6A型肺炎球菌结合物分子大小对小鼠免疫原性的影响

目的 比较不同分子大小的6A型肺炎球菌(serotype 6A Streptococcus Pneumoniae )结合物和佐剂吸附在小鼠体内免疫原性的影响。方法 通过乙酸水解降低6A型荚膜多糖的相对分子质量制备成水解物,水解物经1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物TT AH 结合,制备成结合物。用Sepharose 4 Fast Flow 纯化结合物,并根据化学检测结果将结合物分为 K D 0.0~0.2、 K D 0.2~0.4、 K D 0.4~0.6等3个组分,每个组分分别以磷酸铝佐剂吸附,将吸附前后的各个组分按照每针次每只小鼠0.2 μg分别免疫小鼠,并采用ELISA检测结合物在小鼠体内的抗体水平。结果 3种不同相对分子质量吸附前后的结合物在小鼠体内均能产生较高水平的抗体,各组2、3针之间具有明显的加强效应。在吸附组和未吸附组中,3种不同分子大小的结合物在小鼠体内产生抗体水平无明显差异。各组分佐剂吸附后的结合物血清抗体滴度高于未吸附组,但这种差异无统计学意义( P > 0.05)。结论 结合物的分子大小对小鼠体内抗体水平的产生没有明显影响;磷酸铝佐剂吸附对于不同分子大小的结合物在小鼠体内的免疫原性有一定的增强效应,但这种增强效应差异无统计学意义。     

百日咳鲍特菌脂寡糖的制备及寡糖结合物在小鼠体内免疫原性研究

目的提取纯化百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制备百日咳杆菌多糖蛋白结合物,并分析其理化性质及免疫原性。方法通过改良热酚水法提取百日咳杆菌的LOS,采用酶解法纯化LOS,通过1%冰醋酸水解获得寡糖(oligosaccharides,OS),产物经Tricine-SDS-PAGE及核磁共振氢谱(~1H NMR)鉴定。OS的羟基经1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸酯(1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化后,与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TT_(AH))共价结合,制备多糖蛋白结合物,经Sephacryl S-300层析柱纯化后收集结合物原液,并对结合物的理化性质、抗原性进行分析,采用两种剂量(2.5μg/剂和5.0μg/剂)免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性。结果纯化后LOS纯度90%,核磁共振结果表明OS结构正确,功能基团得到保留。制备的结合物抗原性未发生改变,经3针免疫后,两种剂量下结合物均有剂次加强效应(P0.05),且两者差异无统计学意义(P0.05)。结论将百日咳杆菌OS与TT_(AH)结合是制备百日咳杆菌多糖蛋白结合疫苗的可行途径,并且结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。     

A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗的制备及其免疫原性研究

采用溴化氰(CNBr)活化多糖,以无水己二酸二肼(ADH)作为连接剂,1乙基13(3二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDAC)为偶联剂制备A群奈瑟氏脑膜炎球菌荚膜多糖(GAMP)与破伤风类毒素(TT)的结合物,经皮下免疫NIH小鼠,用ELISA检测小鼠血清中抗GAMP及抗载体蛋白的IgG抗体水平。用补体介导的体外杀菌试验检测血清中GAMP抗体的杀菌活性。结果显示,实验中制备的多糖衍生物和多糖蛋白质结合物都具有GAMP抗原特异活性。结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GAMP血清IgG抗体,并能形成免疫记忆,产生再次应答。结合物免疫小鼠所诱生的血清GAMP抗体较之多糖组具有更强的体外杀菌活性。表明此方法制备的结合物可获得优于多糖的、稳定的特异免疫原性。     

