人巨细胞病毒的分子生态学

近来我们不只一次的讨论过分子生态学,特别是病毒的分子生态学问题,并提出了病毒性疾病的发生,主要是由于有关的分子生态失调的论点。但都未涉及病毒微生态学或病毒分子生态学的基本含义。这里,有必要对之加以明确,然后才对人巨细胞病毒的分子生态学     

大蒜中抗人巨细胞病毒成份的筛选

临床试用大蒜制剂预防和治疗人巨细胞病毒感染取得了明显效果。在此基础上我们应用细胞病变(CPE)抑制试验和空斑抑制试验,对大蒜中的抗人巨细胞病毒成份进行了初步筛选和比较,证实新鲜大蒜中存在多种抗该病毒的有效成份,其中至少包括大蒜新素(二丙烯三硫)和Ajoene类似物。     

人巨细胞病毒抗原血症

人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）抗原血症试验是近年来报道的一种早期,快速诊断活动性ＨＣＭＶ感染的新方法。本文就其方法学,敏感性与特异性及实用价值作一综述。     

人巨细胞病毒抗原表位的重组表达及免疫原性分析

目的:用大肠杆菌表达系统表达人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白和gB蛋白的优势抗原表位基因,制成HCMV亚单位疫苗,探究其在Balb/c小鼠体内的体液免疫和细胞免疫活性。方法:选取pp65蛋白的490~508aa和gB蛋白的607~621aa的基因片段,经PCR扩增目的片段,连接表达载体pET-32a(+),转化BL21(DE3)plys菌株,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)分析蛋白质表达,金属螯合亲和镍柱法纯化目的蛋白。重组蛋白免疫Balb/c小鼠,Western blotting法和间接ELISA法检测重组蛋白的体液免疫活性;通过流式细胞仪和双抗夹心ELISA法检测重组蛋白的细胞免疫活性。结果:获得分子质量约为22kDa的融合蛋白,Western blotting检测显示抗体有特异性,间接ELISA法检测其效价为1∶102 400。与对照组相比,实验组小鼠外周血中CD4~+T细胞和CD8~+T细胞的数量,以及IFN-γ、IL-2、IL-12的含量有显著提高(P0.01)。结论:制备的具有免疫优势抗原表位的重组蛋白能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。     

人巨细胞病毒IgG 抗体标准品研究进展

人巨细胞病毒(CMV)是威胁人类健康的最重要病原之一。高CMV抗体效价的免疫球蛋白G(IgG)制剂,为临床医生在预防和治疗用药上提供了一个有价值的选择。而CMV免疫球蛋白标准品对于制品的CMV抗体效价测定以及高效价血浆的筛选都至关重要。该标准品对于器官移植/输血安全测试,以及临床诊断都是不可或缺。本综述提供了一种人巨细胞病毒IgG标准品制剂方法以及目前研究进展的概述。此外,本文还关注应用于不同领域的不同CMV IgG抗体效价单位。故本文为人巨细胞病毒免疫球蛋白的开发,人巨细胞病毒IgG抗体诊断试剂的标准化,以及为其质量控制提供参考。     

人巨细胞病毒疫苗研究进展

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是一类在自然界普遍存在的具有严格种属特异性的病毒,属β疱疹病毒亚科.Zsofia Gyulai等[1]对HCMV感染作了流行病学调查,发现体内抗病毒体液免疫反应主要针对gB;而细胞免疫反应主要针对pp65、pp150.根据HCMV感染的特点和机制,以上述几种结构糖蛋白设计候选基因工程疫苗,已得到了广泛的研究,包括基因工程亚单位疫苗、质粒载体DNA疫苗、病毒载体DNA疫苗、合成蛋白(肽)疫苗,另外还有Towne减毒活疫苗.在国外,有的疫苗已完成Ⅱ期临床试验研究[2].本文现就HCMV疫苗的种类及优缺点、相关佐剂、展望进行综述.     

