人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的：构建人胱硫醚β合成酶（human cystathionineβ-synthase,hCBS）基因原核表达载体,在E.coli BL21（DE3）中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法：以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应（PCR）扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因（基因bank号：BT007154.1）完全一致,转入E.coli BL21（DE3）中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果：经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS（rhCBS）。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS（约19 mg/L培养物）,并测得其比活力约为57 kU/g。结论：成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

人胱硫醚β合成酶原核表达纯化及鉴定

目的:构建人胱硫醚β合成酶(human cystathionineβ-synthase,hCBS)基因原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达,并进行纯化和酶活性检测。方法:以胰腺细胞cDNA文库为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增hCBS基因蛋白编码区的全序列,克隆入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a(+)-hCBS。经限制性内切酶双酶切及DNA序列分析鉴定目的基因后与人CBS基因(基因bank号:BT007154.1)完全一致,转入E.coli BL21(DE3)中,由IPTG诱导表达融合蛋白。结果:经SDS-PAGE、Western blot分析,证明诱导表达的蛋白为重组人CBS(rhCBS)。再由Ni-NTA树脂亲和层析,并脱盐冷冻干燥后获得重组rhCBS(约19 mg/L培养物),并测得其比活力约为57 kU/g。结论:成功地表达纯化出具有功能活性的重组蛋白rhCBS,为进一步研究该酶的相互作用蛋白以及其在生物学和临床科学的作用奠定了基础。     

重组人EGF-IL-18融合蛋白的表达纯化及复性

融合基因EGF-IL-18与表达载体pET32a( )连接构建融合型原核表达质粒pET32a( )-EGF-IL-18。该基因在E.coliRosetta(DE3)中获得高效表达,SDS-PAGE分析表明表达产物大部分以包涵体形式存在。以2mol/L尿素和1%TritonX-100对包涵体进行反复洗涤后,利用离子交换柱层析对包涵体进行柱上复性,结果表明离子交换层析柱上复性不仅能够获得可溶性的EGF-IL-18融合蛋白,而且产物同时得到纯化,纯度大于90%。复性的EGF-IL-18经分子筛进一步纯化后,体外实验证明具有促进人外周血单个核细胞(PBMC)IFN-g基因表达的能力。该方法简单、高效,为进一步开展EGF-IL-18的动物实验及其大量纯化制备打下基础。     

重组人IL-4大肠杆菌表达与纯化

根据大肠杆菌密码子偏爱性优化并合成人白细胞介素4基因,以pET30a( )为载体构建了重组表达质粒pET30a( )/rhIL-4,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达并超声破菌检测重组蛋白的表达形式。采用5L发酵罐培养工程菌,发酵液OD600为0.6时诱导3.5h收集菌体,检测目的蛋白的表达量。收集的菌体经压榨破菌获得包涵体,通过包涵体变性、层析、透析复性等方法对rhIL-4进行纯化。采用人红细胞白血病细胞(TF-1)测定纯化的rhIL-4的生物活性。测序表明目的基因已插入载体pET30a( )中,重组蛋白以包涵体形式表达,单位体积重组蛋白的表达量达200mg/L发酵液,建立了对包涵体形式表达的rhIL-4纯化方法,最终得率为40mg/L发酵液,纯度大于98%,回收率为20%以上。免疫印迹法检测诱导表达的重组蛋白和纯化的蛋白为IL-4,N端氨基酸序列测定结果与理论相符,生物活性检测纯化的蛋白比活性达2.5×106AU/mg。这为rhIL-4进一步产业化研究建立了基础。     

人EGF受体L2结构域在大肠杆菌中表达、包涵体柱上复性及纯化

以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码EGFR-L2结构域的DNA片段,在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET-3c连接构建EGFR-L2原核表达载体。该蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,免疫印迹分析表明表达产物全部以包涵体形式存在,分步透析法和稀释法都不能获得可溶性复性产物,而Ni²⁺-NTA柱上复性法不仅能够获得可溶性的EGFR-L2蛋白,而且产物同时得到高度纯化,纯度>95％,复性的EGFR-L2与其配基EGF具有特异性的结合活性,但亲和力较低。这表明His6标签不但便于纯化目标蛋白,而且可利用Ni²⁺-NTA柱进行柱上复性,适用于不易通过常规方法复性的重组蛋白的制备。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

