche Einladung und Aufnahme an der genannten Station spreche ich dem Vorstand derselben, meinem hochverehrten und geliebten Lehrer, Herrn Alexis Rumjantzew, meinen innigsten Dank aus.     

Vitalfärbung und Vakuolenkontraktion an Zellen mit stabilem Plasmaschaum

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Beiträge zur Analyse der Vitalfärbung pflanzlicher Zellen mit Neutralrot

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Vitalfärbungen an Epidermiszellen vonPlatanthera bifolia mit Toluidinblau und Pyronin

Ohne ZusammenfassungIch möchte hier Herrn Professor Dr. Karl Höfler und Herrn Dozenten Dr. Helmut Kinzel herzlichst für Rat und Unterstützung danken, die mir diese Arbeit ermöglicht haben.