C群脑膜炎球菌结合物小鼠免疫原性的研究

目的比较C群脑膜炎球菌多糖蛋白质结合物(简称结合物)的相对分子质量大小和免疫剂量对其在小鼠体内免疫原性的影响,为结合物的分子大小的质控和结合疫苗成品免疫剂量的选择提供实验依据。方法利用CDAP活化法制备C群脑膜炎球菌结合物,通过硫酸铵盐析进行纯化,然后利用Sepharose CL-4B凝胶过滤层析分析,并根据化学检测结果将结合物分为KD0-0.2(组分1)、KD0.2-0.4(组分2)、KD0.4-0.7(组分3)等3个不同相对分子质量组分,每份分别采用1.0μg、0.2μg的免疫剂量免疫小鼠,并对血清进行ELISA分析。结果采用1.0μg免疫剂量时,3种不同相对分子质量的C群脑膜炎球菌结合物均能产生较高水平的抗体,具有典型的加强效应,第2剂免疫即可产生高水平的抗体,而第2、3剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义;采用0.2μg免疫剂量时,三种不同相对分子质量的C群脑膜炎球菌结合物只有在第3剂免疫后才能产生较高水平抗体,第1、2剂免疫后的抗体水平差异无统计学意义,组分1和组分2在第3剂免疫后产生的抗体水平优于组分3;对于相同相对分子质量结合物,用1.0μg免疫小鼠产生的抗体水平优于0.2μg免疫组,而且有显著的统计学意义。结论高剂量时,多糖相对分子质量大小对C群脑膜炎球菌结合物的免疫原性没有显著性影响;低剂量时,小相对分子质量结合物对其免疫原性有影响。同等相对分子质量时,1.0μg比0.2μg的免疫剂量可以激发更高的抗体水平。     

铜绿假单胞菌6型O-特异性多糖与破伤风类毒素结合物免疫原性研究

目的研制有效防治铜绿假单胞菌感染的疫苗。方法用热酚水法提取铜绿假单胞菌6型(IATS 6)菌株的脂多糖(LPS),去除类脂A并纯化O-特异性多糖(O-SP),用CDAP活化O-SP,己二酸二肼作连接臂,在EDAC作用下,与破伤风类毒素结合制备出O-SP-TT结合物并对该结合物进行小鼠免疫原性试验和免疫保护性试验。结果制备的结合物在小鼠免疫原性试验中,产生了高效价的IgG抗体,与O-SP试验组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);免疫保护性试验表明,结合物免疫小鼠能很好的保护5～10 LD50活菌的腹腔攻击。结论该结合物有望成为防治IATS 6型铜绿假单胞菌感染的有效疫苗。     

不同功能基团对3型肺炎球菌荚膜多糖免疫原性影响的初步研究

目的比较3型肺炎链球菌荚膜多糖不同基团活化对多糖抗原性及结合物免疫原性的影响。方法分别采用1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸(1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate, CDAP)活化多糖羟基,碳二亚胺(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)活化多糖羧基,再与己二酰肼(adipic dihydrazide, ADH)偶联获得活化度相近的多糖衍生物。用三硝基苯磺酸方法(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)测定多糖活化度;高效液相分子排阻与多角度激光散射仪联用(HPLC-SEC-MALLS)分析衍生物分子分布和大小;Zeta电位仪与滴定仪联用分析其表面电荷变化;速率比浊法和免疫双扩散法比较其抗原性变化;利用多糖衍生物与载体蛋白偶联获得的不同结合物免疫小鼠,间接ELISA分析不同结合物免疫后的IgG抗体浓度,进一步阐述活化过程中多糖抗原性的变化对结合物免疫原性的影响。结果 TNBS结果显示,获得同一基团不同活化度(5%～30%)、不同基团(羟基和羧基)活化度相近的多糖衍生物;等电点分析结果显示,不同基团的活化会导致多糖表面不同的电荷变化;而速率比浊和免疫双扩散的结果显示,多糖羟基的活化会导致多糖抗原性略有下降,但不同活化度之间差异较小;在相似活化度情况下,羧基衍化物的抗原性更低,随着羧基活化度的增加,多糖抗原性下降明显(约60%)。小鼠ELISA结果显示,对羧基不同程度活化得到的结合物,其免疫原性较多糖明显提高,差异具有统计学意义(P<0.05);随着多糖羧基活化度的增加,结合物免疫原性先增加后降低。结论 3型多糖重复单位上的羧基的改变对抗原性影响较羟基更大,对羧基的过度活化会影响结合物的免疫原性。     