重组人MASP2蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化

目的:获得酶原形式的重组人甘露聚糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶2(MASP2)。方法:在大肠杆菌中诱导表达重组人MASP2全长蛋白,包涵体裂解后,经复性、透析、浓缩、考马斯亮蓝染色、SDS-PAGE及Western印迹,鉴定纯化结果及酶活性。结果:复性后的MASP2蛋白经考马斯亮蓝染色未见杂带。自激活实验表明,当MASP2浓度在1μmool/L以下时,无论在4℃还是37℃,都能较稳定地保持酶原形式;蛋白浓度为3.5μmool/L时只能在4℃保持稳定,37℃发生自激活;蛋白浓度达到12μmool/L后,在4℃时已不能稳定存在。结论:获得了较纯的重组人MASP2蛋白,且具有自激活活性。     

Expression, Renaturation and Simultaneous Purification of Recombinant Human Stem Cell Factor in Escherichia coli

Recombinant human stem cell factor (rhSCF) was produced as an inclusion body by Escherichia coli DH5α grown in a 5 l fermentor. Inclusion bodies of rhSCF were purified and solubilized in urea solution, then renatured with simultaneous purification using a high performance hydrophobic interaction chromatographic (HPHIC) squat column. The refolded rhSCF had a purity of 94% and a bioactivity of 1.2 × 10⁶ IU mg⁻¹of rhSCF protein. The method described is fast and simple to implement.     

Expression and Purification of Recombinant lysostaphin in Escherichia coli

Summary A 1.5 kb plasmid-encoded lysostaphin gene fragment of Staphylococcus staphylolyticus was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned in Escherichia coli by using plasmid pET29b(+) as an expression vector. By optimizing culture conditions, the activities of lysostaphin were expressed as 66 %, 30 %, and 4 % in extracellular, intracellular, and periplasmic fractions of recombinant E. coli, respectively. The enzyme was purified to homogeneity by using a simple one-step fractionation on bacterial cells of lysostaphin-resistant Staphylococcus aureus mutant. The recombinant enzyme had an Mr of approximate 27 kDa, and its bacteriolytic activity was indistinguishable to the authentic lysostaphin purified from Staphylococcus staphylolyticus.     

重组人ASCT2的C-末端胞外结构域的原核表达、纯化及鉴定

中性氨基酸转运蛋白（ASCT2）是人类内源性病毒的包膜蛋白合胞素在细胞膜上的主要受体,其最大的胞外结构域存在于C-末端的105个氨基酸（以下简称TAIL）。通过RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中克隆ASCT2基因编码区全长序列,再从中扩增ASCT2的TAIL序列,与pET-41b（克隆位点的N-和C-端分别有谷胱甘肽转移酶和His6标签序列）连接构建原核表达载体,重组质粒在大肠杆菌中获得表达,免疫印迹显示重组蛋白TAIL在细菌裂解液上清和沉淀（包涵体）中均有表达,可溶性部分经亲和层析纯化获得高纯度的TAIL蛋白,该蛋白可结合在表达合胞素的MCF-7细胞表面,提示其可能具有结合合胞素的活性。     

mLST8在大肠杆菌中的表达、纯化及鉴定

目的:表达并纯化mLST8蛋白。方法:PCR扩增mLST8的编码cDNA,克隆到pET-28a(+)表达载体,将重组质粒pET-28a-mLST8转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下表达目的蛋白;提取包涵体,用Ni2+亲和层析纯化目的蛋白,稀释和透析相结合进行复性,对复性蛋白进行阴离子交换层析、分子筛层析,将纯的复性mLST8进行肽指纹质谱鉴定和圆二色谱分析。结果:酶切和DNA测序证明pET-28a-mLST8表达质粒构建无误,并在大肠杆菌中得到高效表达;通过Ni2+亲和层析、复性、离子交换层析和分子筛层析获得了较高纯度的复性蛋白,肽指纹质谱鉴定为mLST8;mLST8蛋白的二级结构[α螺旋为18.2%,β折叠为52.3%(其中平行结构为12.1%,反向平行结构为40.2%),β转角为20.7%,无规则卷曲为39.9%]表明其为典型的β折叠结构。结论:在大肠杆菌中表达了重组mLST8蛋白,复性获得了二级结构准确的mLST8,为进一步研究mLST8的晶体结构与功能奠定了基础。     