人巨细胞病毒疫苗研究进展

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus, HC-MV)是一类在自然界普遍存在的具有严格种属特异性的病毒,属β疱疹病毒亚科。Zsofia Gyulai等[1]对HCMV感染作了流行病学调查,发现体内抗病毒体液免疫反应主要针对gB;而细胞免疫反应主要针对pp65、pp150。根据HCMV感染的特点和机制,以上     

人巨细胞病毒gH蛋白表达及其单克隆抗体的制备

人巨细胞病毒(HCMV)是全球范围内普遍感染的一种疱疹病毒,也是引起胎儿先天性畸形和器官移植受者死亡最常见的病原体。有研究表明,gH蛋白是HCMV主要的中和性抗原,特异性抗gH抗体具有中和HCMV及阻断病毒在细胞间传播的潜力。本研究以含人巨细胞病毒临床株Toledo全基因组的细菌人工染色体(BAC)为模板,扩增去除信号肽和跨膜区的gH基因片段,并将其插入表达载体构建pET32a'-gH重组表达质粒,将序列鉴定正确的重组质粒转化进入表达菌株TransB,诱导重组蛋白表达。用纯化的重组gH蛋白免疫8周龄BALB/c雄鼠,经杂交瘤技术获得5株稳定分泌抗gH单克隆抗体的细胞株,分别命名为8A9、8B4、8C4、8D9、8D12。所获5株单克隆抗体对gH蛋白均具有良好的反应性,其中8A9、8B4、8D9和8D12具有一定的病毒捕获能力,且8D9和8D12的捕获能力较强。本研究获得了具有自主知识产权的抗gH单克隆抗体,抗体具有良好的病毒捕获能力。在此基础上,我们将进一步鉴定其是否为中和抗体,为今后开发治疗HCMV感染的中和抗体奠定基础。     

人巨细胞病毒的多聚酶链反应研究进展

人巨细胞病毒是疱疹病毒科的一个成员，在全世界呈广泛分布，现在发现该病毒不只在新生儿，免疫抑制及免疫缺陷患者中导致广泛的临床症状甚至死亡，而且与人类三大疾病－－心血管疾病，恶性肿瘤及糖尿病有关，因此在当前人类疾病防治中ＣＭＶ感染的研究成为一个热门课题。本文就病毒感染的多聚酶链反应诊断方法的研究进展作一介绍。     

重组人巨细胞病毒嵌合肽基因在毕赤酵母中的克隆和表达

为了在毕赤酵母中表达带有组氨酸纯化标记的重组人巨细胞病毒嵌合肽(rHCMVp),根据 其基因序列,设计引物从pPIC9K2rHCMVp 上扩增得到目的基因片段,并导入毕赤酵母诱导型表达 载体pPICZαA 中。通过电击将线性化的重组质粒转化到毕赤酵母X33 细胞中,筛选获得表达量 较高的重组菌株,研究了该菌株生长的培养条件,包括不同诱导时间、甲醇浓度、pH 值对人巨细 胞病毒嵌合肽表达的影响。2L 发酵罐进行了高密度发酵,经1 %的甲醇、pH610 的条件下诱导 48h,最终菌体密度OD600达到180,每升发酵液中含目的蛋白7817mg,产量比摇瓶提高了418 倍。 rHCMVp 可通过高密度发酵大量获得。     

Effect of Inducible Expressed Human Cytomegalovirus Immediate Early 86 Protein on Cell Apoptosis

Human cytomegalovirus is a common human pathogen that can cause life-threatening disease under certain conditions. During infection of host cells, the virus expresses regulatory proteins such as IE72 and IE86 that are important for viral propagation. IE86 plays a critical role in the modulation of viral replication as well as host cell cycle control and apoptosis. In this study, a Tet-On system was used to quantify the effect of IE86 on apoptosis and p53 expression. Our results indicate that IE86 inhibits tumor necrosis factor (TNF)-α induced apoptosis and that the anti-apoptotic activity of this viral protein correlates with its expression levels. In addition, IE86 did not alter the mRNA level of p53. The system developed should provide a method for functional analysis of human cytomegalovirus (HCMV) IE86 protein.     

