转基因小鼠乳腺表达长效组织纤溶酶原激活剂

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将其插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAt-PA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,将此构建BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和DNA印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的F1代子鼠中,9只中有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1-2μg/ml,说明BLG-tPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。为今后利用牛、羊作为生物反应器表达LAtPA奠定了基础。     

组织纤溶酶原激活剂突变体在转基因小鼠乳腺中的表达

组织纤溶酶原激活剂(tPA)是一种较理想的溶血栓药物,本研究采用其突变体——长效组织纤溶酶原激活剂(LAtPA)的cDNA作为目的基因,将它插入羊β-乳球蛋白(BLG)基因起始密码之前,使LAtPA的转录、翻译受控于BLG基因的5′、3′序列,再将所构建的BLG-LAtPA用显微注射方法建立转基因鼠,经点杂交筛选和Southern印迹鉴定,获得2只LAtPA基因整合阳性鼠,并在阳性母鼠乳汁中检测到有溶纤活性的LAtPA表达,表达水平1.5μg/ml。在这两只转基因鼠的9只F1代子鼠中,有5只是阳性的,tPA表达水平维持在1～2μg/ml,BLGtPA融合基因整合到小鼠基因组,能稳定地遗传给子代。     

组织型纤溶酶原激活剂的纯化制备

简述了用于大规模生产组织型纤溶酶原激活剂(tPA)的重组动物细胞及其培养工艺。从重组tPA的大规模、快速纯化的角度考虑,对tPA的纯化制备方法进行了简要评述。     

组织型纤溶酶原激活剂(TPA)

一、产品概述 TPA是由人的血管内皮细胞产生的527个氨基酸序列组成的糖蛋白,其分子量为3万多至7万。它具有称之为索眼的结构,对构成血栓的纤维蛋白有亲和性。 血栓是血管内产生的血块,血栓一旦产生,身体末端的微细血管堵塞,导致手脚麻痹、脑梗塞、心肌梗塞等病症。     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA的克隆

组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plas-minogen activator,tPA)是一个由527个氨基酸残基组成的蛋白质,分子质量约69ku。 tPA是一种丝氨酸蛋白水解酶,在纤维蛋白存在的条件下,可使血浆纤溶酶原转变为纤溶酶;如果没有纤维蛋白的存在,它使纤溶酶原转变为纤溶酶的能力有限。当静脉给予药理剂量的tPA时,它与血栓处的纤维蛋白结合,同时把捕捉的纤溶酶原转变为纤溶酶,使纤维蛋白的溶解在血栓处发生,而并非全身性。这样可以减少全身性出血副作用,这也更是tPA优于尿激酶和链激酶之处。tPA临床上主要用于治疗血栓性疾病,如急性心肌梗塞,肺栓塞,视网     

第二代组织纤溶酶原激活剂

组织纤溶酶原激活剂(t-PA)被誉为本世纪最令人嘱目、最有前途的血栓溶解剂。自1983年Pennica首先在大肠杆菌中成功地克隆并表达t-PA基因以来,这种血栓溶解剂的研究一日千里,迅速成为美国及世界其他各国生物工程公司的重点研究项目。     

人组织型纤溶酶原激活剂突变体微小基因的构建

tPA基因全长约36kb,至少由13个内含子分隔为14个外显子。根据tPA的第一、二外显子的编码情况,考虑建立从第二至第六外显子序列在内的tPA微小基因。即将tPA的部分基因组序列与LAtPA cDNA的序列在第六外显子的NarI位点处相连。     

乳腺注射法表达人组织型纤溶酶原激活剂的研究

目的 :构建tPA乳腺定位表达载体 ,使其在牛乳汁中高效表达 ,观察目的基因表达的规律及其影响因素 ,为建立新型牛乳腺生物反应器提供理论基础。方法 :RT-PCR法克隆目的基因 ,通过酶切、连接、分离、纯化等方法构建含tPA-cDNA的乳腺定位表达载体 ;采用乳腺注射法将融合基因转入小鼠及牛的乳腺组织中。结果 :乳腺注射外源基因后 ,tPA可在小鼠和牛的乳汁中表达。结论 :乳腺注射法可使目的基因在乳腺组织中稳定地表达较长的时间 ,其表达量与显微注射法没有明显的差异 ,表明外源基因的表达不受转基因方法的影响。但tPA在牛乳汁中的表达量明显高于小鼠的表达量 ,提示不同动物的乳蛋白调控系统有一定的差异 ,可能受着不同的因素或调控系统的影响。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β－乳球蛋白基因（BLG）作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工龄,构建了组织型纤溶酶原激活剂（tPA）乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,以PCR和Southern-Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG－tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汗中检测到tPA r itd ntg ,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合的小鼠基因组中的牛BLG－tPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

