利用载体介导小干扰RNA诱导RSRC1基因沉默

目的：设计并构建人RSRC1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人RSRC1基因的cDNA序列为靶标,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,并将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序正确后将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过Western blot和荧光分析检测其抑制效果。结果：重组体测序成功后,Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性RSRC1表达;将siRNA重组质粒和带GFP标签的RSRC1共转染293T细胞,荧光显微镜下GFP的亮度明显减弱。结论：获得了2条人RSRC1siRNA真核表达载体,均能有效地抑制RSRC1基因表达。     

人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的：设计并构建人eya2（eyes absent2）基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法：以人eya2为靶基因,以pSliencer2．1-U6 neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5Ⅸ菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Westemblot和转录活性实验检测其抑制效果。结果：重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Westemblot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论：构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。     

利用小干扰RNA抑制小管间质性肾炎抗原相关蛋白的表达

目的：设计并构建TIN-ag-RP基因的小干扰RNA（siRNA）,检测其对小管间质性肾炎抗原相关蛋白（TIN—ag-RP）表达的干扰效果。方法：设计2条针对TIN-ag-RP基因的siRNA,并克隆到siRNA表达载体pSliencer2．1-U6 neo上;经酶切和测序证明构建成功后,将重组质粒和带FLAG标签的TIN-ag-RP基因共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验siRNA的干扰效果。结果：获得了2个TIN-og-RP基因siRNA真核表达载体,均能有效抑制TIN-ag-RP的表达,其中一条的抑制效率诂90％以上。结论：构肆的TIN-ag-RP某因的siRNA能有效抑制TIN-ag-RP的表达。     

利用RNA干扰抑制细丝蛋白A基因的表达

目的：构建细丝蛋白A（FLNa）基因的小干扰RNA（siRNA）表达载体,并观察其对FLNa基因表达的抑制作用。方法：利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成1条针对FLNa的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer4．1-CMV-hygro中;将重组质粒pSilencer-FLNa、pSilencer-negative（阴性对照）转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检测FLNa的表达;通过潮霉素筛选建立干扰FLNa表达的前列腺癌细胞。结果：PCR鉴定证明构建了FLNa基因RNAi载体;Western印迹表明构建的FLNa基因干扰载体能够有效地抑制FLNa基因的表达;建立了稳定干扰FLNa表达的前列腺癌C4-2细胞。结论：构建了FLNa基因RNAi载体,该载体能够有效地抑制FLNa基因的表达。     

脆性组氨酸三联体基因小干扰RNA的构建及干扰效果检测

目的:构建脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对293T细胞内源性FHIT基因表达的干扰效果。方法:根据FHIT基因序列,通过生物信息学网站预测可能的siRNA,从中筛选出2条合理的FHIT-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer2.1-U6Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建成功的FHIT-siRNA重组载体转染人胚肾细胞293T,Western印迹检测siRNA对293T内源性FHIT表达的干扰效果。结果:构建了2个FHIT-siRNA重组质粒,2条siRNA都有干扰作用,其中一条的作用效果可达50%以上。结论:构建的FHIT-siRNA为进一步研究FHIT的功能提供了有利的工具。     

SUMO-1小干扰RNA的构建及其干扰效果检测

目的:构建小泛素相关修饰物-1(SUMO-1)基因的小干扰RNA(siRNA),并检测其对SUMO-1基因表达的干扰效果。方法:根据SUMO-1基因序列设计一条合理的SUMO-1siRNA,并将其克隆到pSliencer2.1-U6neo载体中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性菌落进行酶切和测序鉴定;将构建的SUMO-1siRNA重组质粒单独转染或与带HA标签的SUMO-1表达载体共同转染人胚肾293T细胞,收集细胞裂解物,以抗HA和SUMO-1的抗体用Western印迹检测siRNA的干扰效果。结果:构建了SUMO-1siRNA重组质粒,干扰效果可达80%以上。结论:构建的SUMO-1siRNA为进一步进行蛋白质SUMO-1化修饰的研究奠定了基础。     

慢病毒siRNA靶向干扰YAP基因胃癌细胞株的建立

目的：构建并鉴定YAP基因短发夹干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,建立稳定干扰YAP基因表达的胃癌细胞株SGC7901。方法：荧光定量PCR检测YAP基因在多种胃癌细胞株中的表达情况。构建重组靶向YAP基因的shRNA慢病毒表达质粒PGC-shRNA-YAP,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞。经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株。荧光定量PCR检测干扰效率。结果：在胃癌细胞株SGC7901中,YAP基因显示高表达。测序验证PGC-shRNA-YAP重组质粒构建成功。将重组质粒稳定转染入胃癌细胞株SGC7901后能明显抑制YAPmRNA表达水平。结论：成功构建了PGC-shRNA-YAP慢病毒重组质粒,建立了靶向稳定干扰YAP基因表达的siRNA胃癌细胞株SGC7901。     