应用噬菌体展示技术筛选人巨细胞病毒糖蛋白M新的中和抗原表位

人巨细胞病毒(HCMV)糖蛋白复合物Ⅱ包括两种蛋白,即糖蛋白M(gM)和糖蛋白N(gN)．尽管来自于HCMV阳性病人血清中的糖蛋白复合物Ⅱ的IgG抗体能够中和HCMV粒子,但迄今为止,还没有gM中和性抗原表位的相关研究．应用消减杂交技术,通过噬菌体肽库筛选获得gM抗原的一个表位,即MAD．MAD氨基酸序列与gM第32～38位序列高度同源．将MAD与钥孔血蓝蛋白偶联免疫小鼠可产生抗MAD多抗,该多抗不仅结合天然HCMV病毒粒子,而且特异结合重组表达的gM30～78多肽．ELISA结果表明MAD能够特异结合HCMV阳性的病人血清．病毒中和实验结果进一步证明抗MAD多抗能够抑制HCMV AD169株病毒感染人胚肺细胞．总之,MAD表位有可能成为HCMV病毒疫苗潜在的保护性抗原.     

重组人红细胞生成素二聚体不同真核表达载体的构建及表达

为构建重组人红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)二聚体真核表达载体,应用PCR方法扩增EPO cDNA,PCR产物克隆入T载体后,经酶切、连接、转化等过程分别构建了3个EPO二聚体的真核表达载体pBT-1c、pBT-2s及pBT-3c,经测序序列完全正确。然后将3个真核表达载体分别转染于CCS-7细胞及CHO-dhfr-细胞中,用ELISA方法检测,它们在COS-7的瞬时表达量分别为4IU／ml、11.5IU／ml和7.2IU／ml。其中EPO二聚体真核表达载体pBTsv稳定转染CHO-dhfr-细胞后,用氨甲喋呤(MTX)逐渐加压的方法筛选到阳性克隆,表达量可达到4000IU／106cells／72h。     

人巨细胞病毒M抗原表位保守氨基酸突变的分析

为确定人巨细胞病毒M抗原表位MAD的关键氨基酸残基, 以MAD多肽序列为基础, 分别将保守氨基酸残基单一突变为甘氨酸残基, 构建各自突变体, 然后与人源Fc的N端融合, 通过原核表达载体pET32-Fc表达融合蛋白MAD-Fc, 经protein A柱亲和纯化得到各突变体纯品。通过ELISA及Western blotting方法验证各突变体特异结合羊抗HCMV多抗间的差异, 从而确定表位关键氨基酸残基。结果显示, 将MAD中的谷氨酰胺残基单突变为甘氨酸残基后, MADQ-G结合羊抗HCMV多抗活性大大降低, 差异显著; 而其他氨基酸残基单突变时, 对MAD活性影响程度很小。由此得出结论: MAD结合羊抗HCMV多抗的活性与谷氨酰胺残基有关。     

巨细胞病毒早期抗原pp65和晚期抗原pp67-mRNA在移植术后活动性巨细胞病毒感染诊断中的价值

目的：通过对器官移植术后受者外周血中巨细胞病毒（CMV）早期抗原pp65和晚期抗原pp67-mRNA的监测,评价其对于诊断器官移植术后CMV感染、发病及预后的价值,为临床准确有效地分析理解检测结果提供依据。方法：收集28例器官移植受者EDTA抗凝外周血标本共120份,用免疫荧光技术（IFA）检测其中CMV早期抗原pp65;用核酸基础序列扩增法（NASBA）测定晚期CMVpp67-mRNA,绘制2组用于诊断CMV的受试者特征曲线（ROC曲线）,比较2组曲线下面积。结果1120份样本中,42份为CMVpp65阳性（≥1个阳性细胞／2×105白细胞）,23份为CMVpp67-mRNA阳性。28例器官移植受者中,9例CMVpp65和pp67-mRNA均为阳性（其中3例pp65和pp67-mRNA在同一时间为阳性）,8例pp65为阳性而pp67-mRNA为阴性,2例pp65为阴性而pp67-mRNA为阳性。临床诊断感染CMV的患者4例,在感染早期无临床症状病毒潜伏期间,受试者工作特征（ROC）曲线下面积（AUC）pp65为0．9542,pp67-mRNA为0．6611,即pp65检测的灵敏度和特异性高于pp67-mRNA;而在出现临床症状并治疗后期,pp65的AUC为0．8300,pp67-mRNA为0．9232,pp67-mRNA的灵敏度和特异性高于pp65。根据ROC曲线查得,以每2x105白细胞中有10个阳性细胞为诊断CMV活动性感染的最佳临界值。结论：AUC结果表明,pp65、pp67-mRNA均具有诊断意义。pp65检测更适于早期CMV活动性诊断,对于提示临床开始抗病毒治疗具有早期快速的意义;pp67-mRNA检测快速、结果准确,可作为结束抗病毒治疗的参考指标;两者联合检测用于监测CMV,对于辅助临床诊断有很好的价值。     

