正交设计优化不结球白菜ISSR反应体系研究

利用正交试验设计,从Mg2+、dNTP、引物、甘油4种因素3个水平,对不结球白菜ISSR反应体系进行优化,确立了适合不结球白菜的ISSR反应体系:在20μL反应体系中,含1×PCRbuffer,1.5mmol·L-1MgCl2,200μmol·L-1dNTP,0.5μmol·L-1引物,1%甘油,30ng模板DNA,1UTaqDNA聚合酶.通过梯度PCR测验,确定了适宜的退火温度.     

乌塌菜ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为获得乌塌菜ISSR-PCR的最佳反应体系,采用单因素浓度梯度试验和正交优化设计相结合的方法,研究了引物浓度、dNTP浓度、Mg²⁺浓度、Taq DNA聚合酶用量对PCR反应的影响。并在此基础上对退火温度和循环数进一步优化,最终确立了适合乌塌菜ISSR PCR反应的最佳体系和程序。即20 μL PCR反应体系含：30 ng模板DNA,0.50 μmol·L^-1引物,0.25 mmol·L^-1 dNTP,1 mmol·L^-1 Mg²⁺,1.0 U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸90 s,35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术对乌塌菜进行种质资源的分类鉴定奠定了基础。     

杂交油菜ISSR-PCR反应体系的建立和优化

利用正交试验设计的方法,对影响ISSR-PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4个因素进行优化试验,以期建立其最佳反应条件。并在此基础上,对DNA模板浓度和ISSR PCR反应程序中的退火温度进行梯度筛选。结果表明：杂交油菜20 μL ISSR-PCR最佳反应体系包括1.50 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.125 mmol·L^-1 dNTP、2.00 μmol·L^-1 primer、0.50 U Taq DNA聚合酶、2.5 μL 10×buffer和40 ng DNA模板;引物UBC891适宜的退火温度为54.2℃。该体系在青杂3号及其父本不同个体中能够扩增出条带清晰、稳定性好的条带。ISSR-PCR反应体系的建立为利用分子标记技术研究杂交油菜品种纯度和真实性鉴定奠定了良好基础。     

党参基因组DNA提取、ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

对党参基因组DNA提取方法优化、ISSR体系形成及引物筛选三方面进行探讨,为研究党参居群遗传多样性及药材DNA鉴定奠定基础。经比较改良CTAB法、改进的高盐SDS法和试剂盒三种常用DNA提取方法,发现改良CTAB法效果最佳;利用优化设计并结合有关文献优化ISSR反应体系,最优反应体系为：50 μL总反应体积中含约20 ng DNA模板,1.25 U Taq DNA聚合酶,2.25 mmol·L^-1 Mg²⁺,200 μmol·L^-1 dNTP,0.50 μmol·L^-1引物。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出13条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

利用正交设计建立与优化北美驼绒藜ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计的方法,对北美驼绒藜ISSR-PCR反应的5因素(Taq酶、dNTP、引物、Mg²⁺和模板DNA)4水平进行试验,试验结果运用MINITAB软件进行分析,建立了适合北美驼绒藜的既稳定又谱带多的ISSR-PCR最佳反应体系,即20 μL的反应体系中含有1×buffer,1.5 U Taq酶,0.2 mmol·L^-1 dNTP,0.5 μmol·L^-1引物,2.5 mmol·L^-1 Mg²⁺和10 ng模板DNA。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR技术进行驼绒藜属植物种质资源分类、遗传图谱构建和遗传变异奠定了技术基础。     

黄连ISSR反应条件优化的研究

以黄连(味连,Coptis Chinensis Franch.)基因组DNA为模板,通过单因子、双因子实验研究了ISSR反应体系中主要成分（Mg²⁺、dNTP、引物、模板、Taq DNA聚合酶）以及热循环参数（退火温度、循环数、变性时间、退火时间、延伸时间）对扩增结果的影响,并找出各自的最适条件,建立了适合黄连ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μL反应体系中,内含1×PCR buffer、1.5mmol·L^-1 Mg²⁺、200μmol·L^-1 dNTP、0.3 μmol·L^-1引物、40 ng模板、1 U TaqDNA聚合酶。扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环：94℃变性30 s,（据不同引物的退火温度）复性1 min,72℃延伸1.5 min,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存。这一优化系统的建立为今后利用ISSR标记技术进行黄连鉴定及种质遗传多样性分析提供了一个标准化程序。     

苹果黑星病菌SSR反应体系的优化

通过对苹果黑星病菌基因组DNA的SSR反应中一些重要参数进行优化,结果表明,最适反应体系为:2 5μL体系中,10×Buffer Mg Cl2 2 0 mm ol/ L 2 .5μL ,d NTP 10 0μmol·L- 1 、引物0 .5μmol·L- 1 、Taq DNA聚合酶1.5 U ,DNA模板2 m g·L- 1 ,dd H2 O 19.5μL .PCR扩增程序为93℃,2 min,5 7℃,30 s,1个循环;72℃,1m in,93℃,30 s,5 7℃,30 s,4 0个循环;72℃,10 min.     

亚精胺对苹果花粉萌发与花粉管伸长的抑制效应及其与Ca2+的关系

20～ 10 0 μmol·L- 1外源亚精胺 (Spd)抑制苹果 (品种 :国光、富士、金冠 )花粉萌发与花粉管伸长 ,其效应随浓度增加而增强 ;Ca2 ( 1mmol·L- 1)在一定程度上削弱这种抑制效应 ,而Ca2 的良好作用则又为Ca2 通道竞争性抑制剂La3 所消除 ,Ca2 载体A2 3187仅削弱Ca2 对花粉管伸长的良好作用     

金龟甲基因组DNA RAPD反应条件的优化

以华北大黑鳃金龟[Holotrichia oblita (Faldermann)]和矮臀鳃金龟(H.ernesti Reitter)为供试材料,对DNA模板、Mg2+、dNTPs浓度、淬火和循环内延伸时间及循环数进行优化.提出了金龟甲RAPD分析的最佳反应体系,即25 μL体系中含DNA模板1.2 ng·μL-1、Mg2+ 2. 5 mmol·L-1、dNTPs 0. 25 mmol·L-1;并确定最适淬火时间为40 s,循环内延伸时间为2 min;最佳循环数为40.     

濒危植物夏蜡梅ISSR扩增条件的优化

为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性,有必要进行ISSR-PCR反应体系的优化。以濒危植物夏蜡梅的基因组DNA为研究对象,利用单因素试验,测试了ISSR-PCR反应体系中镁离子,dNTP,模板DNA含量,Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物浓度、甘油浓度等7种因素对反应结果的影响,经过优化实验,建立了夏蜡梅ISSR-PCR最佳反应体系：10 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液（10 mmol·L^-1 Tris·HCl pH9.0,50 mmol·L^-1 KCl, 0.1%Triton X-100）,1.5 mmol·L^-1 MgCl₂,0.75U Taq酶（上海华美公司）,20 ng模板DNA,6pmol引物（上海Sangon公司）;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.15 mmol·L^-1。利用优化反应体系从100个ISSR引物中共筛选出12个稳定性好、重复性高的引物,对10个居群共200个夏蜡梅个体的DNA进行扩增,共扩增出156个条带,其中多态条带为114个,总的多态位点百分率为73.08%。各居群的多态位点百分率有较大差异,平均为23.65%。夏蜡梅ISSR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究夏蜡梅的遗传多样性奠定了良好的基础。