利用RNA干扰抑制p21WAF1/CIP1基因的表达及周期阻滞效应

目的：构建p21WAF1/CIP1基因小干扰RNA（siRNA）的真核表达载体,观察其对p21WAF1/CIP1表达的影响和细胞周期的变化。方法：合成了针对p21WAF1/CIP1基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上,将重组质粒和带FLAG标签的p21WAF1/CIP1共转染293T人胚肾细胞,通过Westernblot检验RNA干扰（RNAi）敲低外源p21WAF1/CIP1的效果;将重组质粒单独转染293T人胚肾细胞,利用p21WAF1/CIP1抗体检测RNAi敲低内源p21WAF1/CIP1的效果;利用流式细胞仪检测敲低后细胞周期的变化。结果：测序证明构建了p21WAF1/CIP1siRNA真核表达载体;Westernblot和流式细胞分析证明,构建的siRNA能有效降低p21WAF1/CIP1基因的表达,并且使G1期细胞数减少14.03%,S期细胞增多13.45%。结论：构建了p21WAF1/CIP1siRNA的真核表达载体,该siRNA能有效抑制p21WAF1/CIP1基因的表达并部分解除了G1期阻滞。     

乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒的构建及鉴定

目的：构建乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒,为探讨HPSE在在肿瘤浸润转移过程中的分子机理奠定基础。方法：乙酰肝素酶cDNA全长扩增和最佳siRNA干扰片段筛选分别采用PCR和Real-time PCR方法,慢病毒系统载体分别使用pWPI和siRNA pSico系统,采用限制性内切酶快速连接方法联接目的基因和最佳最佳siRNA干扰片段,表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,HPSE重组慢病毒表达质粒和siRNA片段细胞转染采用脂质体转染法。结果：成功扩增乙酰肝素酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体HPSE-pWPI,重组质粒测序结果显与HPSE基因的同源性达99%。转染293T后有HPSE基因的表达。筛选出最佳siRNA干扰片段为HPSE-1222并成功插入pSico载体,构建成重组表达载体HPSE-siRNA pSico,重组载体测序显示与构建的shRNA结构序列完全一致。结论：成功采用慢病毒载体系统构建了乙酰肝素酶重组慢病毒转基因和siRNA干扰质粒,为探讨HPSE在在肿瘤浸润转移过程中的分子机理奠定基础。     

核转录因子TR3小干扰RNA载体的构建及其效果鉴定

目的：构建核孤儿受体TR3的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并进行沉默效果测定。方法：根据TR3 mRNA序列和载体psiSTRIKE的粘性末端,设计合成TR3的干扰RNA序列,退火后克隆至psiSTRIKE,经测序鉴定后用阳离子脂质体将重组子和TR3高表达载体TR3-pcDNA共转染至HEK293细胞中,以Western blotting检测干扰后HEK293细胞内TR3表达的变化。结果：Western blotting检测结果证实构建的TR3 siRNA表达重组载体可显著抑制HEK293细胞内TR3的高表达。结论：构建了核孤儿受体TR3 siRNA真核表达载体。     

核磷蛋白NPM1的RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定简

目的：构建高效抑制核磷蛋白NPMl基因的短发夹RNA（shRNA）干扰载体。方法：以人NPM1基因为靶序列,设计并合成shRNA序列,将其连入RNA干扰慢病毒载体p113．7;酶切鉴定插入shRNA序列片段的质粒,经测序正确后转染293T细胞;Western印迹检测得到抑制效果好的载体pll-shRNA,将其-9慢病毒载体共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染HTl080细胞,通过RT-PCR、Western印迹等方法验证其抑制效果。结果：酶切证实构建的载体pll-shRNA中已插入外源基因片段,转染293T细胞后都有抑制效果,其中pll-shRNA2的抑制效果最好;用pll-shRNA2病毒感染HTl080细胞,RT-PCR和Western印迹检测分别在RNA和蛋白质水平证实NPMl的表达显著降低。结论：构建的RNA干扰载体pll-shRNA2能有效抑制NPMl的表达,为NPMl功能的研究提供了有力工具。     