Scytovirin在大肠杆菌中的可溶性表达

目的:获得Scytovirin(SVN)蛋白及其多克隆抗体.方法:按照NCBI上公布的SVN基因序列设计合成引物,合成SVN基因,构建pET32c-SVN原核表达重组质粒,经限制性酶切分析、DNA序列测定插入片段正确;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导重组蛋白表达;用离子交换层析法及金属亲合层析法纯化蛋白,采用Tris-Tricine系统分析;以经过纯化的蛋白为抗原免疫白兔,制备SVN多克隆抗体.结果:对表达产物进行了分离纯化,SVN纯度达到91%;用纯化的样品制备了多克隆抗体,抗血清效价为1∶102 400.结论:SVN在大肠杆菌表达系统中获得了高效可溶表达,并制备了其多克隆抗体,为进一步深入研究SVN提供了材料.     

Recombinant Human Ribosomal Protein S16: Expression,Purification, Refolding,and Structural Stability

The cDNA of human ribosomal protein S16 was cloned into the expression vector pET-15b. Large-scale production of the recombinant protein was carried out in E. coli cells and highly purified protein was isolated. A method for refolding the protein from inclusion bodies was optimized. The secondary structure content of the refolded protein was analyzed by CD spectroscopy. It was found that 21 +/- 4% of the amino acid sequence of the protein forms alpha-helices and 24 +/- 3% is in beta-strands. The protein structure stability was studied at various pH values and urea concentrations. The protein is quickly denatured at pH above 8.0, whereas increasing of urea concentration causes slow unfolding of the protein.     

重组人骨形态发生蛋白-6的表达、纯化及其活性分析

利用RT-PCR从人胎盘组织中获取BMP-6成熟肽的cDNA 片段,并克隆到表达载体pET-15b中, 构建hBMP_6成熟肽的非融合蛋白表达质粒pET-BMP6,转化E.coli BL21（DE3）。IPTG 诱导4h后,工程菌高表达rhBMP-6成熟肽,在SDS-PAGE上出现预期的新蛋白带(≈15kD), 约占菌体总蛋白的10%,表达产物以包涵体形式存在。分离和纯化的包涵体溶解于8 mol/L尿素,在变性溶解状态下经阳离子交换层析,得到目的蛋白纯度达95%以上。再经稀释复性后,约80%的rhBMP-6形成同源二聚体。体外活性分析结果显示：rhBMP-6可以提高C3H10T1/2 细胞碱性磷酸酶活性及促进I型胶原、Osterix（Osx）和骨钙素（Osteocalcin）等成骨细胞表型转化标记基因mRNA的表达,证明制备的rhBMP_6具有诱导非骨源性细胞分化成为成骨细胞的作用。     

人源溶菌酶在大肠杆菌中的表达与复性研究

人源溶菌酶(Human lysozyme,HLZ)是一种糖苷水解酶,具有抗菌消炎的作用,其作为抗生素的替代品,已经被广泛应用于食品业、畜牧业和医疗等领域。如何获得高产量、高活性、高纯度的人源溶菌酶一直是亟待解决的技术问题。优化人源溶菌酶编码基因密码子,提高其在大肠杆菌中的适应度和表达量;将优化的基因克隆至大肠杆菌表达质粒pET21a,并将其在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达;利用8 mol/L尿素溶液对包涵体进行溶解变性后,探究一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式以及复性液中谷胱甘肽氧化还原对(GSSG/GSH)、精氨酸、甘油等复性物的浓度对重组人源溶菌酶复性的效果,获得最佳的复性方案。研究结果表明:37℃诱导温度下,利用0.5 mmol/L IPTG成功诱导了分子量约为14.7 kD的重组人源溶菌酶的表达,包涵体表达量约为380 mg/L(湿重)。包涵体经一步透析、梯度透析和梯度稀释3种复性方式复性后,测得比活力值分别为147 U/mg、335 U/mg、176 U/mg,表明最佳复性方法为梯度透析复性法。进一步探索了复性液中GSSG/GSH比值、精氨酸浓度、甘油浓度对人源溶菌酶复性效果的影响,表明当复性液中同时添加浓度比为1∶2的GSSG/GSH、4 mmol/L精氨酸和6%甘油时,复性后人源溶菌酶的最佳比活力值为1170 U/mg,显著高于3种复性物均不加时溶菌酶335 U/mg的比活力值,但低于溶菌酶标准品1732 U/mg的比活力值。成功地将人源溶菌酶基因在大肠杆菌中表达,并通过包涵体复性体系成功获得高活性重组人源溶菌酶。     