伤寒Vi-rEPA结合疫苗在小鼠中的免疫原性研究

以伤寒Vi多糖疫苗及结合物含量分别为20％、40％、60％的伤寒Vi-rEPA结合疫苗经皮下免疫小鼠后眼眶采血分离血清,用ELISA法测血清抗体浓度。血清抗体分析表明,伤寒Vi多糖疫苗和伤寒Vi-rEPA结合疫苗均有良好的免疫原性,但伤寒Vi-rEPA结合疫苗的免疫原性优于伤寒Vi多糖疫苗;伤寒Vi多糖疫苗无加强免疫应答效应,而伤寒Vi-rEPA结合疫苗有加强免疫应答效应;不同高分子结合物含量的伤寒Vi-rEPA结合疫苗免疫小鼠,其结合物含量为40％、60％的伤寒Vi-rEPA结合疫苗比结合物含量为20％的结合疫苗具有更好的免疫原性,而前二者的免疫原性无显著性差异。     

不同剂量肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白结合物的免疫原性比较

用肺炎链球菌19F型、23F型的荚膜多糖(C-PS)分别和破伤风类毒素(TT)蛋白结合,制备了两个型别的多糖-蛋白结合物(19F-TT,23F-TT)。为探讨结合物的最适免疫剂量,以10μg多糖和含1μg、3μg、9μg、27μg多糖的结合物经腹腔免疫NIH小鼠,ELISA方法检测小鼠血清中多糖和含不同多糖的结合物所产生的特异性IgG抗体。结果在不同的剂量免疫小鼠后,3μg剂量组在免疫三针后可诱生高浓度的抗体,但随着免疫剂量的增加,9μg与27μg诱生的抗体浓度较3μg诱生的抗体浓度之间并无显著性差异。含多糖3μg的19F型和23F型多糖蛋白结合物剂量组可诱生高浓度的特异性IgG抗体。     

肺炎链球菌18C型糖蛋白结合物的制备及其免疫原性

制备肺炎链球菌18C型荚膜多糖－破伤风类毒素结合物（CPS－TT）,测定结合物的理化性质,抗原特异性及其在动物中的免疫原性。结果显示,结合物能与相应的多糖和破伤风抗血清形成明显的沉淀线,蛋白／多糖比率为1．86,结合物分子大小（Kd值）为0．058。注射小鼠后可诱导明显的抗体应答,而且随着注射针次的增加,抗体反应水平明显增高,显示加强效应。结果表明,制备的肺炎链球菌糖蛋白结合物抗原性良好,具有胸腺依赖性的特性,在小鼠中显示较好的免疫原性。     

C群脑膜炎球菌多糖-rP64K结合物的制备及免疫原性

用1-氰基-4-二甲基氨基吡啶·四氟化硼(CDAP)活化C群脑膜炎球菌多糖(GCMP),以己二酰肼(ADH)作为连接子,与重组B群脑膜炎球菌外膜蛋白64 KD(rP64K)在碳二亚胺的(EDAC)作用下结合,制备GCMP-P64K结合物。纯化后免疫NIH小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗GCMPIgG抗体水平,并GCMP-TT结合物比较载体诱导的免疫抑制。所制备多糖-蛋白结合物(GCMP-P64K)保持了GCMP抗原特异活性,结合物免疫小鼠后可诱生比多糖单独免疫更高水平的GCMP血清IgG抗体,并能形成免疫记忆,为研究理想载体蛋白提供了新的思路。