TPP1基因慢病毒干扰载体的构建及鉴定

目的:构建抑制TPP1基因的短发夹RNA(sh RNA)干扰载体。方法:以人的TPP1基因为靶序列,设计并合成sh RNA序列TPP1-si1和TPP1-si2,分别与RNA干扰慢病毒载体pll3.7连接,双酶切鉴定质粒得到阳性克隆pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2,经测序正确后将其与慢病毒包装载体(RRE、REV、VSVG)共转染293T细胞,进行病毒的包装,将得到的病毒感染稳定高表达外源TPP1蛋白的HT1080细胞,通过Western印迹检测其对TPP1蛋白表达的抑制效果,并进行比较;将抑制效果好的病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,检测Pot1蛋白在内源TPP1被敲低的情况下能否在端粒定位。结果:经双酶切验证,外源片段成功插入载体pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2中;pll-TPP1-si1和pll-TPP1-si2均能明显抑制TPP1的表达,其中pll-TPP1-si1的抑制效果最好;pll-TPP1-si1病毒感染高表达外源Pot1蛋白的Hep G2细胞,经免疫荧光鉴定能够有效抑制内源TPP1的表达,使Pot1不再端粒定位。结论:构建的抑制TPP1基因的sh RNA干扰载体能有效抑制TPP1的表达,为端粒蛋白TPP1功能的研究奠定了实验基础。     

肿瘤睾丸抗原CT45-5基因小干扰RNA表达载体的构建及干扰效果鉴定

目的:构建肿瘤睾丸抗原CT45家族中5号成员基因(CT45-5)的小干扰RNA(siRNA),并检测其对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5基因及外源脆性组氨酸三联体(Fhit)基因表达的干扰效果。方法:根据CT45-5基因序列,通过生物信息学方法对靶向CT45-5基因的siRNA进行预测,从中筛选出2对合理的CT45-5-siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 Hygro中,转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆进行测序鉴定;将构建的CT45-5-siRNA重组载体转染人宫颈癌细胞HeLa及HeLa/Fhit细胞,Western印迹检测siRNA对HeLa及HeLa/Fhit细胞内源性CT45-5及外源Fhit基因表达的干扰效果。结果:构建了2个CT45-5-siRNA重组质粒,其中一条对CT45-5基因具有明显的干扰作用,并且Fhit基因表达也被抑制。结论:构建的CT45-5-siRNA为与CT45-5功能相关的基因研究奠定了基础。     

介导大鼠结缔组织生长因子基因沉默的慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

目的：构建介导大鼠结缔组织生长因子（CTGF）基因沉默的慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,为进一步包装慢病毒载体奠定基础。方法：以大鼠CTGF基因为靶基因,根据RNA干扰（RNAi）序列设计原则,设计4对有小发夹结构的RNAi靶点序列,退火形成双链DNA,双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,构建4个含靶基因片段的重组慢病毒载体转移质粒pGCL-CTGF,并对质粒进行PCR及测序鉴定。结果：CTGF的短发夹RNA（shRNA）片段被成功克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中,4个插入序列与设计的靶基因片段完全一致。结论：构建了能够表达4个含CTGF靶基因片段的慢病毒载体转移质粒,为进一步包装介导CTGF基因沉默的慢病毒载体奠定了基础。     

miR-424对雌激素受体α表达的抑制作用

目的:筛选能够抑制在乳腺癌发生中起关键作用的雌激素受体α(ERα)表达的microRNA(miRNA)分子,并在ERα阳性的乳腺癌细胞株中初步检测其生物学功能。方法:在ERα阳性的乳腺癌细胞ZR75-1中转染多种miRNA的表达载体,Western印迹检测ERα的表达水平,找到可以抑制ERα表达的miRNA分子;将该miRNA的表达载体转染ZR75-1后,在雌激素E2的作用下,检测该miRNA分子对细胞生长的影响。结果:经过筛选,得到能够抑制ERα表达的miRNA分子miR-424;生长曲线结果显示,miR-424能够在不依赖于E2的情况下阻抑ZR75-1的生长。结论:该研究为进一步研究miR-424在ERα信号通路中的生物学功能及研究乳腺癌的发生发展机制奠定了基础。     

parp10基因RNA干扰有效靶点的筛选及验证

目的：合成并筛选有效抑制parp10表达的siRNA。方法：根据parp10 cDNA序列,设计并合成prap10基因潜在的RNA干扰（RNAi）片段,将合成的寡核苷酸序列构建到pEGFP-C1H1U6载体中;通过双萤光素酶试验、Western blotting筛选有效的干扰序列;进一步用G418对A549细胞进行耐受度筛选,确定最低耐受度;用G418溶液对转染RNAi重组质粒的A549细胞进行筛选,通过RT-PCR鉴定干扰效果。结果：针对617bp处所构建的RNAi载体能够抑制PARP10的表达,用浓度为400μg/mL G418的McCoy′s 5A培养基筛选转染后的细胞,获得了能够表达绿色荧光标签蛋白的A549细胞株,经RT-PCR检测发现,PARP10表达受到抑制。结论：获得了能够有效抑制PARP10表达的特异性小干扰RNA（siRNA）,为进一步研究其生物学功能提供了条件。