Simplified Large-Scale Refolding,Purification, and Characterization of Recombinant Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor in Escherichia coli

Granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is a pleiotropic cytokine that stimulates the development of committed hematopoietic progenitor cells and enhances the functional activity of mature cells. Here, we report a simplified method for fed-batch culture as well as the purification of recombinant human (rh) G-CSF. The new system for rhG-CSF purification was performed using not only temperature shift strategy without isopropyl-l-thio-β-d-galactoside (IPTG) induction but also the purification method by a single step of prep-HPLC after the pH precipitation of the refolded samples. Through these processes, the final cell density and overall yield of homogenous rhG-CSF were obtained 42.8 g as dry cell weights, 1.75 g as purified active proteins, from 1 L culture broth, respectively. The purity of rhG-CSF was finally 99% since the isoforms of rhG-CSF could be separated through the prep-HPLC step. The result of biological activity indicated that purified rhG-CSF has a similar profile to the World Health Organization (WHO) 2^nd International Standard for G-CSF. Taken together, our results demonstrate that the simple purification through a single step of prep-HPLC may be valuable for the industrial-scale production of biologically active proteins.     

重组人BMP6在大肠杆菌中可溶表达、纯化及活性分析

BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。     

人亲环素B基因的克隆表达及重组蛋白的生物活性

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法从人淋巴细胞中扩增出亲环素Ｂ（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎＢ,ＣｙＰＢ）基因,克隆入ｐＥＴ－２８ａ载体中表达．表达产物以包涵体形式存在,占细菌可溶性蛋白的１５％．经Ｎｉ－ＮＴＡ树脂金属螯合亲和层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０柱层析纯化,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测呈单一条带,毛细管电泳为单一色谱峰,纯度达９５％．经复性处理,表达产物显示肽基脯氨基顺反异构酶活性     

重组人BMP6在大肠杆菌中可溶表达、纯化及活性分析

BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子,在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力.有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白,疏水性极强容易聚集沉淀.为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6),构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的rhBMP6成熟肽原核表达载体,调节诱导温度和IPTG浓度,比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响.结果表明,MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性,诱导条件对溶解性影响较小.大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境.MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体.表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后,能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向转化.     

人Hepassocin的原核可溶性表达与纯化

目的：构建人Hepassocin的原核表达载体,可溶性表达并纯化得到高纯度的重组人Hepassocino方法：将人Hepassocin基因克隆到原核表达载体pET40b（＋）,转化大肠杆菌BL21（DE3）,于28℃经0．1mmol／LIPTG诱导6h,表达Ds-bC-Hepassocin融合蛋白,经镍柱纯化可溶性融合蛋白,用肠激酶切除融合蛋白的DsbC-His标签,再用镍柱纯化分离酶切后的Hepassocin,通过超滤进一步纯化并浓缩,用Western blot验证纯化后的Hepassocin。结果：构建了pET40b-Hepassocin原核表达载体,经诱导表达、亲和层析和肠激酶切除融合标签,获得了相对分子质量约32000的可溶性高纯度蛋白,Western blot鉴定证实该蛋白为不含融合标签的重组人Hepassocin。结论：实现了人Hepassocin的原核可溶性表达,通过纯化获得了较高纯度的重组人Hepassocin,为制备其单克隆抗体,进一步研究其生物学功能奠定了基础。