人Sef基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

构建人Sef-L和Sef-S基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 为研究Sef的功能和作用机制以及Sef的基因治疗奠定基础。通过PCR方法以hSef的表达质粒为模板扩增得到hSef的编码序列, 亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中, 经测序验证之后, 将穿梭载体使用Pme I酶切线性化, 然后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183, 得到重组的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒, 最后将Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒使用Pac I线性化, 转染到HEK293细胞中, 包装收获病毒颗粒, 免疫印迹实验鉴定表达, 荧光素酶报告实验验证其功能。成功构建了人Sef基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 获得了有功能的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S病毒重组子。     

人Sef基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

构建人Sef-L和Sef-S基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 为研究Sef的功能和作用机制以及Sef的基因治疗奠定基础。通过PCR方法以hSef的表达质粒为模板扩增得到hSef的编码序列, 亚克隆到穿梭载体pAdTrack-CMV中, 经测序验证之后, 将穿梭载体使用Pme I酶切线性化, 然后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183, 得到重组的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒, 最后将Ad-hSef-L和Ad-hSef-S质粒使用Pac I线性化, 转染到HEK293细胞中, 包装收获病毒颗粒, 免疫印迹实验鉴定表达, 荧光素酶报告实验验证其功能。成功构建了人Sef基因的复制缺陷型重组腺病毒表达载体, 获得了有功能的Ad-hSef-L和Ad-hSef-S病毒重组子。     

HCMV感染抑制人海马神经干细胞分化

研究HCMV感染对体外培养的人海马源性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影响。体外分离、培养人海马NSCs,应用免疫荧光方法检测其NSCs标记物-巢蛋白(Nestin)的表达。10%胎牛血清诱导NSCs贴壁分化,同时用MOI为5的HCMV AD169株感染NSCs,7d后使用激光共聚焦显微镜免疫荧光方法检测Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和HCMV即刻早期蛋白(IE)的表达,计算阳性细胞比率。本实验所培养的细胞(4～6代)95±8%表达Nestin;分化诱导7d后,感染组86±12%细胞表达IE,未感染组和感染组Nestin阳性率分别为50±19%和93±10%(t=6.03,P<0.01),GFAP阳性细胞率分别为81±11%和55±17%(t=3.77,P<0.01)。以上结果表明分化过程中的NSCs是HCMV的容许细胞;HCMV感染可以抑制NSCs的分化。     

人巨细胞病毒pp150蛋白片段与MDBP蛋白片段的融合表达及初步应用

人巨细胞病毒(HCMV)感染是临床上常见的一种病毒性传播疾病,正常人群常无明显的临床症状,而对器官移植患者、免疫力低下及孕妇等人可产生严重的危害。以HCMVAD169病毒株基因为模板,经PCR扩增了编码pp150蛋白片段的UL32基因和编码MDBP蛋白片段的UL57基因,目的基因转化入pMD18-T克隆载体后再经酶切与表达载体pET-11a连接构建出融合基因表达载体,然后转入大肠杆菌BL21,重组大肠杆菌经诱导表达融合蛋白pp150/MDBP。经SDS-PAGE分析,其相对分子量约为27kD,表达量约占菌体蛋白的17.45%,Westernblot鉴定为阳性,ELISA及蛋白芯片检测表明融合蛋白具有良好的抗原性,经过初步应用表明其对血清IgG及IgM的检出率与全抗原相比一致,具有进一步开发应用的价值。