肝素对组织型纤溶酶原激活剂的作用

重组组织型纤溶酶原激活剂 ( rt PA)经肝素处理后与未经处理的 rt PA比较 ,结果显示 ,rt PA在体外的溶纤活性提高 5 0 %～ 90 % ,在兔体内的半衰期延长 1 min,同时也提高了 rt PA对热的稳定性     

猪心组织型纤溶酶原激活剂的纯化鉴定

本文介绍了一种简便易行的纯化组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)的方法。新鲜猪心组织经丙酮脱脂脱水,制成干粉,再经醋酸钾缓冲液提取。提取液经阳离子交换柱、肝素柱亲和层析及凝胶柱层析分离纯化。经SDS凝胶电泳分析证明纯化的t-PA只在分子量为67000道尔顿位置出现一条染色带。同时把该蛋白带转移到纤维蛋白板上,也在同一位置出现溶解带。     

牛β-乳球蛋白基因调控序列指导组织型纤溶酶原激活剂在小鼠乳腺中的表达

用全长8.4kb的牛β-乳球蛋白基因(BLG)作为调控序列,用1.6kb的鸡溶菌酶MAR序列作为对抗转基因中位点效应的工具,构建了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)乳腺表达载体。对2300枚卵进行显微注射,经PCR和Southern\|Blot检测,在170只出生小鼠中获得9只整合有牛BLG-tPA融合基因的转基因小鼠,并在转基因小鼠乳汁中检测到tPA的活性,tPA的表达水平最高达到12μg/mL。整合在小鼠基因组中的牛BLGtPA融合基因能稳定地遗传给子代。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂的研究

尿激酶型纤溶酶原激活剂u-PA(urokinase-type plasminogen activator)属于丝氨酸蛋白酶类,能激活细胞外基质中丰富的纤溶酶原生成纤溶酶,从而催化细胞外基质降解,对纤溶和癌细胞侵染及扩散等一系列生理和病理过程中发生的胞外蛋白水解起重要调节作用。 人u-PA基因位于第10号染色体之上,表达产生一个约54kD的单链糖基化多肽——尿激酶原。尿激酶原经纤溶酶在其158位赖氨酸     

心血管疾病治疗药物——重组组织型纤溶酶原激活剂

心血管疾病特别是急性心肌梗塞是严重威胁人类健康的疾病,近十多年来,大量研究溶栓治疗药物的作用。溶栓剂可分两类: 1.非特异性,对血栓或循环中纤溶系统均有作用。如链激酶(SK)、尿激酶(UK)、乙酰化纤溶酶-链激酶激活剂复合物(APSAC)、蛇毒溶栓剂(包括去纤酶、溶栓酶和抗栓酶)和蚓激酶(蚯蚓产物)等。 2.选择性作用于血栓部位的纤维蛋白,     

组织型纤溶酶原激活剂的发光分析法及其应用

 本文建立了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)活力的发光固相测定方法。用氨基乙基丁基异鲁米诺(ABEI)标记纤维蛋白原(Fg),在一定条件下,t-PA作用于固相(包被ABEI-Fg),产生纤维蛋白的降解产物。测定可溶性降解产物的发光强度,即能计算t-PA活性。该方法的标准曲线范围对t-PA为0.156IU/mL～40IU/mL。灵敏度可达0.156IU/mL。回收率为98.6％(n=27)。批内批间变异系数分别为6.6％及10.3％。该方法曾用于检测细胞培养液中提取t-PA样品及t-PA基因表达时培养液中t-PA的活性。也曾用于检测从组织中纯化t-PA样品及血浆中t-PA活性的测定。文中讨论了该方法与其它方法优缺点的比较。     

重组组织型纤溶酶原激活剂的纯化和鉴定

介绍一种简便高效的两步纯化重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)的方法,产rt-PA的CHO工程细胞SGG培养上清,经微孔玻璃珠(MPG)吸附和赖氨酸-Sepharose 4B柱亲和吸附色谱纯化,纯化倍数平均达到380倍,比活性为390 000 U/mg蛋白,rt-PA活性回收率达到140%,经SDS-PAGE还原电泳分析主要为t-PA蛋白,其中高分子t-PA占80％左右.用纤维蛋白自显影法检测均有溶纤活性,蛋白质印迹证实具有t-PA的抗原性.